氨基酸分析儀測定蜂蜜氨基酸組成的研究

蟻碧珍 王錦源

摘 要：本文采用鹽酸水解法處理蜂蜜樣品，通過日立L-8900氨基酸分析儀分析6種不同品種蜂蜜的16種氨基酸。結果顯示：6種蜂蜜的總氨基酸含量在0.106 7～0.194 9 g/100 g，氨基酸組成基本一致，通過本方法檢測蜂蜜中氨基酸的含量，并可用于初步判斷蜂蜜中是否添加非蛋白成分。因此，氨基酸含量和氨基酸比值可為建立系統的氨基酸監測技術體系提供理論依據。

關鍵詞：蜂蜜;氨基酸;氨基酸分析儀

Abstract：Hydrochloric acid hydrolysis method was used to treat honey samples. Sixteen kinds of amino acids of six different varieties of honey were analyzed by Hitachi L-8900 amino acid analyzer. The results showed that the total amino acid content of six kinds of honey ranged from 0.106 7 to 0.194 9 g/100 g， and the amino acid composition was basically the same. The method of amino acid composition could be used to identify honey. Therefore， the content and ratio of amino acids can provide theoretical basis for the establishment of a systematic monitoring system of amino acids.

Key words：Honey; Amino acid; Automatic amino acid analyzer

中圖分類號：S896.1

蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，經自然發酵而成的黃白色黏稠液體，被譽為“大自然中最完美的原料與營養食品”[1]。蜂蜜富含糖類、蛋白質、氨基酸、維生素和微量元素等營養物質[2]，具有美容養顏、通便等生理功能。蜂蜜因其高營養價值與生理功能，越來越受到消費者的追捧，近年來，許多不良商家為了降低蜂蜜的成本，增加利潤，蜂蜜摻假現象越發嚴重。因此，有必要建立有效的手段對蜂蜜品質進行監控。蜂蜜中蛋白質和氨基酸含量與其營養功能密切相關[3]。由于氨基酸是組成蛋白的基本單位，相同類型的物質蛋白和氨基酸具有相似性，通過檢測蜂蜜中的氨基酸，分析其中的規律并建立質控方法。本文采用氨基酸自動分析儀設備測定不同產地蜂蜜中的氨基酸組成，該方法具有操作簡單、靈敏度高、專一性強、可適用性強等特點[4-7]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

儀器：日立牌L-8900型號氨基酸自動分析儀、HHS-2型號電熱恒溫水浴鍋、電熱恒溫干燥烘箱、AG204電子天平等。

試劑：濃鹽酸、茚三酮、苯酚等，均為分析純。

1.2 色譜條件

進樣量20 μL，每個樣品分析時間約55 min。色譜柱規格：4.6×60 mm;填料：3 μm磺酸型陽離子樹脂分離柱;泵1流速：0.40 mL·min-1;泵2流速：0.35 mL·min-1;檢測器溫度：135 ℃;柱溫：57 ℃;檢測波長：第一通道570 nm，第二通道440 nm。

1.3 實驗方法

1.3.1 樣品前處理

準確稱取0.5 g（精確至0.000 1 g）的蜂蜜樣品于水解管中，加入6 mol·L-1的鹽酸10～15 mL，加入3～4滴新蒸餾苯酚，然后將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5 min，接著抽真空。將水解管接到真空泵的抽氣管上，抽真空（接近0 Pa），并充入高純氮氣;再抽真空然后充氮氣，重復3次后，需在充氮氣狀態下封口，將已封口的水解管放在（110±1）℃的恒溫干燥箱內，水解22 h后，取出冷卻。

打開水解管，然后將水解液過濾后，水解管用去離子水多次沖洗，將水解液全部轉移到50 mL容量瓶內，并用去離子水定容。吸取濾液2 mL于50 mL燒杯中，（標明溫度）水浴蒸干，殘留物用1～2 mL水溶解，再干燥，反復進行兩次。最后通過混勻壓濾10 mL pH為2.2的緩沖液溶解，以供儀器測定用。

