血常規(guī)和血生化指標在患強直性脊柱炎食蟹猴中的臨床價值

李玉瑩，麥冬梅，賈歡歡，吳志恒，何剛?cè)A，唐爽捷，馬承紅，盧 麗*

(1.廣東藥科大學(xué)，廣州 511400； 2.廣東省實驗動物監(jiān)測所(廣東省實驗動物重點實驗室)，廣州 510663； 3.廣州春盛生物研究院有限公司，廣州 510900； 4.廣東藥科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣州 510000)

強直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)是一種病因未明的自身免疫性疾病，主要累及骶髂及脊柱關(guān)節(jié)[1]，青少年多發(fā)，男性多于女性，隨著病情的進展，AS患者的生活質(zhì)量會受到極大的影響，目前尚無良好的治療藥物和干預(yù)措施。

疾病動物模型的構(gòu)建是研究疾病發(fā)生機理和防治策略的基礎(chǔ)[2]，隨著對強直性脊柱炎病因病機的研究，國內(nèi)外學(xué)者已構(gòu)建了若干個強直性脊柱炎動物模型[3]，遺憾的是這些模型均為嚙齒類動物模型，與AS患者臨床表現(xiàn)存在較大差異。非人靈長類動物在遺傳背景、生理結(jié)構(gòu)等方面與人類高度相似[4-5]，課題組經(jīng)過多年研究，建立了一種自發(fā)性AS食蟹猴動物模型，將為AS相關(guān)藥物的安全性和有效性評價起到重要作用。動物外周血血常規(guī)、血生化指標的檢查，是藥物安全性和有效性評價最常用的評價指標，本研究將對AS食蟹猴血常規(guī)和血生化指標進行檢測和評價，以期尋找到適合AS食蟹猴評價的關(guān)鍵指標，為AS的后續(xù)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

從約2000只食蟹猴群體中，篩選自發(fā)性AS食蟹猴 40 只，雌性 27 只，雄性 13 只，年齡：(10.22±3.00)歲，體重:(4.46±1.93)kg；篩選雌性 25 只，雄性 15 只，年齡：(11.00±3.19)歲，體重:(5.52±1.60)kg。已適應(yīng)喂養(yǎng)2年。兩組動物年齡性別等基本生理參數(shù)均衡可比。級別：普通級；動物由廣東春盛生物科技發(fā)展有限公司提供[SCXK(粵)2019-0027]。已經(jīng)通過廣東省實驗動物監(jiān)測所IACUC的審查(IACUC2018002)，符合“3R”原則。飼養(yǎng)條件：群居飼養(yǎng)于廣東春盛生物研究院有限公司[SYXK(粵)2015-0152]，環(huán)境溫度18℃～26℃，相對濕度 40%～70%，自然采光。

1.2 主要試劑與儀器

血常規(guī)：血紅細胞分析用稀釋液(CELLPACK DFL)、Hb溶血劑 (SULFOLYSER)、WNR 溶 血劑 (Lysercell WNR)、WDF 溶血劑(Lysercell WDF)、WDF 染色液(Fluorocell WDF)、WNR染色液(Fluorocell WNR)、PLT 熒光染色液(Fluorocell PLT) (批號分別為:A7010、A7014、A8006、A7019、A7062、A7047、A7094，日本 Sysmex 株式會社)；血液分析儀XN-1000 V[B1]型(日本 Sysmex 株式會社)。

血生化：白蛋白試劑盒、總蛋白試劑盒、堿性磷酸酶測定試劑盒、總膽固醇試劑盒、甘油三酯試劑盒、高密度脂蛋白膽固醇試劑盒、低密度脂蛋白膽固醇試劑盒。試劑均為上?？迫A生物工程股份有限公司產(chǎn)品；儀器使用3100型全自動生化分析儀(日本日立公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 AS動物選擇

