七氟醚預(yù)處理對(duì)老年大鼠認(rèn)知功能障礙的影響及海馬區(qū)自噬在其中的作用研究

謝 翼，王 凱，牛 敏

(1.山東省淄博市中心醫(yī)院，山東 淄博 255034； 2.山東省日照市人民醫(yī)院， 山東 日照 276800)

術(shù)后認(rèn)知功能障礙(postoperative cognitive dysfunction, POCD)是老年病人手術(shù)后出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，表現(xiàn)為精神錯(cuò)亂、焦慮、人格的改變以及記憶受損。目前POCD機(jī)制尚未明了，研究方向主要集中在中樞膽堿能系統(tǒng)功能障礙、炎癥反應(yīng)、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等領(lǐng)域[1-2]。

自噬(autophagy)是細(xì)胞內(nèi)容物分解代謝的過(guò)程，作為一種高度調(diào)節(jié)的細(xì)胞機(jī)制，與多種疾病的生理病理情況有關(guān)[3]。近年來(lái)研究表明[4-5]，上調(diào)自噬水平可能保護(hù)神經(jīng)退行性變，調(diào)節(jié)自噬可能成為治療阿爾茨海默病、亨廷頓病和帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的新策略。還有研究表明，麻醉誘導(dǎo)應(yīng)激可能導(dǎo)致海馬水平的改變和認(rèn)知障礙[6]。本實(shí)驗(yàn)將老年大鼠暴露于七氟醚后，采用Morris水迷宮，Western blot檢測(cè)自噬及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)等方法，證實(shí)了海馬區(qū)自噬在七氟醚麻醉誘導(dǎo)的神經(jīng)退行性變中起作用，為POCD的治療提供了一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)及理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

72只SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，20月齡，體重550～750 g，購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖有限公司[SCXK(魯)2019-0011]。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)在淄博市中心醫(yī)院[SYXK(魯)2017-0023)]一周，室溫(22±2)℃，所有大鼠均自由攝食、飲用蒸餾水，維持12 h光照和12 h黑暗交替循環(huán)的環(huán)境。本研究獲得本院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(20190623)，依據(jù)3R原則進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑與儀器

七氟醚(山東，魯南貝特制藥有限公司)；雷帕霉素、氯喹(美國(guó)，Sigma公司)；p-mTOR、mTOR、Bcl-2、Cl-Caspase3、p-S6K1、S6K1抗體(美國(guó)，Novus Biologicals公司)；Bax、p62抗體(美國(guó)，Abcam公司)；TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測(cè)試劑盒(南京，凱基生物工程公司)； Maxima SYBR Green及cDNA 合成試劑盒(美國(guó)，Thermo 公司)；透射電子顯微鏡(日本，HT7800)；電泳儀(北京六一，DYCZ-24DN)；血?dú)夥治鰞x(丹麥，ABL80)；大鼠Morris水迷宮(上海欣軟，water Maze)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及模型建立

大鼠隨機(jī)分為6組(每組12只)：對(duì)照組(CON)、雷帕霉素組(RAP)、氯喹組(CQ)、七氟醚組(SEV)、七氟醚+雷帕霉素組(SEV+RAP)、七氟醚+氯喹組(SEV+CQ)。雷帕霉素和氯喹分別用二甲基亞砜溶解并稀釋制成25 mg/mL的溶液，再用5%的聚乙二醇400和5%吐溫80溶液進(jìn)一步稀釋成10 mg/mL的溶液。RAP與SEV+RAP組于麻醉前靜脈注射20 mg/(kg·d)的雷帕霉素，CQ和SEV+CQ組于麻醉前靜脈注射20 mg/(kg·d)氯喹，均連續(xù)7 d。CON和SEV組靜脈注射等體積的空白溶劑。大鼠放入麻醉箱后，SEV、SEV+RAP與SEV+CQ組開(kāi)啟2%七氟醚和30% O2混合氣，連續(xù)麻醉5 h；CON、RAP與CQ組大鼠開(kāi)啟30% O2連續(xù)5 h。

1.3.2 生理指標(biāo)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，每組隨機(jī)選3只大鼠抽取1 mL動(dòng)脈血，使用血?dú)夥治鰞x觀察pH值、PaCO2、PaO2、SaO2及血糖指標(biāo)變化。

