非小細胞肺癌EGFR基因突變與E-cadherin、Vimentin表達的相關性

郭寧寧

（廣東省惠州市第三人民醫院腫瘤內科，廣東 惠州 510000）

肺癌嚴重影響人類身體健康，非小細胞肺癌在所有肺癌中占據80%，以手術為主、放化療輔助治療的方式廣泛用于肺癌，然而部分非小細胞肺癌患者5年存活率不足20%[1]。研究發現非小細胞肺癌多數患者中均可檢測到EGFR基因突變，且EGFR基因突變影響患者生存狀況[2]。因此，及早尋找影響EGFR基因突變原因對于緩解治療效果迫在眉睫。過往研究發現上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在腫瘤浸潤及轉移過程中尤為重要，上皮型標志蛋白E-鈣黏蛋白（E-cadherin）的喪失與間質型標志蛋白波蛋白（vimentin）的獲得為EMT轉化主要特征，二者均可反映疾病狀況[3，4]。然而目前 E-cadherin、Vimentin 在非小細胞肺癌患者EGFR突變中的作用，目前尚不明確。本研究通過檢測非小細胞肺癌EGFR基因突變患者E-cadherin、Vimentin的表達，旨在探究兩者與非小細胞肺癌患者EGFR突變的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選擇2018-05～2019-03在本院進行治療的104例非小細胞肺癌患者進行研究，男性61例，女性43例，年齡37～79歲，平均年齡58.95±12.16歲，病理類型：鱗癌31例，鱗腺混合癌6例，腺癌67例，I～II期56例，III～IV期 48例，EGFR基因突變61例，EGFR野生型43例。

1.2 納入與排除標準

納入標準：（1）患者均經病理學檢測為肺癌；（2）年齡不超過80歲；（3）符合TNM腫瘤病理學分型標準[5]；（4）患者資料完整。排除標準：（1）術前接受過放療、化療等腫瘤相關的治療；（2）合并其它部位惡性腫瘤；（3）肝、腎等器官發生重要損傷；（4）妊娠、精神疾病患者。

1.3 研究方法

1.3.1 主要試劑與儀器DNA提取試劑盒（KL111201）購自美國Omega公司；免疫組化試劑盒（WE0316）購于北京百奧萊博公司；PCR儀（7500）購于美國ABI公司；E-cadherin、Vimentin抗體均購于英國Abcam公司；EGFR基因引物均在上海生工生物工程有限公司合成；顯微鏡BX51購于日本奧林巴斯公司。

1.3.2 腫瘤組織中EGFR基因突變檢測采用Primer5.0軟件設計引物，引物序列參照基因組DNA提取試劑盒提取組織DNA，經檢測濃度與純度后，采用PCR擴增反應檢測EGFR基因突變情況，反應體系：2mmol/L氯化鎂，250umdNTP，2.5UTaqDNA，上下游引物各0.3uM。反應條件控制：94℃5min，94℃反應60s，57℃退火60s，72℃反應1min，反復循環30次。取5uL反應產物，經2%瓊脂糖凝膠電泳觀察條帶大小，剪取正確條帶，經純化后進行酶切反應：0.15uL Exon-I酶，0.5uL SAP，4uL PCR反應產物，0.35uL ddH2O，酶切條件：37℃恒溫反應60min，72℃15min，經循環反應后進行測序分析，統計各位點突變情況。

1.3.3 免疫組化檢測肺組織中E-cadherin、Vimentin表達情況收集術中切除的肺組織，在10%中性福爾馬林溶液中過夜固定，進梯度乙醇溶液水合、二甲苯透明、浸蠟后進行石蠟包埋，制備肺組織石蠟切片（4μm），經烘烤后，采用二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，用0.01M檸檬酸鈉（PH6.0）緩沖液對切片進行抗原熱修復20min，洗滌后添加3%過氧化氫孵育10min，清洗后加入10%山羊血清常溫下孵育10min，采用E-cadherin、Vimentin一抗（1：300）4℃過夜孵育切片后，用辣根過氧化物酶標記的IgG二抗在常溫孵育切片1h。PBS清洗3次，每次5min。采用100μL DAB溶液對切片進行顯色反應，在顯微鏡下觀察直至顯色，沖洗后用蘇木精進行復染，然后在1%鹽酸中5s后用水沖洗，經乙醇脫水、二甲苯透明處理、中性樹脂封片后在顯微鏡下觀察切片中E-cadherin、Vimentin蛋白陽性表達情況。每張切片挑選10個視野，E-cadherin主要定位在細胞膜，Vimentin主要定位在細胞漿或細胞質中，采用Image-J計算陽性染色細胞百分比，蛋白陽性表達率=染色細胞數/細胞總數。

1.2 統計學處理

采用統計學軟件SPSS 21.0進行數據分析，當P＜0.05時，則代表差異具有統計學意義。計數資料以%描述，行χ2檢驗；計量資料以表示，兩組間對比行t檢驗，采用Pearson相關性分析E-cadherin、Vimentin蛋白陽性表達與非小細胞肺癌患者臨床參數及EGFR突變的關系。

2 結果

2.1 非小細胞肺癌患者EGFR基因突變情況

非小細胞肺癌患者中（104例），EGFR突變61例，其中33例為21號外顯子點突變，20例為19號外顯子缺失突變，4例為18號外顯子突變。2例20號外顯子突變，2例為18號和20號外顯子共突變。臨床分析發現非小細胞肺癌患者EGFR基因突變與患者性別、腫瘤組織類型、患者吸煙有關（P＜0.05）；與年齡、腫瘤分期無關（P＞0.05）（見表1）。

