TESTIn、PTEn蛋白在子宮內(nèi)膜良、惡性病變組織中的表達(dá)及其相關(guān)性研究

劉 妍，黃丹丹

（1.內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院病理科，內(nèi)蒙古 包頭 014010；2.內(nèi)蒙古包鋼醫(yī)院婦產(chǎn)科）

子宮內(nèi)膜癌是婦科三大惡性腫瘤疾病之一，其發(fā)生、發(fā)展與絕經(jīng)延遲、糖尿病、高血壓、肥胖、雌激素替代治療等諸多因素有關(guān)[1]。根據(jù)腫瘤生物學(xué)特性，可以將子宮內(nèi)膜癌分為子宮內(nèi)膜樣癌（Ⅰ型）與非子宮內(nèi)膜樣癌（Ⅱ型），二者的生物學(xué)特性各異，故早期臨床鑒別診斷存在難度[2]。鑒別診斷子宮內(nèi)膜癌的具體分型，得到患者確切的病理特征及生物學(xué)特性，是給予患者針對(duì)性治療的關(guān)鍵所在，這對(duì)增強(qiáng)治療效果、改善患者預(yù)后意義重大，尤其是對(duì)于部分年紀(jì)尚輕且希望保留生育功能的女性，早期準(zhǔn)確的鑒別診斷尤為關(guān)鍵[3]。目前，已有研究發(fā)現(xiàn)，在包括子宮內(nèi)膜癌等諸多惡性腫瘤組織中均存在蛋白等表達(dá)改變[4，5]。這些基因或蛋白的分子學(xué)改變?cè)谧訉m內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展中起到關(guān)鍵作用。TESTIn基因在諸多人類惡性腫瘤中發(fā)揮抑癌功能，位于人染色體FRA7G脆性位點(diǎn)[6]；PTEn蛋白經(jīng)其分子途徑，可抑制細(xì)胞周期，并抑制細(xì)胞轉(zhuǎn)移及血管形成，在各中惡性腫瘤中也有特異性表達(dá)[7]。二者雖均在惡性腫瘤中有表達(dá)，但其之間是否存在某種聯(lián)系，來(lái)相互影響、相互作用，參與各腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展，尚無(wú)定論，尤其是在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)，未見(jiàn)較多報(bào)道。本研究觀察了子宮內(nèi)膜癌患者組織中TESTIn、PTEn蛋白表達(dá)，分析了二者之間的相關(guān)性，旨在探討TESTIn、PTEn蛋白與子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)性。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 納入對(duì)象

回顧性分析，選擇醫(yī)院2016-10～2019-10期間接受子宮內(nèi)膜癌切除治療并經(jīng)病理組織活檢證實(shí)為子宮內(nèi)膜癌的患者100例作為病例組，全部患者病歷資料完整，并有子宮內(nèi)膜組織蠟塊標(biāo)本保存，患者均證實(shí)為子宮內(nèi)膜癌患者；患者年齡34～60歲，平均42.12±5.51歲；體重43～71kg，平均53.12±5.21kg，包括內(nèi)膜樣腺癌49例、透明細(xì)胞癌7例、鱗狀細(xì)胞癌25例、未分化癌9例、小細(xì)胞癌10例。納入同期在醫(yī)院經(jīng)分段診刮術(shù)刮出子宮內(nèi)膜組織蠟塊標(biāo)本，并證實(shí)為良性病變的患者33例作為良性對(duì)照組，全部良性對(duì)照患者病歷資料完整，均有標(biāo)本保存。患者年齡35～61歲，平均41.96±5.47歲；體重43～70kg，平均53.24±5.19kg，包括子宮內(nèi)膜炎8例、子宮內(nèi)膜異位癥7例、子宮內(nèi)膜囊腫11例、子宮內(nèi)膜增厚7例。排除合并其他惡性腫瘤疾病的患者、合并嚴(yán)重且無(wú)法控制的高血壓或糖尿病的患者、合并其他重要臟器功能衰竭的患者。兩組患者年齡、體重等一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），有可比性。

