血栓形成中的凝血與免疫

張薇，閻濤

凝血和免疫是聯系廣泛、高度整合、微妙平衡的生物系統，防御病原體對機體的傷害和入侵，任何成分的失調都會影響整個系統平衡，導致不同程度炎癥和血栓形成，缺血性卒中也是其中之一[1]。2011年Guido Stoll等[2]提出缺血性卒中中“血栓-炎癥”的理念，卒中急性期“血栓-炎癥”級聯反應會導致缺血的進展，其病理生理機制為血液級聯系統（補體、接觸、凝血、纖溶系統及血小板）、免疫細胞（中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞）和血管內皮細胞之間相互作用[3]。促進血栓形成的機制和反應是復雜多樣的，由于各種放大機制及不同系統之間的相互作用，任何級聯系統的觸發都可以迅速導致全面的血栓形成和炎癥的發生。本文簡要綜述凝血與炎癥之間的分子和細胞關系及其在血栓形成中的作用，以期為血栓性疾病的研究策略提供參考。

1 血小板及凝血相關因子

1.1 血小板 在內皮受損后血小板黏附在暴露的血管損傷內皮上，暴露的膠原直接與血小板糖蛋白（glycoprotein，GP）Ⅰa/Ⅱa和GPⅥ受體結合誘導血小板活化，促進激活的細胞釋放介質，如ADP、5-羥色胺和凝血酶，進一步通過信號傳導途徑激活血小板形狀的改變和整合素的表達，促進血小板的粘連[4]。除了止血和血栓形成以外，血小板還參與先天免疫反應的病理生理過程，活化的血小板上P-選擇素與內皮細胞、白細胞表達的P-選擇素糖蛋白配體-1（P-selectin glycoprotein ligand-1，PSGL-1）結合，調節中性粒細胞募集和激活，從而介導先天免疫反應[5]。此外血小板通過其膜上的Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）檢測病原體相關分子模式（pathogen-associated molecular patterns，PAMPs），釋放殺菌產物并誘導中性粒細胞脫顆粒和中性粒細胞外陷阱（neutrophil extracellular trap，NET）的釋放[6]。NET由DNA、組蛋白和其他細胞核及細胞質成分（包括彈性蛋白酶、乳鐵蛋白、髓過氧化物酶和鈣保護素）形成的中性粒細胞網狀釋放物組成，可以直接激活內源性凝血途徑的凝血因子Ⅻ及組織因子（tissue factor，TF），以啟動凝血級聯反應[7]。NET中存在的特異組蛋白H3和H4，不僅表現為損傷相關分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）激活補體途徑，而且結合血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）誘捕血小板導致其聚集形成血栓[8]。急性心肌梗死患者的血栓中含有大量中性粒細胞和高水平的NET，是血栓的重要組成部分，提示NET在動脈血栓形成中具有重要作用[9]。同樣，在缺血性卒中患者血栓成分中，發現活化的中性粒細胞和瓜氨酸化組蛋白H3[10]。此外，中性粒細胞來源的絲氨酸蛋白酶和細胞外核小體也可以誘導血栓形成，通過TF途徑抑制物的局部蛋白水解來加強凝血[11]。因此，血小板作為免疫效應細胞，既能通過TLR識別病原體，又能與先天免疫細胞進行信號傳遞以增強其血栓前過程。

血小板活化產生的微粒（micro vesicle，MV）是循環中MV的主要來源，富含核酸、蛋白質、脂質和小分子，在血小板與內皮細胞和先天免疫細胞的聯系中起著重要的作用[12]。研究表明，攜帶有microRNA的MV可以調節巨噬細胞中不同mRNA的轉錄，將巨噬細胞編程為吞噬表型[13]；來自血小板和其他細胞的MV可促進單核細胞和中性粒細胞與內皮細胞的黏附，激活TF促進血栓形成[14-15]。以上研究結果表明MV在凝血-炎癥-血栓病理生理過程中發揮重要調節作用，以MV為工具運輸microRNA或納米藥物等策略可能是將來血栓性疾病治療的潛在方向。

1.2 凝血相關因子 凝血相關因子是參與凝血過程的生物分子，在凝血過程被相繼激活轉為有活性的蛋白酶，TF和凝血酶在凝血過程中發揮關鍵靶點作用，當血管受損時，TF與受體凝血因子Ⅶa結合催化凝血因子X和凝血因子Ⅸ的蛋白水解，導致下游產物凝血酶的生成，進而導致纖維蛋白和血栓形成。除了促凝事件外，凝血相關因子尚能過通特定受體介導血管系統炎癥級聯反應的信號傳遞發揮其促炎效應。

