磷酸鞘胺醇參與KkAy2型糖尿病小鼠胰腺纖維化發病機制探討

修 磊，常 娜，姜 濤*

(1.首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院內分泌科，北京 100038； 2.首都醫科大學基礎醫學院細胞生物學系，北京 100069)

磷酸鞘胺醇(sphingosine 1-phosphate，S1P) 是一種具有生物活性的分子，其對很多生理功能及病理過程都發揮著調控作用。鞘胺醇激酶(sphingosine kinase, SphK)是控制 S1P 合成的限速酶。大量的研究證據表明 S1P 參與多種疾病各種器官的纖維化發生，如腎纖維化，肝纖維化，心肌纖維化，肺纖維化及胰腺纖維化[1-4]。胰腺纖維化發生的特點為胰腺星狀細胞(pancreatic stellate cells, PSCs)活化成為肌成纖維細胞(myofibroblasts，MFs)，從而形成大量細胞外基質(extracellular matrix，ECM)在胰腺內沉積，表現為平滑肌肌動蛋白α(α-smooth muscle actin, α-SMA)以及細胞外基質的主要成分I 型膠原 [collagen α1(I), Col α1(I)] 和 III 型膠原 [collagen α1(III), Col α1(III)]產生增加[5]。肌成纖維細胞來源廣泛，多種因素導致胰腺損傷，胰腺星狀細胞被激活，轉化為肌成纖維細胞，表達平滑肌肌動蛋白 α，并在胰腺內產生膠原促進胰腺纖維化的發生[6]。在纖維化過程中，轉化生長因子-β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)也發揮了很重要的作用，TGF-β1 是膠原產生過程中一種重要的介質，同時能夠誘導多種細胞向肌成纖維細胞的分化[7-8]。

本研究試圖探討 SphK/S1P及TGF-β1在KkAy2型糖尿病小鼠胰腺星狀細胞活化并產生膠原過程中的作用。這方面的研究將有助于我們更深入地了解糖尿病相關胰腺纖維化的發生機制，可能對糖尿病相關胰腺纖維化的預防及治療提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

實驗中使用了SPF級雄性KkAy2型糖尿病小鼠和C57BL/6J對照小鼠各7只，日齡49～56 d，均體重18～22 g，均來源于中國醫學科學院實驗動物研究所[SCXK(京)2015-0004]。飼養于首都醫科大學實驗動物部SPF級動物房[SYXK(京)2015-0022]，單籠飼養。KkAy2型糖尿病小鼠給予高脂飲食(購自于中國醫學科學院實驗動物研究所)；C57BL/6J小鼠給予普通飼料。所有小鼠均自由進食、進水。實驗動物質量符合實驗要求，實驗方案經首都醫科大學實驗動物管理和使用委員會審批，動物實驗經過福利倫理審查(AEEI-2017-090)。上述動物的取材于首都醫科大學實驗動物科學部屏障動物實驗設施進行。并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關懷。實驗中采集小鼠胰腺組織用于實時RT-PCR檢測。

1.2 主要試劑與儀器

PCR試劑購買自加利福尼亞應用生物系統公司；其他常用試劑購買自美國西格瑪奧德里奇公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 Real-time PCR

從新鮮的胰腺標本中提取總RNA使用的試劑盒購自德國 Qiagen 公司。我們的實驗使用美國ABI Prism 7300序列檢測系統進行實時RT-PCR檢測。PCR相關試劑購自美國Applied Biosystems。引物序列見表1。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequence list

1.4 統計學方法

2 結果

2.1 KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺星狀細胞活化增加

既往的研究表明，胰腺星狀細胞的活化在胰腺纖維化的發生發展中起著非常重要的作用[9]。本研究應用Real-time RT-PCR的方法檢測KkAy2型糖尿病小鼠和C57對照小鼠胰腺中反映胰腺星狀細胞活化的指標α-SMA的水平。結果顯示：與對照組C57小鼠相比，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺高表達 α-SMA達5.3倍(表2、圖 1)，這一結果表明與正常對照組小鼠相比，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺星狀細胞活化增加。

注：C57對照小鼠和KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中Col α1(I)(圖2A)和Col α1(III)(圖2B)的mRNA表達水平比較。所有結果均在三個獨立的實驗中得到證實。與對照組相比，*P <0.05。圖2 KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中膠原表達水平明顯高于對照組Note. mRNA expression of Col α1(I) (2A) and Col α1(III) (2B) in C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice. All results were confirmed in three independent experiments.Compared with vehide,*P<0.05.Figure 2 Collagen mRNA expression was up-regulated in KkAy type 2 diabetic mice