1.2 方法

1.2.1 一般資料采集 設(shè)計(jì)子宮內(nèi)膜癌一般資料調(diào)查問(wèn)卷，調(diào)查并記錄納入的100例子宮內(nèi)膜癌患者一般資料，包括年齡、分期（符合國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟制定的子宮內(nèi)膜癌分期標(biāo)準(zhǔn)）[8]：Ⅰ期、Ⅱ期、Ⅲ期；記錄患者腫瘤肌層浸潤(rùn)深度：＜1/2，1/2；記錄患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生情況。

1.2.2 TESTIn、PTEn蛋白表達(dá)檢測(cè)方法（1）主要實(shí)驗(yàn)試劑：上海基因科技有限公司提供的單克隆鼠抗人PTEn、鼠抗人TESTIn一抗、抗體稀釋液、PBS緩沖液，上海化工流暢提供的瓊脂糖，上海寶楓生物科技有限公司提供的DnA marker，北京天根生化科技有限公司提供的基因組DnA提取試劑盒，美國(guó)Zymo Research公司提供的DnA修飾試劑盒，大連Takara公司提供的10×360PCR Mix，美國(guó)Ivitrogen生命科技公司提供的Trizol，福建省福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司提供的免疫組化試劑盒、免疫組化顯色試劑盒及中性樹(shù)膠，上海第一化工廠提供的蘇木素；（2）主要實(shí)驗(yàn)儀器：德國(guó)EPPEnDORF公司提供的室溫離心機(jī)、高速離心機(jī)、微量移液器，美國(guó)ABI公司提供的HT-7500型PCR儀，德國(guó)LEICA公司提供的熒光倒置顯微鏡、石蠟切片機(jī)，北京六一電器廠提供的振蕩器，美國(guó)BIO-RAD公司提供的電泳儀；（3）主要檢查方法：①制作石蠟切片：全部標(biāo)本均使用10%福爾馬林液體固定，24h后沖洗，脫水-透明-浸蠟-修塊-切片，連續(xù)切片，取無(wú)皺痕、完整組織行常規(guī)HE染色，染色后中性樹(shù)膠封片，經(jīng)免疫組化染色測(cè)定各蛋白相對(duì)表達(dá)量；②組織切片脫蠟與水化、PBS沖洗、抗原修復(fù)、取出切片、PBS沖洗、滴加抗體過(guò)夜后常溫放置30min，后使用PBS沖洗，將切片取出之后擦干組織周圍的液體，滴加二抗之后孵育，PBS沖洗，工作液制備后切片，將切片置于顯微鏡下觀察染色情況，判斷其陽(yáng)性表達(dá)情況；（4）判讀染色結(jié)果：不同的抗體細(xì)胞其定位不同，觀察胞質(zhì)與（或）核膜內(nèi)有棕黃色顆粒或橘黃色顆粒出現(xiàn)則判定為陽(yáng)性，細(xì)胞陽(yáng)性顆粒結(jié)構(gòu)清晰、定位好，且著色與背景對(duì)比清楚則定義為陽(yáng)性；反之若背景與顯色強(qiáng)度無(wú)差別則判定為陰性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，全部數(shù)據(jù)均經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布，以表示計(jì)量資料，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；以百分比表示計(jì)數(shù)資料，用χ2檢驗(yàn)，等級(jí)相關(guān)采用Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TESTIn、PTEn蛋白在子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)

TESTIn、PTEn蛋白在子宮內(nèi)膜癌組織中陽(yáng)性表達(dá)減弱（見(jiàn)圖1，2）；在子宮內(nèi)膜良性病變組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，在子宮內(nèi)膜良性病變中幾乎無(wú)表達(dá)（見(jiàn)圖3，4）。

2.2 TESTIn、PTEn蛋白在良、惡性子宮內(nèi)膜組織中陽(yáng)性檢出率的比較

較良性對(duì)照組，病例組子宮內(nèi)膜組織中檢出的TESTIn、PTEn蛋白陽(yáng)性率低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)表1）。