1.2.1 組織因子 TF是外源性凝血級聯反應的主要啟動因子。MV和單核細胞是循環中TF的重要來源[16]，在血小板激活因子（plateletactivating factor，PAF）或粒細胞巨噬細胞集落刺激因子的刺激下，TF移位到細胞表面，并且血小板的激活可以誘導TF mRNA的成熟、蛋白質翻譯和表面易位，觸發凝血酶生成和血栓形成[17-18]。在心肌梗死動脈粥樣硬化斑塊破裂后形成的血栓中TF表達升高，單核/巨噬細胞及其MV來源的TF活性也升高，表明TF可導致斑塊破裂后的血栓形成[19]。此外，非編碼的microRNA在血管系統轉錄后基因表達的調控中發揮重要作用，有研究發現通過上調動脈粥樣硬化性疾病患者miR-223表達的治療干預，可以通過抑制內皮細胞TF的表達來減少動脈粥樣硬化血栓形成事件[20]。Ⅶa與其天然受體TF結合形成TF/Ⅶa復合物，通過蛋白酶活化受體2（protease-activated receptor-2，PAR-2）途徑激活P44/42絲裂原激活蛋白激酶（mitogen-activation protein kinase，MAPK）、Jun氨基末端激酶（Jun N-terminal kinase，JNK）等促炎信號引起IL-6和其他趨化因子等炎性因子的分泌，促進動脈粥樣硬化斑塊形成和發展[21]。因此，TF在動脈粥樣硬化導致血栓形成的起始和發展中起到關鍵作用。

1.2.2 凝血酶 絲氨酸蛋白酶凝血酶是凝血途徑中的關鍵蛋白，通過促凝促炎效應發揮其止血和血栓作用。凝血酶裂解纖維蛋白原產生纖維蛋白，激活蛋白酶激活受體（proteaseactivated receptor，PAR）的G蛋白偶聯受體家族介導對細胞的直接作用[22]。PAR在血小板、內皮細胞、免疫細胞、上皮細胞、星形膠質細胞和神經元等細胞中表達。凝血酶切割PAR-1、PAR-3和PAR-4活化血小板，動員細胞內鈣，將黏附分子P-選擇素和CD40配體及與凝血酶原結合的磷脂酰絲氨酸轉移到血小板表面[23-24]，釋放凝血因子Ⅴ、纖維蛋白原和凝血因子ⅩⅢ ，進一步增強凝血酶的生成和血凝塊的穩定性導致血栓形成。

在炎癥方面，凝血酶激活內皮細胞PAR-1，通過核因子-κB（nuclear factor kappalightchain-enhancer of activated B cell，NFκB）介導抑制蛋白I-κB的磷酸化和降解，導致NF-κB易位到細胞核并刺激各種促炎基因的轉錄。這種信號級聯反應啟動多種促炎介質的產生，包括IL-6、IL-8、轉化生長因子-β、單核細胞趨化蛋白-1、血小板源性生長因子、細胞間黏附分子-1和P-選擇素[25-26]。進一步介導血小板和白細胞在內皮上的募集、黏附和滾動，通過PAR誘導IL-6及成纖維細胞和單核細胞產生IL-8表達上調，增大血小板活化效應，這些過程形成正反饋回路放大血管表面的炎癥和促凝過程[27]。

2 接觸激活系統

接觸激活系統由4種血漿蛋白組成：凝血因子Ⅺ、凝血因子Ⅻ、前激肽釋放酶（prekallikrein，PK）和高分子量激肽原（high molecular weight kininogen，HK）。接觸蛋白以循環中的非活性形式接觸帶負電荷的無機多聚磷酸鹽（polyphosphate，polyP）發生激活，分別通過內源性凝血途徑和激肽釋放酶-激肽系統啟動促凝和促炎反應[28]。凝血因子Ⅻ與帶負電荷的polyP結合發生活化，將PK切割成激肽釋放酶（kallikrein，KAL），進一步激活凝血因子Ⅺ啟動凝血酶和纖維蛋白的形成。血漿激肽釋放酶將HK裂解為BK，與G蛋白偶聯激肽B2和B1受體結合啟動磷脂酶C、NF-κB等信號通路導致中性粒細胞分泌細胞因子如IL-6、IL-8或TNF-α介導炎癥反應[28-29]；此外BK還可以IL和TNF依賴的方式激活B1受體以響應組織損傷和炎癥調節免疫反應，激活B2受體和TLR導致樹突狀細胞的反應[30]。除了凝血因子Ⅻ外，PK和HK也都可導致卒中后小鼠微血管血栓形成、血腦屏障滲漏、水腫形成和炎癥。與野生型小鼠相比，PK和HK基因敲除小鼠的腦內巨噬細胞/小膠質細胞和中性粒細胞顯著減少，腦梗死體積減小，腦水腫減輕且腦內免疫細胞浸潤較輕[31-32]。