通過對動物進行體格檢查，并使用測角儀來評估脊柱的曲率和膝關(guān)節(jié)和髖關(guān)節(jié)的運動范圍(ROM)進行自發(fā)性AS動物的初篩[6]，隨后進行X線檢查，判斷標準與人類AS患者判斷標準相同：0 級：影像學(xué)檢查未見病變，骨質(zhì)結(jié)構(gòu)完全正常；Ⅰ級：骨關(guān)節(jié)疑似存在硬化、侵蝕現(xiàn)象；Ⅱ級：可見明顯硬化及侵蝕現(xiàn)象，并表現(xiàn)出輕度異常情況，但關(guān)節(jié)間隙不十分明顯改變；Ⅲ級：出現(xiàn)明顯骨質(zhì)硬化及侵襲現(xiàn)象，可見骨質(zhì)重度異常，關(guān)節(jié)腔隙可見明顯改變，見部分強直變化；Ⅳ級：大部分脊柱出現(xiàn)強直變化或完全強直，表現(xiàn)出嚴重骨關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)異常[7]。再配合細胞因子檢查：C-反應(yīng)蛋白(C-reactionprotein，CRP)、含有瓜氨酸抗體的抗環(huán)肽(抗CCP抗體)、抗鏈球菌溶血素O(anti-Streptolysin，ASO)、降鈣素原(procalcitonin，PCT)和類風(fēng)濕因子(IgG-RF& IgM-RF)。并排除其他疾病，如(1)自身免疫性疾病(類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等)；(2)合并感染性疾病或貧血；(3)患有血液學(xué)疾??；(4)肝、腎功能損害；(5)患有心腦血管疾?。?6)患有惡性腫瘤。

1.3.2 樣本采集

(1)血常規(guī)樣本采集

動物禁食過夜后，非麻醉狀態(tài)下使用 2 mL 含乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-K2)真空采血管對實驗動物采用前肢頭靜脈采血 2 mL，保存樣本并于1.5 h內(nèi)送檢。

(2)血生化樣本采集

1976年，美國學(xué)者Cremin在《公共教育》一書中正式提出了教育生態(tài)學(xué)的概念，正式把焦點集中在教育與周圍環(huán)境因素的相互作用關(guān)系，為教育學(xué)的發(fā)展思路提供了新的視角。1987年，美國學(xué)者Goodlad提出了“文化生態(tài)系統(tǒng)(cultural ecosystems)”的概念，指出學(xué)校應(yīng)從管理入手統(tǒng)籌各種生態(tài)因子提高辦學(xué)效果。

動物禁食過夜后，非麻醉狀態(tài)下使用 3 mL 促凝真空管對實驗動物采用前肢靜脈采血3 mL，樣本于1.5 h 內(nèi)送檢。血液樣本室溫下靜置3 h后，3000 r/min，離心10 min，取血清。

1.3.3 指標測定

(1)血常規(guī)指標測定

使用 Sysmex XN-1000 V 全自動血液分析儀對動物抗凝血進行以下指標測定:白細胞計數(shù)(WBC)、血小板計數(shù)(PLT)、平均血小板體積(MPV)、中性粒細胞(NEUT)、淋巴細胞(LYMPH)、單核細胞(MONO)、嗜酸性粒細胞(EO)、嗜堿性粒細胞(BASO)。計算中性粒細胞與淋巴細胞比值(NLR)、單核細胞與淋巴細胞比值(MLR)、嗜酸性粒細胞與淋巴細胞比值(ELR)、嗜堿性粒細胞與淋巴細胞比值(BLR)。

(2)血生化指標測定

使用全自動生化分析儀檢測本實驗相關(guān)的生化指標，包括：堿性磷酸酶(ALP)、甘油三酯(TG)、白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、球蛋白(GLOB)、總膽固醇(CHO)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、白蛋白與球蛋白比值(A/G)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 AS組食蟹猴與對照組食蟹猴的檢測指標的比較

