高效溶藻菌—微桿菌菌劑制備工藝響應面分析法優化研究

周健飛 申曉霞 徐瑾 郭惠娟 王美娟 張文藝

摘? ? 要：為了彌補溶藻液體菌劑穩定性低、不易運輸以及保存時間短等缺陷，利用本研究從太湖土著花錮魚內臟中篩選出的1株編號為GHJ的具有高效溶藻的微桿菌（Microbacterium oleivorans SP.），以小麥粉作為載體，蔗糖、谷氨酸鈉、脫脂乳粉、甘油作低溫保護劑，采用真空冷凍干燥法制備溶藻菌GHJ干粉菌劑，借助響應面法優化不同保護劑組成條件下菌劑的制備參數，考察了各因素及其交互作用對干粉菌劑活菌率的影響，并對冷凍干燥的干粉菌劑中保護劑不同成份對菌體保護作用的機理進行分析。結果表明，該模型預測的溶藻菌GHJ干粉菌劑的活菌率最高為189.26% ，最佳復合保護劑配比為10%蔗糖∶10%甘油∶4%脫脂乳粉∶8%谷氨酸鈉=1∶1∶0∶1，其機制是通過甘油維持細胞結構，蔗糖降低細胞機械損傷程度，谷氨酸鈉修復受損細胞，三者共同作用實現對菌體的保護。本研究對于溶藻菌干粉菌劑制備及商品化開發有一定的理論和應用參考價值。

關鍵詞：真空冷凍干燥; 干粉菌劑; 保護劑; 響應面; 活菌率

中圖分類號：X172? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2020.09.002

Abstract：In order to make up the defects such as low stability， poor transportation， and short preservation time of algicidal bacteria liquid agent， a strain of Microbacterium oleivorans SP.（GHJ） with high-efficiency algicidal rate was isolated from the viscera of indigenous fish in Taihu Lake by our research group. With wheat flour as the carrier， sucrose， sodium glutamate， skim milk powder and glycerol as the protective agents， algicidal bacteria GHJ dry powder was prepared by vacuum freeze- drying method. With the aid of response suface method （RSM）， the preparation parameters of different protective agents were optimized， and the effects of various factors and their interactions on the living bacteria rate of dry powder agents was investigated. Besides， the mechanism of different components of protective agents in the freeze-drying powder to protect bacteria was also analyzed. The results showed that the living bacteria rate of GHJ dry powder agent predicted by this model was 189.26%， and the best compound protective agent ratio was 10%sucrose∶10%glycerol∶4%skim milk powder∶8% sodium glutamate=1∶1∶0∶1. The mechanism was that glycerol maintained cell structure， sucrose reduced the degree of cellular mechanical damage， and sodium glutamate repaired the damaged cells. The three work together to achieve the protection of bacteria. This study has certain theoretical and practical reference value for the preparation and commercial development of algicidal dry powder agents.

Key words： vacuum freeze-drying; dry powder agent; protective agents; response surface methodology; living bacteria rate

針對太湖、巢湖等湖泊水體富營養化的問題，在原生態微生物處理體系中，加入具有高效溶藻功能的微生物，增強其對水體的控藻能力，從而達到改善水體環境質量的目的[1-4]。液體菌劑存在性能不穩定與運輸不便的弊端，因此，研制合適的劑型是將試驗室篩出的高效溶藻效果的溶藻菌投入市場運用的最好途徑之一，但在目前看來，合適的菌劑成為富營養化水體生物處理技術發展的“瓶頸”[5-9]，篩選出高效溶藻并在菌劑制備過程中保證菌株有較高存活率是當前亟待解決的問題[10-12]。

保護劑可降低菌劑制備過程中細菌細胞的損傷，保證細菌的活性，因此優化保護劑配比對干粉菌劑生物量起著至關重要的作用[10， 13]。菌劑保護劑的研究大多采用單因素試驗與正交試驗，忽略了不同種類保護劑之間的交互作用，進而限制了干粉菌劑生物量提高的途徑，而響應面法已廣泛應用于各種生物過程的優化實踐[14]，可利用較少的試驗次數對影響因素及其交互作用進行評價，縮短優化周期，快速接近優化點，從而確定最優條件[15-16]。

本研究前期已從太湖土著花錮魚內臟中篩選出了1株具有高效溶藻作用的微桿菌（Microbacterium oleivorans SP.），本試驗以小麥粉作為載體，蔗糖、谷氨酸鈉、脫脂乳粉、甘油作低溫保護劑，基于Design-Expert軟件使用響應面法對已經得到的各種保護劑的最優濃度進行復合，科學預測溶藻菌干粉菌劑復合保護劑的最佳配比，為開發適宜的溶藻干粉菌劑提供數據支撐。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種 試驗所用微桿菌（Microbacterium oleivorans SP.）是前期從太湖自然繁殖的花鲴魚內臟（肝、腸等）篩選得到，編號為GHJ，于4 ℃冰箱中保存[17]。

