五種植物粗多糖誘導小鼠骨髓來源樹突狀細胞成熟的體外篩選

董曉筱，李博野，張季瑤，陳 穎，胡 秦*，彭 博*

(1.北京工業大學生命科學與生物工程學院，北京 100124； 2.北京工業大學環境與能源工程學院， 北京 100124； 3.中國中醫科學院中藥研究所，北京 100124)

樹突狀細胞(dendritic cells, DC) 由造血干細胞分化，經歷前體細胞、未成熟樹突狀細胞和成熟樹突狀細胞三個階段。機體內的DC分布較為廣泛，常定居于脾、淋巴結、表皮等部位[1]。作為哺乳動物的一種抗原提呈細胞(antigen presenting cell, APC)，DC不僅具有攝取、加工、處理及呈遞抗原的能力，同時也可釋放多種細胞因子，提呈抗原并激活初始T細胞，進一步啟動T細胞免疫反應[2]，因而在機體固有免疫和適應性免疫應答中均起著重要的作用。近年來，人們已經可以通過使用多種細胞因子，如GM-CSF、IL-4、Flt3等[3]方法來誘導骨髓細胞體外定向分化為骨髓來源的樹突狀細胞(BMDC)，BMDC的體外培養和成熟活化實驗已被廣泛應用于佐劑篩選、免疫激活等相關研究中。

多糖是植物體內的一類重要化學物質，不僅在植物體內含量較高，而且還具有豐富的生物學功能。目前，對于植物多糖的研究主要包括免疫調節、抗腫瘤、抗氧化等方面[4-5]。植物多糖具有安全性較高、天然可降解性、免疫原性低、毒副作用小等優點。本文選用了靈芝多糖、枸杞多糖、香菇多糖、黃芪多糖、云芝多糖五種粗多糖分別檢測了它們對于BMDC的體外誘導成熟作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6雌性小鼠21只，6～8周齡，20～22 g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2016-0006]，實驗動物飼養于中國中醫科學院基礎理論研究所[SYXK(京)2016-0021]，嚴格按照中國中醫科學院中國中醫科學院中醫基礎理論研究所倫理要求進行動物實驗(20190901058)，在實驗研究過程中遵守“3R”原則，并給予實驗小鼠應有的人道關懷。

1.2 主要試劑

靈芝提取物(生產批號: BCSW20180228-8)；香菇提取物(生產批號: BCSW20180228-8)；枸杞提取物(生產批號: BCSW20180228-8)；云芝提取物(生產批號：BCSW20180228-8)購于西安天象生物工程有限公司，采用熱水浸提、醇沉和酶解工藝進行粗多糖的提取，多糖含量均在50%以上；注射用黃芪多糖購自伯恩公司(生產批號: 151101)。CpG 1668 ODN (5’-tccatgacgttcctgatgct-3’)由生工生物工程公司合成；RPMI1640細胞培養基、胎牛血清(FBS)均購自Gibco公司；GM-CSF、IL-4購于PeproTech公司；流式抗體APC anti-mouse CD80、PerCp/Cy 5.5 anti-mouse CD40、PE anti-mouse I-A/I-E、FITC anti-mouse CD11c、anti-mouse CD16/32、小鼠IL-6、IL-12p40和TFN-α試劑盒均購自BioLegend公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 植物粗多糖溶液制備

使用無內毒素的水分別溶解枸杞、靈芝、香菇、黃芪和云芝的粗多糖粉末，并調整濃度為10 mg/mL，通過內毒素清除柱(Thermo Scientific)處理后，經ToxinSensor終點顯色法內毒素檢測試劑盒(Genscript)檢測，內毒素含量均在0.05 EU/mL以下。多糖溶液經0.22 μm濾膜過濾后，保存于-20℃下備用。