與對照組相比，AS組WBC、NEUT、MONO、EO、BOSO、MPV、NLR、MLR、ELR和BLR均顯著升高，LYMPH顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；PLT無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1 AS組與對照組的血常規(guī)指標的對比Table 1 Comparison of complete blood count indexes between AS group and control group

2.1.2 血生化指標的比較

與對照組相比，AS組TP、GLOB、ALP、CHO顯著升高；ALB、A/G、HDL-C、LDL-C顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；TG無顯著性差異(P>0.05)。見表2。

2.2 ROC曲線評價研究指標對AS食蟹猴的診斷價值

2.2.1 血常規(guī)指標對AS食蟹猴的診斷價值

使用ROC來評價MPV、WBC、BASO、EO、MONO、LYMPH、NEUT、NLR、MLR、ELR和BLR對AS食蟹猴的診斷價值，結(jié)果顯示它們的AUC值分別是：0.736(0.626～0.846)、0.788(0.688～0.889)、0.683(0.566～0.801)、0.815(0.716～0.914)、0.681(0.564～0.797)、0.215(0.118～0.313)、0.85(0.768～0.933)、0.894(0.826～0.961)、0.896(0.828～0.963)、0.87(0.789～0.951)、0.897(0.832～0.963)。其中各白細胞比值(NLR、MLR、BLR、ELR)的AUC值均高于其他指標，BLR的AUC值最高，靈敏度和特異度分別為0.75和0.92。(圖1、表3)

表2 AS組與對照組的血生化指標的對比Table 2 Comparison of blood biochemical indexes between AS group and control group

2.2.2 血生化指標對AS食蟹猴的診斷價值

使用ROC來評價TP、ALB、GLOB、A/G、CHO、HDL-C、LDL-C和ALP對AS食蟹猴的診斷價值，結(jié)果顯示它們的AUC值分別是：0.678(0.562～0.795)、0.048(0.007～0.09)、0.942(0.889～0.995)、0.047(0.002～0.091)、0.719(0.606～0.831)、0.295(0.182～0.408)、0.333(0.211～0.455)、0.934(0.880～0.987)。其中GLOB和ALP的AUC值均高于其他指標，GLOB的AUC值最高，靈敏度和特異度分別為0.878和0.975。(表4、圖2)

圖1 ROC曲線評價研究血常規(guī)指標對AS 食蟹猴的診斷價值Figure 1 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the complete blood count index for AS cynomolgus monkeys

表3 ROC曲線評價血常規(guī)指標對AS食蟹猴的診斷價值Table 3 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the complete blood count index for AS cynomolgus monkeys

表4 ROC曲線評價血生化指標對AS食蟹猴的診斷價值Table 4 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the complete blood count index for AS cynomolgus monkeys

圖2 ROC曲線評價研究血生化指標對AS 食蟹猴的診斷價值Figure 2 The ROC curve was used to evaluate the diagnostic value of the blood biochemical index for AS cynomolgus monkeys

3 討論

強直性脊柱炎是以中軸和骶髂附著點炎癥為主要癥狀的全身免疫性疾病，發(fā)病早、致殘率高、病程長，目前尚無良好的治療手段[10]。目前，AS的病情評估和診斷主要依靠臨床表現(xiàn)、影像學(xué)及ESR、CRP等指標檢查，但是影像學(xué)檢查價格昂貴且不便，不適合AS食蟹猴較多數(shù)量的初篩。本研究通過對血常規(guī)、白細胞比值(NLR、MLR、ELR、BLR)和血生化部分指標的分析來探究各指標對AS食蟹猴的診斷價值。