1.3.3 行為學(xué)測(cè)試

七氟醚暴露24 h后，采用Morris水迷宮測(cè)試大鼠的空間記憶能力，平臺(tái)(直徑10 cm)固定在游泳池的四個(gè)象限之一。連續(xù)訓(xùn)練5 d，每天4次。將平臺(tái)被淹沒(méi)在水下1 cm處，每一次實(shí)驗(yàn)時(shí)，觀察大鼠在水中找到平臺(tái)并爬上平臺(tái)的時(shí)間，記為逃避潛伏期；如果在120 s內(nèi)不能找到平臺(tái)，則人為將其引導(dǎo)到平臺(tái)，并停留10 s，將逃避潛伏期記為120 s；當(dāng)老鼠到達(dá)平臺(tái)時(shí)，他們被允許在上面休息30 s；記錄找到隱藏平臺(tái)所需的時(shí)間(逃避潛伏期)。四次的平均時(shí)間為大鼠當(dāng)日的結(jié)果。每次實(shí)驗(yàn)后，老鼠被擦干，然后放回籠子。第5天，在去除平臺(tái)后進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，記錄120 s內(nèi)老鼠穿過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)和在目標(biāo)象限的停留時(shí)間。

1.3.4 取材

Morris水迷宮測(cè)試結(jié)束后，將所有大鼠麻醉處死，每組將3只大鼠取出全腦，切除腦海馬組織，左側(cè)用于TEM觀察，右側(cè)用于TUNEL分析。其它9只大鼠快速剝離海馬，切除雙側(cè)海馬組織，迅速置于液氮冷凍，用于Western blot和RT-qPCR分析。

1.3.5 TEM觀察海馬神經(jīng)元自噬

取左側(cè)海馬組織，置于2.5%戊二醛中，4℃固定過(guò)夜，磷酸緩沖鹽沖洗三次，1%鋨酸固定2 h，水沖洗，常規(guī)脫水，包埋，切片，經(jīng)4%乙酸鈾染色20 min、0.5%檸檬酸鉛染色5 min，鏡下觀察海馬神經(jīng)元自噬體。

1.3.6 TUNEL法檢測(cè)海馬細(xì)胞凋亡

按TUNEL試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，于顯微鏡下觀察，計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)的凋亡細(xì)胞(凋亡細(xì)胞細(xì)胞核呈棕色)及細(xì)胞總數(shù)，其比值即為相對(duì)細(xì)胞凋亡率[7]。

1.3.7 RT-qPCR檢測(cè)海馬組織中LC3 mRNA表達(dá)

取海馬組織[8]，加入TRIzol試劑提取待測(cè)組織總RNA，以提取的總RNA為模板按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明合成cDNA，取 2 μL cDNA用于 RT-qPCR 反應(yīng)。β-actin上游引物：5’-AGCACAGAGCCTCGC CTTT-3’；下游引物：5’-AGGGTGAGGATGCCTCTC TT-3’；LC3上游引物5’-AGCAGCATCCAACCA AAATC-3’； 下游引物：5’-CTGTGTCCGTTC ACCAACAG-3’)，以β-actin作為內(nèi)參，根據(jù)公式mRNA=2-△△Ct計(jì)算分析海馬組織中基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3.8 Western blot法檢測(cè)海馬組織中p-S6K1、Cl-Caspase3、p62、p-mTOR、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平

取50 mg海馬組織加入適量的RIPA裂解液，勻漿后，離心10 min，收集上清液，BCA試劑盒檢測(cè)總蛋白濃度。然后上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，加一抗4℃孵育過(guò)夜，加二抗37℃孵育2 h，TBST漂洗，ECL顯色。采用Image圖像軟件對(duì)蛋白質(zhì)條帶進(jìn)行分析，目的蛋白與β-actin密度的比值作為目的蛋白的相對(duì)含量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組生理指標(biāo)分析結(jié)果

在七氟醚麻醉或假暴露結(jié)束時(shí)，對(duì)每組3只大鼠的動(dòng)脈血樣進(jìn)行血?dú)饧把欠治觥Ｅc對(duì)照組比較，其余實(shí)驗(yàn)組血樣中pH、PaCO2、PaO2、葡萄糖、SaO2值無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.2 Morris水迷宮測(cè)試各組大鼠行為學(xué)結(jié)果

與CON組比較，SEV組大鼠逃避潛伏期延長(zhǎng)(P<0.01)，目標(biāo)象限時(shí)間百分比下降(P<0.05)，穿越平臺(tái)次數(shù)減少(P<0.01)；與SEV組比較，SEV+RAP組逃避潛伏期縮短，目標(biāo)象限時(shí)間百分比增加、穿越平臺(tái)次數(shù)增加(P<0.05)；而SEV+CQ組逃避潛伏期延長(zhǎng)，目標(biāo)象限時(shí)間百分比下降、穿越平臺(tái)次數(shù)減少減少(P<0.05)；CON和RAP組、CON和CQ組大鼠逃避潛伏期、目標(biāo)象限時(shí)間百分比、穿越平臺(tái)次數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)圖1A、1B、1C。