表1 TESTIn、PTEn蛋白在良、惡性子宮內(nèi)膜組織中陽(yáng)性檢出率的比較

2.3 子宮內(nèi)膜組織中TESTIn、PTEn蛋白表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)等級(jí)Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜組織中TESTIn、PTEn蛋白間呈正相關(guān)（r=0.867，P＜0.001）。

2.4 子宮內(nèi)膜癌組織不同臨床病理特征

TESTIn、PTEn蛋白陽(yáng)性檢出率比較不同年齡段子宮內(nèi)膜癌組織TESTIn、PTEn蛋白陽(yáng)性檢出率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；高臨床分期、肌層浸潤(rùn)嚴(yán)重、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者陽(yáng)性檢出率較其他患者更低，不同病理類型患者陽(yáng)性檢出率的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（見(jiàn)表2，3）。

表2 子宮內(nèi)膜癌組織不同臨床病理特征TESTIn蛋白陽(yáng)性檢出率比較

χ2 -P-n-4臨床病理特征病理類型內(nèi)膜樣腺癌透明細(xì)胞癌鱗狀細(xì)胞癌未分化癌小細(xì)胞癌9 7 2陽(yáng)性例數(shù)（n）-18 7.325 0.024 5 9 10 2 6 1 1陽(yáng)性率（%）-36.73 28.57 24.00 11.11 10.00

表3 子宮內(nèi)膜癌組織不同臨床病理特征PTEn蛋白陽(yáng)性檢出率比較（n，%）

3 討論

目前，對(duì)于子宮內(nèi)膜癌的分子遺傳機(jī)制已有較多研究報(bào)道，結(jié)果均表明了不同分型子宮內(nèi)膜有其獨(dú)特的分子變化，可見(jiàn)不同分型子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生與發(fā)展遵循不同路徑[9]。正常情況下，子宮內(nèi)膜細(xì)胞經(jīng)β-catenin、PTEn、TSETIn等基因突變與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等改變來(lái)介導(dǎo)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生，且多為子宮內(nèi)膜樣子宮內(nèi)膜癌[10]。可見(jiàn)基因突變?cè)谧訉m內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵作用。

子宮內(nèi)膜在發(fā)生癌變的一系列過(guò)程中，伴隨著各類癌基因與抑癌基因的不斷變化，已有研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜癌的進(jìn)展與直腸癌的進(jìn)展模式類似，且前者存在更為復(fù)雜的基因改變[11]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著子宮內(nèi)膜癌組織學(xué)分級(jí)升高，其遺傳學(xué)改變也越明顯，基因突變情況也越多[12]。早年對(duì)子宮內(nèi)膜組織進(jìn)行的相關(guān)研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜非典型增生組織中，存在PTEn、TESTIn等基因突變情況，且有接近50%的組織出現(xiàn)PTEn、TESTIn基因失活，即表達(dá)缺失，這種表達(dá)缺失情況在疾病發(fā)展至子宮內(nèi)膜癌后更為常見(jiàn)[13，14]。PTEn、TESTIn等基因突變?cè)谧訉m內(nèi)膜早期階段便有發(fā)生，尤其是部分伴單克隆性增生的內(nèi)膜組織，這種基因的突變情況更為明顯。但Lax等[15]在2004年的研究中指出，正常子宮內(nèi)膜組織中也發(fā)現(xiàn)輕微的PTEn、TESTIn基因失活。然而這種失活的意義尚不清楚，仍需進(jìn)一步探究。