1.3.2 小鼠BMDC細胞培養

取C57BL/6小鼠脫臼處死，無菌分離股骨，經RPMI1640培養基反復沖洗骨髓，1000 r/min離心后重懸于RPMI1640培養基中。細胞懸液以1×106/mL密度接種于6孔板中，加入含GM-CSF(20 ng/mL)的完全培養基(RPMI1640培養基含10%滅活胎牛血清，雙抗及50 μmol/L β-巰基乙醇(SIGMA)。每2 d對細胞進行換液。培養6 d后，收集懸浮或松散貼壁細胞(未成熟BMDC)用于后續實驗。

1.3.3 流式細胞儀測定細胞表面CD80，CD86和MHCII的表達

未成熟BMDC細胞使用RPMI1640培養基調整細胞濃度為1×106/mL，接種于24孔板中，分別加入枸杞粗多糖、靈芝粗多糖、香菇粗多糖、黃芪粗多糖和云芝粗多糖，終濃度為100 μg/mL。陰性對照組加入不含藥物的RPMI1640培養基，陽性對照組加入終濃度為4 μg/mL的CpG 1668 ODN。37°C，80% 濕度，5% CO2條件下培養24 h后，1000 r/min離心5 min，收集細胞，經anti-mouse CD16/32封閉抗體封閉，冰浴10 min后，加入APC-CD80、Percp/cy 5.5-CD86、PE-MHC II、FITC-CD11c四種抗體于4℃ 避光染色30～40 min。收集細胞，采用BD FACSCalibur流式細胞儀進行檢測，通過Flowjo v10軟件分析細胞表面分子表達。

1.3.4 酶聯免疫吸附法測定IL-6，IL-12p40和TFN-α

未成熟BMDC細胞以1×106/mL密度接種于96孔板中，采用不同的粗多糖刺激24 h后，收集細胞培養上清，分別采用小鼠IL-12p40， IL-6和TFN-α檢測試劑盒進行檢測。采用酶標儀(PerkinElmer)測定450 nm下的吸光值(OD值)，并根據標準曲線計算樣品中的細胞因子含量。

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 植物粗多糖對BMDC細胞表面分子標志表達的影響

采用流式細胞儀檢測粗多糖對BMDC細胞表面CD80和CD86表達的影響，結果發現與陰性對照組(CC組)相比，陽性對照CpG ODN顯著提高BMDC細胞表面CD80, CD86和MHCII (I-Ab)表達。云芝粗多糖顯著上調CD86和MHCII (I-Ab)表達，對CD80有一定上調作用，但無顯著性差異。黃芪粗多糖，枸杞粗多糖，靈芝粗多糖和香菇粗多糖均無明顯作用(如圖1)。結果表明云芝粗多糖可顯著上調BMDC細胞表面細胞成熟相關分子的表達，具有誘導BMDC細胞成熟的作用。

2.2 植物粗多糖對BMDC細胞分泌細胞因子的影響

采用ELISA試劑盒檢測五種植物粗多糖對BMDC細胞培養上清中IL-6，IL-12p40和TFN-α細胞因子的釋放影響。結果發現，與陰性對照組(CC組)相比，云芝粗多糖培養組和CpG ODN陽性對照組均顯著提升BMDC細胞培養上清中IL-6(P<0.001)，IL-12p40(P<0.05)以及和TFN-α(P<0.001)的含量。枸杞粗多糖(P<0.05)，靈芝粗多糖(P<0.001)和香菇粗多糖(P<0.05)組，BMDC細胞培養上清中IL-6的釋放顯著性提高。其余組均可見不同程度的IL-6，IL-12p40和TFN-α表達上調，但與對照組相比，無顯著性差異(如圖2所示)。因此，云芝粗多糖可顯著刺激BMDC細胞釋放IL-6，IL-12p40和TFN-α，枸杞粗多糖，靈芝粗多糖和香粗菇多糖可刺激BMDC細胞釋放IL-6。