表1 非小細胞肺癌患者EGFR基因突變與臨床參數的關系

2.2 非小細胞肺癌患者EGFR基因突變患者E-cadherin、Vimentin表達情況

與EGFR基因野生型患者相比，EGFR基因突變者肺組織中E-cadherin表達顯著升高，Vimentin表達顯著降低（P＜0.05）（見表2）。

表2 不同EGFR基因表型患者E-cadherin、Vimentin表達比較

2.3 E-cadherin、Vimentin與患者臨床病理參數的關系

E-cadherin、Vimentin與非小細胞肺癌患者組織類型相關（P＜0.05）；與年齡、性別、腫瘤分期、吸煙無關（P＞0.05）。

表3 非小細胞肺癌患者E-cadherin、Vimentin表達與臨床參數的關系

2.4 非小細胞肺癌患者E-cadherin、Vimentin相關性分析

Pearson相關性分析顯示，非小細胞肺癌患者E-cadherin與Vimentin呈顯著負相關（r=-0.483，P＜0.05）（見圖1）。

3 討論

EGFR主要定位在人7號染色體，其功能區主要位于18～24號外顯子區域，過往研究發現EGFR基因突變多集中在21號外顯子，為858號亮氨酸轉變成精氨酸；20號外顯子突變出現較少，主要為770～775號密碼子突變[6]。本研究發現非小細胞肺癌患者中，EGFR突變61例，其中33例為21號外顯子點突變，2例20號外顯子突變，說明非小細胞肺癌患者EGFR突變大多數集中在21號外顯子，20號外顯子較少，與過往研究相符合[7]。研究發現肺癌患者EGFR基因突變主要發生在女性肺腺癌患者中[8]。本研究發現非小細胞肺癌女性患者EGFR突變率明顯高于男性，腺癌突變率明顯高于非腺癌，提示非小細胞肺癌患者EGFR基因突變在不同性別中表現出差異，可能受某些因素影響。

E-cadherin屬跨膜糖蛋白，通過結合Catenin介導細胞粘附，在組織結構結構維持中發揮重要作用。研究發現在上皮細胞腫瘤中E-cadherin表達水平降低會造成細胞粘附能力下降，而E-cadherin表達降低也會進一步造成細胞去分化導致高侵襲性[9]?；A研究發現上皮細胞中E-cadherin過表達能夠抑制細胞中增殖，誘導細胞凋亡，造成細胞連接松散，侵襲能力增強[10]。這些研究均說明E-cadherin的異常變化會影響腫瘤的表型變化。Xing等研究發現在MCF-7等癌細胞中過表達E-cadherin后，能明顯降低的增殖率，提示E-cadherin可能在EGFR分子靶向治療的過程中發揮重要作用[11]。當腫瘤出現EMT后，EGFR基因突變率升高，表明腫瘤EMT狀態與EGFR基因突變密切相關。本研究發現與EGFR基因野生型患者相比，EGFR基因突變者肺組織中E-cadherin表達顯著升高，且E-cadherin表達與癌組織類型相關，進一步進行Logistic回歸分析發現E-cadherin是影響非小細胞肺癌患者EGFR基因突變的危險因素，推測E-cadherin高表達可促進癌細胞侵襲、出現EMT增加的非小細胞肺癌EGFR基因突變，進而加重病情。

Vimentin以往作為間葉組織來源腫瘤特異標志物，而在上皮腫瘤細胞中Vimentin過表達后會進一步促使上皮間質轉化，加速腫瘤轉移、侵襲等?；A研究證實抑制癌細胞中Vimentin表達后可降低腫瘤細胞的侵襲、轉移，抑制EMT進程[12]。Richardson等報道對化療藥物不敏感的肺癌患者組織中Vimentin高表達，說明Vimentin高表達與癌癥患者化療效果不佳有關，可用于預測癌癥患者臨床療效[13]。Weng等研究發現Vimentin表達水平升高后造成癌細胞上皮-間質轉化[14]。本研究發現與EGFR基因野生型患者相比，EGFR基因突變者肺組織中Vimentin表達顯著降低，且Vimentin表達與癌組織類型相關，進一步進行Logistic回歸分析發現Vimentin與非小細胞肺癌患者EGFR基因突變密切相關，說明在EGFR基因突變受到EMT的影響，推測Vimentin低表達可促進腫瘤轉移、侵襲，加速EMT轉化，EGFR基因突變增高，加重病情。

在EMT過程中，E-cadherin、Vimentin以相反的作用共同參與腫瘤細胞的轉移、浸潤、侵襲等生物過程。Mao等研究發現Vimentin能夠通過下調E-cadherin表達進而促進血管癌細胞的增殖、侵襲、轉移[15]。本研究經Pearson相關性分析發現非小細胞肺癌患者E-cadherin與Vimentin呈現負相關，推測兩者可能以負調控作用影響EMT過程，進而參與非小細胞肺癌患者EGFR基因突變過程。

綜上所述，非小細胞肺癌患者EGFR基因突變多集中在21號外顯子，在女性非腺癌患者中發生概率較高，EGFR基因突變患者E-cadherin陽性表達較高，Vimentin陽性表達較低，二者可能共同影響EGFR基因突變。然而臨床治療中是否能得出結論，還需要長期隨訪。