表1 各組老年大鼠動(dòng)脈血?dú)獗容^Table 1 Comparison of arterial blood gas of aged rats in each group

2.3 TEM觀察大鼠海馬神經(jīng)元自噬變化

與CON組比較，RAP、CQ及SEV組的海馬神經(jīng)元自噬泡數(shù)量增加(P<0.05)；與SEV組比較，SEV+RAP和SEV+CQ組自噬泡數(shù)量也增加(P<0.05)，CQ和SEV+CQ兩組間自噬泡數(shù)量無(wú)顯著性差異(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

2.4 TUNEL法染色觀察神經(jīng)元凋亡情況

與CON比較，SEV組細(xì)胞凋亡率增加(P<0.01)，RAP、CQ組無(wú)顯著差異(P>0.05)；與SEV比較，SEV+CQ組的細(xì)胞凋亡率增加，SEV+RAP組降低(P< 0.05)，見(jiàn)圖3。

2.5 RT-qPCR檢測(cè)大鼠LC3 mRNA的表達(dá)

與CON組比較，RAP組 LC3 mRNA表達(dá)水平升高(P< 0.01)；與SEV組比較，SEV+RAP組 LC3 mRNA表達(dá)水平升高(P< 0.01)，見(jiàn)圖4。

2.6 Westernblot檢測(cè)海馬p62、Bcl-2、Cl-caspase-3、Bax、p-mTOR、p-S6K1蛋白表達(dá)

與CON組比較，SEV組的p62、Cl-caspase-3和Bax表達(dá)升高(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)降低(P<0.01)。與SEV組比較，SEV+RAP組p62、Cl-caspase-3和Bax表達(dá)降低(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)升高(P<0.01)，p-mTOR、p-S6K1表達(dá)下降(P<0.01)，而SEV+CQ組p62、Cl-caspase-3和Bax 表達(dá)升高(P<0.05)，Bcl-2表達(dá)降低(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

注：與七氟醚組比較，**P<0.01，*P<0.05；與對(duì)照組比較，#P>0.05。下同。圖1 各組大鼠行為學(xué)結(jié)果Note. Compared with SEV group, **P<0.01,*P<0.05. Compared with CON group,#P>0.05. The same as below.Figure 1 Behavioral results of rats in each group

圖2 各組大鼠海馬神經(jīng)元自噬泡數(shù)量比較Figure 2 Comparison of autophagy of hippocampal neurons in each group

圖3 各組大鼠海馬細(xì)胞凋亡率Figure 3 Apoptosis ratio of cells in the hippocampus of rats in each group

圖4 七氟醚麻醉后大鼠海馬LC3 mRNA表達(dá) 情況Figure 4 Effect of sevoflurane anesthesia on LC3 mRNA expression in rats

圖5 七氟醚麻醉后對(duì)大鼠海馬區(qū)相關(guān)因子表達(dá)的 影響Figure 5 Effects of sevoflurane anesthesia on the expression of related factors in hippocampus of rats

3 討論

POCD是術(shù)后出現(xiàn)的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，盡管人們已經(jīng)普遍認(rèn)識(shí)到POCD的危害性，但其具體的發(fā)病機(jī)制、病理生理還未被闡明。七氟醚是臨床常用的吸入性麻醉藥，對(duì)術(shù)后認(rèn)知功能有影響，但發(fā)生機(jī)制尚不明確。研究表明，七氟醚吸入麻醉引起老年患者POCD發(fā)生率高于靜脈注射異丙酚的老年患者[8]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠生理指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，各實(shí)驗(yàn)組生理指標(biāo)值均無(wú)顯著性差異(P>0.05)，這說(shuō)明七氟醚預(yù)處理對(duì)大鼠生理改變無(wú)明顯影響。

由于雄性大鼠比較強(qiáng)壯，雌性體質(zhì)相對(duì)比較弱，容易有別的因素(吃的食物，生活環(huán)境等)干擾實(shí)驗(yàn)效果，因此選擇雄性大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。海馬組織主要負(fù)責(zé)存儲(chǔ)信息，是人學(xué)習(xí)和記憶的關(guān)鍵功能區(qū)認(rèn)知區(qū)域之一。病理研究表明，當(dāng)發(fā)生輕度認(rèn)知功能障礙時(shí)，海馬具有神經(jīng)可塑性[9]。Morris水迷宮是研究海馬空間學(xué)習(xí)記憶的重要評(píng)估工具[10]。本實(shí)驗(yàn)水迷宮結(jié)果顯示，七氟醚麻醉后老年大鼠出現(xiàn)了認(rèn)知障礙，而RAP、CQ組大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力無(wú)明顯差別，提示RAP、CQ分別單獨(dú)給藥對(duì)老年大鼠認(rèn)知功能無(wú)影響。與SEV組比較，SEV+RAP組大鼠認(rèn)知障礙明顯改善，說(shuō)明雷帕霉素治療可以改善七氟醚引起的認(rèn)知障礙。而SEV+CQ組則進(jìn)一步加劇了七氟醚誘導(dǎo)引起的認(rèn)知功能障礙，提示七氟醚麻醉導(dǎo)致大鼠空間記憶的損害可能與海馬自噬有關(guān)。