3 討論

近年來，隨著植物粗多糖藥理學方面的研究應用逐漸深入，植物多糖作為植物中極為重要的成分，其預防或治療疾病的功能也受到了重視，主要活性包括抗腫瘤、抗病毒、降血脂血糖、抗氧化等[6]，已有文獻證明枸杞多糖、靈芝多糖、香菇多糖、黃芪多糖等都具有增強機體免疫能力，促進炎癥因子表達，抗病毒、降血糖、誘導體液和細胞免疫應答等功能，例如黃芪多糖已被用于口蹄疫疫苗、狂犬病疫苗、新城疫疫苗等疫苗佐劑[7]；云芝多糖可增強NK細胞的殺傷功能，促進小鼠T淋巴細胞和B淋巴細胞增值，增強腫瘤壞死因子吞噬能力[8-9]；香菇多糖具有抗氧化作用，可以抑制苯并芘誘導產生的氧化應激反應，降低皮膚癌風險[10]，可對糖尿病大鼠的腦組織起到保護作用[11]；靈芝多糖可激活T淋巴細胞、B淋巴細胞及巨噬細胞等，促進細胞因子分泌，提高機體的免疫功能[12]。本實驗主要對比了靈芝、香菇、枸杞、黃芪、云芝幾種粗多糖對于BMDC細胞的體外誘導成熟作用，進一步研究其作為佐劑的潛力。

注：A: 五種粗多糖對BMDC細胞表面標志物表達的影響；B: CD80的表達；C: CD86的表達；D: I-Ab的表達。與陰性對照組相比，**P<0.01，***P<0.001。圖1 植物多糖對BMDC細胞表面標志分子表達的影響Note. A, Effects of five polysaccharides on BMDC surface marker expression. B, CD80 expression on BMDCs. C, CD86 expression on BMDCs. D, I-Ab expression on BMDCs.**P<0.01,***P<0.001.Figure 1 Effects of plant polysaccharides on BMDC surface marker expression

注：A: IL-6的釋放情況；B: IL-12p40的釋放情況；C: TFN-α的釋放情況。與陰性對照組相比，*P<0.01，***P<0.01。圖2 植物粗多糖對BMDC細胞釋放細胞因子的影響Note. A, Secretion of IL-6. B, Secretion of IL-12p40. C, Secretion of TFN-α. Compared with the CC group, *P<0.01,***P<0.01.Figure 2 Effects of plant polysaccharides on cytokines released by BMDC

DC作為機體內最為重要的一種APC，是機體固有免疫的參與者，更是機體適應性免疫應答反應的啟動者[13]。未成熟的樹突狀細胞可以通過多種模式識別受體，如Toll樣受體(toll-like receptors, TLR)感知抗原，進一步成熟，成熟DC的表面共刺激分子、分泌因子與趨化因子增多[14-15]，除通過MHC-II類分子提成抗原激活CD4+T細胞外，DC還可以通過MHC-I途徑激活CD8+T細胞[16]，更高效全面的發揮樹突狀細胞的免疫調節功能，因此，DC的活化及數量都關系著免疫系統的功能。隨著對DC的研究發展，發現其在過敏反應[17]、感染性休克[18]、抗腫瘤[19]、疫苗佐劑研究等方面都起著至關重要的作用，已有文獻證明，大多數腫瘤組織中的DC處于未成熟狀態，腫瘤細胞誘導DC凋亡，并通過分泌細胞因子抑制DC的產生和成熟[20]，因此，DC的成熟對機體的免疫反應起著重要的作用，對DC的誘導成熟也是研究疫苗佐劑的切入點。

本文中以CpG ODN做為陽性對照，使用五種不同的植物粗多糖對BMDC細胞進行體外培養，通過流式細胞術檢測BMDC細胞表面標志分子CD80，CD86和MHCII的表達量的變化及ELISA檢測BMDC細胞上清中IL-6，IL-12p40和TFN-α的含量。實驗結果表示，云芝粗多糖與BMDC細胞共培養24 h后，細胞表面CD80，CD86和MHCII的表達量均有上調，BMDC細胞分泌的IL-6，IL-12p40和TFN-α均有提升。綜上所述，初步分析云芝粗多糖具有誘導BMDC細胞成熟的能力，因此也具有疫苗佐劑的潛在應用可能性，值得進一步研究。