3 補體系統

補體是免疫系統的重要組成部分，通過經典途徑、凝集素和替代途徑被激活，最終會聚成中心蛋白酶C3轉化酶。C3轉化酶進一步作用于下游因子產生過敏性毒素C3a和C5a及膜攻擊復合體C5b-9，在感染的細胞膜內創建跨膜通道，導致細胞溶解和死亡，構成炎癥的重要組成部分。C3a和C5a分別與G蛋白偶聯受體（G protein-coupled receptor，GPCR）相結合而介導多種炎癥和血栓前過程。C3a和C5a誘導內皮細胞表達IL-6、IL-8、IL-1、單核細胞趨化蛋白-1和T細胞激活性低分泌因子，促進單核細胞、中性粒細胞和巨噬細胞的募集和激活，引起內皮通透性升高[33]。補體通過C5a介導中性粒細胞和內皮細胞上的TF表達、激活的內皮細胞和血小板上P-選擇素的暴露增加及內皮細胞分泌vWF因子介導血栓前過程[34]。補體激活的凝集素途徑的重要組成部分是甘露糖相關絲氨酸蛋白酶（mannose-binding lectinassociated serine protease，MASP）-1和MASP-2，MASP-1可切割凝血因子ⅩⅢ 、HK、纖維蛋白原和激活凝血酶激活的纖溶抑制物[35]，MASP-2可將凝血酶原切割為凝血酶，裂解C4產生C3轉化酶，它們在補體激活和凝血中發揮重要作用[36]。此外，血小板活化后在血凝塊形成過程中形成纖維蛋白，可導致MASP-1和MASP-2的激活[34]，進一步放大血栓性疾病中的凝血和炎癥反應。

4 纖溶酶原激活系統

纖溶酶原激活系統由一組蛋白酶和蛋白酶抑制劑組成，在血塊溶解的同時也可以促進與血栓形成有關的炎癥過程，通過降解纖維蛋白和啟動促進傷口愈合和血管生成的免疫過程來驅動纖溶。在止血或血栓形成過程中凝血酶激活內皮細胞表達和分泌tPA和尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase-type plasminogen activator，uPA）：tPA通過誘導中性粒細胞脫顆粒導致MMP-9、MMP-8、彈性蛋白酶和髓過氧化物酶的釋放[37]，促進中性粒細胞的遷移；uPA通過中性粒細胞激活介導激活JNK途徑和NF-κB核轉位增加促炎細胞因子IL-1、人巨噬細胞炎癥蛋白2和TNF的表達[38]。此外tPA和uPA水解纖溶酶原產生纖溶酶切割纖維蛋白，增強tPA、纖溶酶原和纖維蛋白之間的相互作用，進一步促進纖維蛋白凝塊上的纖溶酶生成，導致纖溶增強、細胞外基質重塑、MMP激活和誘導NF-κB信號通路驅動炎癥反應[39]。纖溶酶還可以直接激活C3和C5[40]，產生炎性過敏毒素C3a、C5a和C5b，啟動膜攻擊復合物免疫反應介導炎癥過程。

綜上所述，血小板、TF、凝血酶、接觸激活系統、補體系統和纖溶系統等在凝血和血栓形成發展中扮演重要角色，同時通過多種機制介導凝血后炎性反應，二者相互依存，相互影響。對炎癥和凝血之間分子機制的更深入了解，將有助于研究者更有效地識別血栓性疾病新的治療靶點，同時調節凝血和炎癥的治療策略可能有潛在的價值。

【點睛】凝血和免疫在血栓的形成中密切相關，本文綜述了凝血-免疫在血栓形成中的相互作用，為抗栓治療策略的研究提供參考。