NLR和MLR作為炎癥標志物在很多疾病中被關(guān)注，NLR和MLR異常增加與一些疾病炎癥活動或預(yù)后有關(guān)，如系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、骨關(guān)節(jié)炎等[11-12]。本研究結(jié)果顯示與正常對照組的食蟹猴相比，AS食蟹猴的NLR和MLR均顯著升高。也有文獻結(jié)果顯示在AS中NLR與ESR和CRP呈正相關(guān)[13]，MLR與CRP呈正相關(guān)[14-15]。嗜酸性粒細胞和嗜堿性粒細胞都是一種免疫效應(yīng)細胞，通常占血液白細胞的5%和1%以下。本研究結(jié)果表明在AS食蟹猴中EO和BASO均顯著增高，這可能與AS是一種慢性炎癥為主的自身免疫性疾病有關(guān)。周振興等[16]研究表明由于大量炎癥介質(zhì)和細胞因子的異常分泌導(dǎo)致患者嗜酸性粒細胞顯著增高；嗜堿性粒細胞除了在過敏反應(yīng)和寄生蟲感染中的活性外，Chirumbolo等[17]研究證明在固有免疫和免疫調(diào)節(jié)中具有重要作用發(fā)生炎癥時血液中的血細胞比例發(fā)生變化。目前關(guān)于ELR和BLR的研究較少，但是在本研究結(jié)果中AS食蟹猴的ELR和BLR升高，并有統(tǒng)計學(xué)意義，這與Yang等[13]的研究中關(guān)于AS病人的結(jié)果基本一致。MPV是血小板活化的標志物，Kisacik等[18]研究發(fā)現(xiàn)MPV可能是診斷AS靈敏度更高的指標，并且發(fā)現(xiàn)MPV在AS的活動期呈較低水平，在非活動期MPV水平較高。在我們的研究結(jié)果中AS組的食蟹猴較正常對照組的食蟹猴的MPV顯著升高，而PLT無顯著性差異，與Kisacik等[18]的研究結(jié)果中的AS病人非活動期指標變化相符。本研究探討血常規(guī)和血生化指標的檢測對自發(fā)性AS食蟹猴的診斷價值。ROC曲線結(jié)果顯示，在血常規(guī)指標中，白細胞比值的各指標(NLR、MLR、ELR、BLR)的靈敏性和特異性都均高于各類白細胞指標，與文獻報道一致[14]。

ALP 主要由肝和成骨細胞合成，是反映成骨活動的重要標志物，本研究結(jié)果顯示AS食蟹猴ALP顯著升高，這可能是隨著疾病進程會出現(xiàn)脊柱及關(guān)節(jié)骨化導(dǎo)致。GLOB 是一個計算值,是血清中的“非白蛋白”蛋白的總量,免疫反應(yīng)增強是AS重要的臨床表現(xiàn),GLOB的升高可能是由于AS的炎癥特征導(dǎo)致機體免疫蛋白升高。張曉剛等[19]的研究結(jié)果表現(xiàn)為人類AS患者的TG和CHO顯著升高，LDL-C和HDL-C 下降，與本研究結(jié)果中AS食蟹猴的指標大致相同。ALB是主要用于反映機體營養(yǎng)狀態(tài)和慢性消耗性疾病的指標之一[20-21]，AS食蟹猴由于疼痛和全身炎癥會導(dǎo)致機體營養(yǎng)吸收和物質(zhì)代謝能力降低，從而表現(xiàn)出ALB和A/G低于正常食蟹猴。在血生化指標中，GLOB和ALP的AUC值均大于0.9，證明它們對于AS食蟹猴的診斷靈敏度和特異度較好。

綜合上述討論，本研究發(fā)現(xiàn)血常規(guī)、血生化檢查可作為一種快速、簡便、可靠的手段，對自發(fā)AS食蟹猴模型進行篩查、診斷和相關(guān)藥物的評價提供輔助診斷的手段。綜合ROC曲線結(jié)果，指標NLR、MLR、ELR、BLR、ALP和GLOB是本研究指標中靈敏度和特異度最佳的六個指標，并且它們的變化可能與AS疾病活動度有關(guān)，對AS有重要的臨床應(yīng)用價值。但是，本研究樣本量相對較小，還需后續(xù)進行縱向研究，包括較大量的數(shù)據(jù)分析來進一步探究這些指標與疾病活動度的相關(guān)情況。