自噬是細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下再利用的重要分解代謝過(guò)程，在維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)和應(yīng)激狀態(tài)下保留細(xì)胞生存能力方面發(fā)揮重要作用[11]。微管相關(guān)蛋白輕鏈3(LC3)是存在于哺乳動(dòng)物體內(nèi)的自噬基因，其表達(dá)水平在某種程度上反映了細(xì)胞的自噬活性[12]；p62包含多種蛋白作用域，可結(jié)合聚泛素化蛋白并將其進(jìn)一步降解，通常細(xì)胞內(nèi) P62 蛋白的水平與自噬活性的強(qiáng)弱呈負(fù)相關(guān)性[13-14]。Western blot結(jié)果顯示，與CON組相比，SEV組p62蛋白表達(dá)上升(P<0.05)，而SEV+RAP組p62表達(dá)低于SEV組(P<0.05)，這說(shuō)明七氟醚能抑制老年大鼠自噬通道。同時(shí)TEM觀察顯示，SEV+CQ、SEV+RAP組的自噬泡數(shù)量高于SEV組，而CQ和SEV+CQ組的自噬泡數(shù)量則無(wú)顯著性差異，這些證據(jù)進(jìn)一步表明七氟醚誘導(dǎo)老年大鼠海馬自噬受損。RT-qPCR結(jié)果顯示，CQ組及SEV+CQ組對(duì)LC3 mRNA影響不大，但雷帕霉素(RAP)提高了LC3 mRNA水平，且TUNEL法觀察發(fā)現(xiàn)SEV+RAP組海馬神經(jīng)元凋亡率較SEV組下降(P<0.05)，這說(shuō)明雷帕霉素上調(diào)LC3 mRNA表達(dá)從而增加自噬活性，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，阻止細(xì)胞凋亡。mTOR是一個(gè)重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在進(jìn)化上非常保守，它對(duì)細(xì)胞自噬起著負(fù)調(diào)控作用，而S6K1是mTOR下游效應(yīng)分子之一。Westernblot結(jié)果顯示，與CON組相比，RAP顯著抑制p-mTOR及其下游p-S6K1表達(dá)(P<0.01)，而SEV+RAP組p-mTOR和p-S6K1表達(dá)較SEV組表達(dá)下調(diào)，我們推測(cè)雷帕霉素可能通過(guò)抑制mTOR途徑減少p-S6K1的積累，增強(qiáng)了自噬，而SEV可能通過(guò)激活mTOR通路，起到抑制自噬的作用。

研究指出，七氟醚麻醉可以引起老年大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中未折疊蛋白的過(guò)度積累會(huì)引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，損傷細(xì)胞器，誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序[15]。Bcl 2蛋白家族和胱天蛋白酶(Caspase)家族在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用，其中Bcl 2抑制細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)ax為促凋亡因子，Caspase-3是凋亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中處于核心地位的蛋白，通過(guò)三者表達(dá)的變化可判斷細(xì)胞凋亡[16]。Western blot結(jié)果顯示，七氟醚麻醉后大鼠Bcl-2水平顯著降低，Caspase-3和Bax水平顯著升高，TUNEL法染色觀察到七氟醚麻醉后海馬相對(duì)細(xì)胞凋亡率明顯增加，驗(yàn)證了七氟醚麻醉能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；而雷帕霉素預(yù)給藥后，與SEV組大鼠比較，Bcl-2水平顯著升高，Caspase-3、Bax水平及細(xì)胞凋亡率均明顯降低，提示自噬可能通過(guò)阻斷凋亡，從而促進(jìn)細(xì)胞存活。

綜上所述，七氟醚麻醉后可顯著損害老年大鼠記憶能力，誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元凋亡，而聯(lián)合雷帕霉素治療則可以改善七氟醚誘導(dǎo)的自噬通道受損。這些發(fā)現(xiàn)表明，七氟醚麻醉導(dǎo)致老年大鼠認(rèn)知功能障礙與海馬神經(jīng)元的自噬受損有關(guān)。