1.1.2 主要儀器和試劑 （1）主要儀器：搖床、離心機、培養箱、高壓蒸汽滅菌鍋、倒置顯微鏡、島津紫外分光光度計UV-1800等; （2）試劑：蔗糖、甘油、脫脂乳粉、谷氨酸鈉、牛肉膏、魚粉蛋白胨、瓊脂粉、NaCl等試劑均是分析純或生化純試劑。

1.1.3 培養基 細菌培養采用牛肉膏蛋白胨培養基。

1.2 方 法

1.2.1 溶藻干粉菌劑制備 為了控制試驗過程中的單一變量，選取小麥粉作載體，蔗糖、甘油、脫脂乳粉、谷氨酸鈉作為菌劑低溫冷凍干燥保護劑，在前期研究中已確定4保護劑菌劑濃度分別在10%，10%，4%，8%時，菌劑的活菌率最高。挑取一接種環的溶藻菌GHJ接種在牛肉膏蛋白胨培養基中活化，取100 mL經20 h發酵的溶藻菌GHJ種子液加入5 g載體、5 mL保護劑共105 mL制成液體菌劑，于120 r·min-1、25 ℃條件下振蕩培養18 h，將液體菌劑在

-4 ℃的條件下預凍2～3 h，再放入真空冷凍干燥機中在-40～-30 ℃進行冷凍干燥，約48 h后成粉末狀態，制成溶藻干粉菌劑。

1.2.2 活菌率的測定 在冷凍干燥前取1 mL液體菌劑，利用無菌水進行梯度稀釋、平板涂布計數，記錄菌劑冷凍干燥前的菌體數量，菌落計數單位為CFU·mL-1。冷凍干燥后將所得溶藻干粉菌劑全部溶于適量1 mol·L-1的磷酸鹽緩沖液（PBS）中，配置成與冷凍干燥前液體菌劑相同體積的菌液，平板計數，計算溶藻干粉菌劑的活菌率。

1.2.3 響應面優化試驗 為了確定最佳菌劑保護劑配方，以溶藻菌GHJ菌體活菌率為響應值，選取10%蔗糖（A），10%甘油（B），4%脫脂乳粉（C），8%谷氨酸鈉（D）4種保護劑為自變量，采用Design-Expert 8.0.6軟件混合料單純形重心試驗設計方案對4種保護劑配比進行優化。

1.2.4 數據分析 本次試驗所得數據采用Excel、oirgin進行分析和統計，采用Design-Expert 8.0.6和Origin 8.0進行相關繪圖和有關數據分析。

2 結果與分析

2.1 單純形重心設計

單純形重心設計方法是一種高效的混料試驗設計統計模型，可以根據各個試驗點及其對應的響應值得到相應的響應面模型。單純形重心設計法具有較高的精確性和信任度。響應面軟件給出的試驗設計方案如表1及表2。

響應面設計得到的不同配比的溶藻菌菌劑復合保護劑活菌率見表3。

按照軟件給出的試驗方案進行實驗，將得到的試驗結果進行軟件分析，得到各試驗保護劑編碼值與試驗因變量Y用編碼表示的回歸方程：

Y=150.30A+83.57B+101.38C+70.88D+179.82AB-32.60AC+93.12AD-46.34BC+413.74BD-141.76CD+481.75ABC+256.84ABD-465.32ACD+828.85BCD

其中不同配比配制得到的復合保護劑菌劑冷凍干燥前后狀態如圖1和圖2所示。

其中響應面給出的試驗分析中活菌率的方差分析結果如表4。

模型及其線性混合模型的P值均大于0.05，差異不顯著，甘油與谷氨酸鈉的交互作用對干粉菌劑活菌率的影響在P<0.05水平顯著。相關系數R2為0.984 7（R2>0.9），說明結果的變異有98.47%是由變量引起的，校正后的相關系數R2 adj=0.959 7，模型與實際的擬合度較好。F值用于判斷模型的受干擾程度，F值越大，模型的受干擾程度越小，而此次模型的F值為53.29，模型的受干擾程度較小。由Design-Expert 8.0.6優化得到活菌率最高的復合干粉菌劑保護劑組成為10%蔗糖（1/3），10%甘油（1/3）、4%脫脂乳粉（0）、8%谷氨酸鈉（1/3）時，溶藻菌活菌率最大為189.26%。

2.2 響應面分析討論

4種不同保護劑單獨制備成干粉菌劑時對菌劑中溶藻菌結構和性能的影響在課題組早期的研究中已得到結論[18]，4種保護劑兩兩之間的交互作用對菌劑中活菌率的影響如圖3—圖6所示。