2.2 KKAy 2型糖尿病小鼠胰腺膠原表達增加

胰腺星狀細胞活化后可產生大量細胞外基質在胰腺內沉積從而促進纖維化的發生，主要表現為細胞外基質的主要成分Col α1(I)和Col α1(III)產生增加。本研究應用Real-time RT-PCR的方法檢測KkAy2型糖尿病小鼠和C57對照小鼠胰腺中細胞外基質的主要成分Col α1(I)和Col α1(III)的水平。結果表明與C57對照組相比，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中Col α1(I)和Col α1(III)的水平都明顯增加，分別為對照組的7倍(圖2A)和3倍(圖2B)，這提示糖尿病會增加小鼠胰腺纖維化的發生。

表2 C57對照小鼠與KKAy 2型糖尿病小鼠 胰腺α-SMA表達Table 2 α-SMA mRNA expression in pancreas of C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice

2.3 KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1及TGF-β1含量增加

有研究表明 S1P 參與了多種組織纖維化時肌成纖維細胞活化過程[10]。既往的研究表明，TGF-β1是胰腺星狀細胞活化成為肌成纖維細胞的主要

注：C57對照小鼠和KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中α-SMA的mRNA表達水平對比。所有結果均在三個獨立的實驗中得到證實。與對照組相比，*P <0.05。圖1 KKAy 2型糖尿病小鼠胰腺高表達α-SMANote. mRNA expression of α-SMA in pancreas of C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice. All results were confirmed in three independent experiments.*P< 0.05.Figure 1 α-SMA mRNA expression was up-regulated in pancreas of KkAy type 2 diabetic mice

刺激因素之一[11]。研究證實，TGF-β1能促進多種細胞，包括肝星狀細胞、肺成纖維細胞、小鼠的骨髓間充質干細胞以及胰腺星狀細胞向肌成纖維細胞分化[7]。本研究應用Real-time RT-PCR的方法檢測KkAy2型糖尿病小鼠和C57對照小鼠胰腺中SphK1及TGF-β1的mRNA水平。結果表明，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1及TGF-β1含量分別為C57對照小鼠的2.6倍(圖3A)及15倍(圖 3B)，這提示，SphK1及TGF-β1可能參與了糖尿病相關胰腺纖維化的發生。

2.4 KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1與TGF-β1水平呈明顯正相關

我們之前的研究表明TGF-β1通過上調人肝肌成纖維細胞內SphK1的表達和活化，從而誘導膠原表達[12]。為了探討KkAy2型糖尿病小鼠胰腺纖維化是否與TGF-β1誘導SphK1活化相關，我們對KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1與TGF-β1等指標的mRNA水平進行相關性分析。結果表明，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1與TGF-β1、α-SMA、Col α1(I)及Col α1(III)水平均呈明顯正相關，結果有統計學意義(表 5)，這提示，TGF-β1與SphK1參與糖尿病相關胰腺纖維化的發生存在相關性。

3 討論

胰腺纖維化常常是與慢性胰腺炎和胰腺癌相伴隨的一種病理變化，可導致胰腺功能喪失。胰腺纖維化是胰腺癌的發病基礎，胰腺癌由于其不易早期發現及無有效治療方法成為惡性程度最高的腫瘤之一[13]。目前有大量的研究在尋找潛在有應用價值的胰腺纖維化標志物，但其敏感性和特異性并

注：C57對照小鼠和KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1(圖3A)及TGF-β1(圖3B)的mRNA表達水平比較。所有結果均在三個獨立的實驗中得到證實。與對照組相比，*P<0.05。圖3 KkAy 2型糖尿病小鼠胰腺中SphK1及TGF-β1表達水平明顯高于C57小鼠對照組Note. mRNA expression of SphK1 (3A) and TGF-β1 (3B) in C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice. All results were confirmed in three independent experiments.Compared with vehide,*P<0.05.Figure 3 SphK1 and TGF-β1 mRNA expression were up-regulated in KkAy type 2 diabetic mice

表3 C57對照小鼠與KKAy 2型糖尿病小鼠胰腺膠原表達Table 3 Collagen mRNA expression in pancreas of C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice

表4 C57對照小鼠與KkAy 2型糖尿病 小鼠胰腺SphK1及TGF-β1表達Table 4 SphK1 and TGF-β1 mRNA expression in pancreas of C57 mice and KkAy type 2 diabetic mice

表5 SphK1與TGF-β1等指標mRNA水平相關性分析Table 5 Correlation analysis between mRNA levels of SphK1 and TGF-β1