1.3.2 成分定量分析

制備上機測定用的氨基酸標準液：準確吸取0.160 mL的混合氨基酸標準，然后用pH2.2的緩沖液稀釋到5 mL，該標準稀釋液濃度為1.6 nmol/20 μL。以外標法通過氨基酸自動分析儀測定試樣溶液的氨基酸含量。

2 結果與分析

2.1 標準曲線的繪制

精確吸取天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、賴氨酸（Lys）、L-胱氨酸（L-Cystine）和L-絲氨酸（L-Cystine）18種氨基酸混合標準溶液（2.5 μmol·mL-1）160 μL加到5 mL的容量瓶中，再用0.02 mol·L-1鹽酸溶液進行定容至刻度，運用氨基酸分析儀進行檢測分析，用測出的峰面積以及濃度繪制標準曲線，得到的線性回歸方程。其中16種氨基酸相關系數R2均為1.000 0。儀器噪音水平為224.3，其最低檢出限為0.70 pmol，見表1。

2.2 儀器精密度

由表2可知，將氨基酸標準溶液配制成1.6 nmol/20 μL，然后連續進樣6次，16種氨基酸含量的相對標準偏差在0.12%～1.15%，表明精密度良好，結果是符合該儀器要求。

2.3 試驗方法的精密度

取適量的檢測蜂蜜樣品，按照1.3的方法處理，分別測定不同蜂蜜樣品的氨基酸含量，結果見表3。蜂蜜中氨基酸的平均回收率在91.0%～95.3%，RSD在0.00%～1.07%，均在允許范圍內，結果較好。

2.4 蜂蜜中氨基酸成分分析

對蜂蜜樣品進行酸水解，通過氨基酸分析儀對天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、精氨酸（Arg）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）和賴氨酸（Lys）16種氨基酸進行測定，并算出總氨基酸含量。圖中脯氨酸用VIS2（440 nm）來檢測，除脯氨酸以外的其他氨基酸用VIS1（570 nm）來檢測（見圖1和圖2）。

由圖1可以看出，氨基酸分析儀在32 min內能夠將混標中的16種氨基酸很好地分離。由圖2可以看出，蜂蜜待測液通過鹽酸水解后幾乎沒有雜質干擾，各種氨基酸的分離效果良好，各氨基酸的峰形良好，且出峰時間與峰形和標準品比較一致。這說明蜂蜜中各種氨基酸含量可以通過本法較準確地獲得。對鹽酸水解后的6個蜂蜜樣品通過利用氨基酸分析儀進行測定，并對檢測結果進行分析，蜂蜜的氨基酸總含量在0.106 7～0.194 9 g/100 g，其中，苯丙氨酸的含量最高，為0.010 6～0.048 g/100 g;組氨酸的含量最低，為0.001 3～0.002 9 g/100 g;其他氨基酸的含量范圍為0.001 8～0.029 5 g/100 g，見表4。

3 結論

6種蜂蜜的總氨基酸含量在0.106 7～0.194 9 g/100 g，可以通過本方法檢測蜂蜜中氨基酸的含量，并可用于初步判斷蜂蜜中是否添加非蛋白成分。由于正常蜂蜜中的氨基酸組成相對穩定，蜂蜜中各氨基酸的比值可以作為判斷蜂蜜是否摻假的依據。

參考文獻：

[1]陳盛祿.中國蜜蜂學[M].北京：中國農業出版社，2002.

[2]李欽龍.不同蜂蜜中蛋白質的差異性研究[D].福州：福建農林大學，2012.

[3]Won S，Lee D，Ko S H，et al.Honey major protein characterization and its application to adulteration detection[J].Food Research International，2008，41（10）：952-956.

[4]林潔茹，周華，賴小平.蜂蜜研究概述[J].中藥材，2006，29（1）：85-90.

[5]朱春紅，雍韋，徐厲，等.蜂蜜真假鑒定技術研究[J].中國食品衛生雜志，2007，19（3）：206-208.

[6]馮志強，許銀葉，黃永連，等.氨基酸自動分析儀測定膠原蛋白保健品中羥脯氨酸的含量[J].食品工業，2014，35（5）：248-250.

[7]林丹，莊俊鈺，黃永連，等.白蜂蜜的氨基酸指紋圖譜構建及識別研究[J].食品工業，2014，36（7）：269-272.