菌劑保護劑組成中不含谷氨酸鈉和脫脂乳粉（圖3），干粉菌劑活菌率可達133.32%。在溶藻菌菌劑冷凍進行真空冷凍干燥的過程中，蔗糖分子含有大量的羥基，羥基基團可以聯結菌劑四周的自由基，從而可以防止菌劑暴露在外界中，Leslie等[19]指出蔗糖不僅能使得完整的細胞不遭受外環境的破環，同時還能保護脂質體與生物膜。而甘油在溶藻菌干粉菌劑冷凍干燥時利用其能滲透細菌細胞壁與細胞膜，降低細胞失水程度與速度，使得菌體的新陳代謝過程減緩來提高菌劑活菌率。當兩者同時存在時，蔗糖與甘油作為保護劑的同時還能為菌體提供細胞復蘇所需的碳源，有利于干粉菌劑的存儲。菌劑保護劑組成中不含甘油和谷氨酸鈉（圖4），蔗糖和脫脂乳粉各為1/2時，干粉菌劑活菌率可達133.44%。脫脂乳粉富含蛋白質能給予細菌一層保護外衣，將菌體包裹。按照保護劑的功能與性質，蔗糖屬于糖類保護劑，脫脂乳粉屬于蛋白類保護劑，以這兩種物質組成的復合保護劑兼具糖類保護劑與蛋白類保護劑的優點。由圖5可知，菌劑保護劑組成中不含谷氨酸鈉和蔗糖時，干粉菌劑活菌率可達50.14%，活菌率較低，溶藻菌GHJ經真空冷凍干燥后的活菌率與甘油、脫脂乳粉的交互作用呈負相關。推測原因可能為甘油含有3個羥基，具有強吸濕性，與大分子物質脫脂乳粉形成氫鍵，兩種保護劑相互作用從而降低了對菌體的保護。圖6所示菌劑保護劑組成中不含甘油和蔗糖時，干粉菌劑活菌率可達103.51%。脫脂乳粉作為溶藻菌菌劑進行真空冷凍干燥時候的保護劑可以幫助菌劑呈現優異的粉末狀和促使菌劑具有良好的復水性。谷氨酸鈉可以與水進行密切作用能夠使干粉菌劑留有適量充足的水分，滿足了溶藻菌等微生物對維持活性的最低要求。

采用Design-Expert 8.0.6對試驗結果進行分析作圖，因為考慮到蔗糖、谷氨酸鈉、脫脂乳粉和甘油存在相互影響進而對溶藻菌菌劑活菌率產生影響，所以選擇控制某一保護劑作為單一變量，其他3個保護劑與活菌率的關系由軟件處理得到響應面圖，則各響應面影響分析見圖7—圖10。

蔗糖、脫脂乳粉、甘油3種保護劑在制備溶藻菌干粉菌劑過程中對溶藻菌活菌率的影響如圖7所示，復合保護劑組分中不投加谷氨酸鈉，10%蔗糖的溶液、4%脫脂乳粉和10%甘油各占1/3，在三類保護劑共同作用下，活菌率最高可達90.37%，其響應曲面圖開口向下，說明活菌率作為響應值存在極大值且該點在試驗選取的試驗區域內。圖8表示復合保護劑中不投加脫脂乳粉，10%蔗糖的溶液、8%谷氨酸鈉和10%甘油各占1/3，經真空冷凍干燥后溶藻菌菌劑成活率達189.26%，活菌率最高，保護劑作用機制主要分為3個階段，冷凍干燥前甘油保護劑滲透入細菌細胞內部，取代水分子與細胞內大分子物質多的氫鍵，維持細胞的結構[20];冷凍干燥過程中蔗糖保護劑增加了溶液的黏性，減緩了水的結晶過程，降低了菌體的機械損傷程度[21];冷凍干燥后谷氨酸鈉能維持菌劑中的水分并修復受損細胞。圖9表示復合保護劑中不投加甘油，10%蔗糖的溶液、8%谷氨酸鈉和4%脫脂乳粉各占1/3，經真空冷凍干燥后溶藻菌菌劑成活率達160.21%，響應曲面圖曲線較為平緩，變化幅度不大，三者共同作用時交互作用不明顯。復合保護劑中不投加蔗糖，10%甘油的溶液、8%谷氨酸鈉和4%脫脂乳粉各占1/3干粉菌劑活菌率的情況如圖10所示，經真空冷凍干燥后溶藻菌菌劑成活率達153.21%。

3 結論與討論

單一保護劑在細菌菌體抵抗惡劣的外界環境情況下保護作用相對較弱，不足以達到真空冷凍干燥的要求，在菌劑中添加復合保護劑，能突破單一保護劑的局限性。王大欣等[22]利用Box-Behnken法確認復合保護劑為蔗糖4.51 mg·g-1、海藻糖0.90 mg·g-1、葡萄糖9.60 mg·g-1時，能最大程度提高菌劑存活率。杜磊和喬發東[23]在單因素試驗的基礎上設計正交試驗，得出10%蔗糖、10%脫脂乳與5%谷氨酸鈉是最佳的復合保護劑，菌劑存活率由64%提升至95%。

本試驗采用單純形重心設計，建立了不同菌劑保護劑配比與干粉菌劑活菌率之間的回歸模型，預測出復合保護劑最優比例為：10%蔗糖、10%甘油與8%谷氨酸鈉成分各占1/3，溶藻功能菌活菌率最大為189.26%。本研究對于溶藻菌干粉菌劑制備及商品化開發有一定的理論和應用參考價值。

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