不理想，因此研究胰腺纖維化發生的機制并尋找靶點能夠早期阻止或逆轉胰腺纖維化甚至是胰腺癌的發生有著重要的價值和意義[13-15]。目前關于胰腺纖維化有大量的研究，但其發病機制尚不明確，有研究表明胰腺星狀細胞的活化在胰腺纖維化的發生發展中起著非常重要的作用，活化的胰腺星狀細胞可以通過Wnt/β-catenin信號通路以及Hedgehog信號通路介導胰腺癌的發生和發展[5]。胰腺星狀細胞活化為肌成纖維細胞后表現為平滑肌肌動蛋白α以及I 型膠原和 III 型膠原水平增加[16-17]。我們的研究表明與正常對照組C57小鼠相比，KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中α-SMA、Colα1(I) 及Colα1(III) 水平明顯增加，這表明糖尿病小鼠胰腺星狀細胞活化成為肌成纖維細胞，并產生大量的細胞外基質，從而促進胰腺纖維化的發生。與正常小鼠相比，糖尿病小鼠胰腺纖維化發生明顯增加。為了探討KkAy2型糖尿病小鼠胰腺中胰腺星狀細胞活化的機制，我們檢測了胰腺中SphK1與TGF-β1的水平，結果表明糖尿病小鼠胰腺中SphK1與TGF-β1的水平均明顯增加，并且二者呈明顯正相關。上述結果提示SphK1與TGF-β1參與了胰腺星狀細胞的活化及胰腺纖維化的發生。為了進一步明確S1P在糖尿病小鼠胰腺纖維化發生過程中的作用，我們接下來的研究會在體外培養小鼠胰腺星狀細胞，通過給予SphK 的藥理學抑制劑 DMS或者用 RNA 干擾的方法特異性沉默胰腺星狀細胞中 SphK1 的表達，從而檢測高糖誘導下胰腺星狀細胞的活化及膠原水平的變化。此外，我們的實驗發現KKAy2型糖尿病小鼠胰腺組織中TGF-β水平明顯高于對照組，并且SphK1與TGF-β水平呈明顯正相關，那么在糖尿病小鼠中是否因TGF-β水平升高進而誘導SphK1激活胰腺星狀細胞進而促進胰腺纖維化的發生呢，這將在我們之后的實驗進一步明確。

S1P 可以在細胞內作為第二信使直接發揮作用，也可通過 ATP 結合轉運蛋白分泌到細胞外，與細胞膜上的S1P受體(S1P receptors，S1PRs)結合后激活不同的下游信號通路并誘導不同的生理及病理過程。有研究表明S1P參與了多種器官纖維化的發生發展過程，但其參與胰腺纖維化發生的機制目前仍不明確。胰腺纖維化發病的高危因素包括家族史、吸煙、肥胖、慢性胰腺炎以及糖尿病等[18-20]。目前有研究認為胰腺纖維化甚至是胰腺癌的高發與糖尿病發病率的增加呈相關性[21-23]。大約85%的胰腺纖維化患者患有糖耐量異常或糖尿病[24]。有學者認為糖尿病導致胰腺纖維化發生率增高與高血糖、高胰島素血癥及胰島素抵抗相關[20, 24-25]，然而其機制目前仍不明確，需要進一步的研究。我們的研究已經證實，糖尿病小鼠胰腺中高表達SphK1，這提示S1P可能參與了糖尿病相關胰腺纖維化的發生，接下來的實驗我們還將探討S1P是通過與S1PRs結合參與胰腺纖維化的發生還是作為第二信使直接在細胞內發揮作用的。我們的實驗已經表明，在糖尿病小鼠胰腺中SphK1、TGF-β1、胰腺星狀細胞活化的標志物α-SMA以及反映細胞外基質水平的Colα1(I)及Colα1(III)水平都明顯增加，S1P參與這一過程是否通過其受體發揮作用呢？是否為TGF-β1誘導SphK1激活從而促進胰腺星狀細胞活化促進膠原產生呢？此外，在胰腺星狀細胞活化過程中，是否還有其他調控因子參與了高糖誘導SphK1表達的過程？這些問題尚需進一步深入研究。

目前，仍然缺乏有效的治療纖維化的方法。纖維組織一旦形成，很難修復成正常組織。因此，越來越多的研究致力于如何預防或減慢纖維化疾病發展及阻斷纖維化之前上游生物學過程。大量的體外和體內實驗表明，S1P及其信號通路參與了多種組織纖維化的發展。此外，S1P和相關的信號通路構成了復雜的信號網絡，并具有許多信號通路，例如炎癥，凋亡和自噬，并調節纖維化的發展[4]。但是，目前的研究尚未完全闡明S1P作用的機制和相關的纖維化信號傳導途徑，它們在不同器官和物種中的作用不同，需要進一步研究。此外，S1P的干預和相關的信號通路是與纖維化有關的疾病的潛在治療方法，S1P也有望在將來成為纖維化疾病嚴重程度的有效生物標志物。