PTEn、TESTIn二者均是抑癌基因，前者定位在10q23，主要構(gòu)成包括8個(gè)內(nèi)含子與9個(gè)外顯子，編碼mRnA長(zhǎng)度為5.5kb，由403個(gè)氨基酸組成該基因的編碼蛋白質(zhì)，具有蛋白磷酸酶與脂質(zhì)磷酸酶的活性；PTEn的晶體結(jié)構(gòu)由2個(gè)主要功能區(qū)構(gòu)成，同時(shí)還有其他3個(gè)結(jié)構(gòu)區(qū)，這些結(jié)構(gòu)區(qū)構(gòu)成的催化單元，是抑制腫瘤活性、維持結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的關(guān)鍵。在非活性的狀態(tài)下，PTEn C末端的蘇氨酸、絲氨酸殘基均處于磷酸化的狀態(tài)，該基因功能活性區(qū)保持關(guān)閉以穩(wěn)定PTEn蛋白活性，一旦PTEn激活，將導(dǎo)致蘇氨酸、絲氨酸殘基脫磷酸化，PTEn磷酸化功能域暴露，對(duì)應(yīng)的生物活性增加，使得PTEn蛋白更容易被泛素所介導(dǎo)的相關(guān)蛋白酶體所降解。上述機(jī)制被稱作負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)將在缺乏刺激的前提下削弱PTEn效能，從而減弱PTEn對(duì)磷脂酰肌醇-3-三磷酸的抑制活性，細(xì)胞周期抑制作用減弱，加速細(xì)胞增殖，從而推動(dòng)腫瘤惡變的發(fā)生與發(fā)展。而TESTIn則主要位于人染色體FRA7G位點(diǎn)，這一位點(diǎn)現(xiàn)已被證實(shí)好發(fā)DnA突變、超甲基化、缺失等情況，故極易引起包括TESTIn基因在內(nèi)的諸多抑癌基因表達(dá)的缺失，因其屬于抑癌基因，故當(dāng)該基因表達(dá)缺失后，抑癌作用將被大大削弱，從而促進(jìn)腫瘤的激活、分化與增殖，導(dǎo)致惡性腫瘤疾病的發(fā)生。但目前針對(duì)TESTIn基因的缺失是否參與了子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)研究并不多見(jiàn)，且TESTIn基因突變是否與PTEn基因突變有關(guān)也未見(jiàn)報(bào)道。

為深入了解子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展的分子學(xué)特點(diǎn)，本研究比較了惡性病變與良性病變子宮內(nèi)膜癌組織TESTIn、PTEn蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，二者在良性病變子宮內(nèi)膜組織中呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，而在惡性病變組織中表達(dá)大大削弱，提示TESTIn、PTEn蛋白缺失可能與腫瘤惡性病變有關(guān)，這與既往多項(xiàng)報(bào)道的結(jié)果一致；檢驗(yàn)二者之間的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜癌組織中二者呈正相關(guān)，即TESTIn、PTEn蛋白中任一蛋白的缺失均會(huì)導(dǎo)致另一蛋白的缺失，推測(cè)TESTIn、PTEn蛋白的缺失在子宮內(nèi)膜組織中相互作用、相互影響，共同參加了腫瘤細(xì)胞的增殖、分化，但近年來(lái)關(guān)于兩種蛋白關(guān)系的研究尚且少見(jiàn)，故尚無(wú)明確的循證依據(jù)支持上述推測(cè)，該推測(cè)的真實(shí)性和可靠性仍需進(jìn)一步驗(yàn)證，此外關(guān)于兩種蛋白相互作用的具體機(jī)制也尚不清晰，仍需通過(guò)進(jìn)一步研究證實(shí)；本研究還對(duì)比了不同臨床病理特征的子宮內(nèi)膜癌患者的TESTIn、PTEn蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，隨著病理分期升高、轉(zhuǎn)移的發(fā)生及肌層浸潤(rùn)深度增加，二者的表達(dá)逐漸被削弱，提示TESTIn、PTEn蛋白表達(dá)缺失可能與子宮內(nèi)膜癌病程、病情等相關(guān)，但其具體機(jī)制仍待探究。

綜上所述，TESTIn、PTEn蛋白在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)缺失，二者相互影響、相互作用，可能參與了疾病的進(jìn)展、浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。今后關(guān)于TESTIn、PTEn蛋白的研究重點(diǎn)應(yīng)放在明確其在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的確切生物學(xué)功能、作用機(jī)制和相互作用關(guān)系上，以觀察TESTIn、PTEn蛋白是否能夠成為未來(lái)臨床生物學(xué)標(biāo)記位點(diǎn)或基因治療的作用靶點(diǎn)。