咪唑安定通過(guò)上調(diào)miR-290-5p調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路抑制缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制研究

江婷婷，馬興華

(西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬三二〇一醫(yī)院麻醉科， 陜西 漢中 723000)

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

大鼠心肌細(xì)胞H9C2購(gòu)自中田科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青鏈霉素混合液購(gòu)于武漢普諾賽生命科技有限公司；咪唑安定(批號(hào)：20111005)購(gòu)于徐州恩華藥業(yè)集團(tuán)有限責(zé)任公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit 8，CCK-8)購(gòu)于北京百奧萊博科技有限公司；膜聯(lián)蛋白V異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(Annexin V-FITC/PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于南京諾唯贊生物科技有限公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒購(gòu)于大連寶生物工程有限公司；miR-290-5p模擬物(miR-290-5p mimics)及其陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-290-5p抑制物(anti-miR-290-5p)及其陰性對(duì)照(anti-miR-NC)、PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司提供；兔源細(xì)胞周期素D1(cyclinD1)抗體、兔源活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Cleaved caspase 3，C-caspase-3)抗體、兔源β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、兔源磷酸化的磷脂酰肌醇-3-羥激酶(p-PI3K)抗體和兔源磷酸化的蛋白激酶B(p-AKT)抗體購(gòu)于美國(guó)CST公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)和模型構(gòu)建

H9C2細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和1%青鏈霉素溶液)培養(yǎng)，置于37℃缺氧培養(yǎng)箱(含1% O2、5% CO2、94% N2)內(nèi)培養(yǎng)48 h構(gòu)建心肌細(xì)胞缺氧損傷模型[8]。

1.3.2 MID對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞存活、凋亡以及miR-290-5p表達(dá)的影響

(1)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞存活

將H9C2細(xì)胞(每孔5×103cells)接種到96孔板并分為正常(NC)組、缺氧(hypoxia)組、MID+hypoxia組(分別采用終濃度為8、16、32 μmol/L的MID處理心肌細(xì)胞后進(jìn)行缺氧處理)。各組細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)處理后，每孔加入10 μL的CCK-8試劑，培養(yǎng)箱孵育4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的吸光度值。確定用藥濃度為16 μmol/L。

(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

收集NC組、hypoxia組、MID+hypoxia組H9C2細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，采用結(jié)合緩沖液調(diào)整為單細(xì)胞懸液。取100 μL細(xì)胞懸液(1×105cells/mL)加入流式管，按照Annexin V-FITC/PI試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

(3)RT-qPCR檢測(cè)miR-290-5p的表達(dá)水平

收集NC組、hypoxia組、MID+hypoxia組H9C2細(xì)胞，PBS洗滌細(xì)胞2次，TRIzol法提取各組細(xì)胞的總RNA，隨后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和RT-qPCR反應(yīng)。miR-290-5p的表達(dá)以U6為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt法計(jì)算其表達(dá)水平。引物序列如下(5’-3’)：miR-290-5p上游引物：GCTGGGTTTCACGGGGGTATCAA，下游引物：TCAACTGAGTGCCGTAGGGTGCG；U6上游引物：CTCGCTTCGGCAGCACATATACT，下游引物：ACGC TTCACGAATTTGCGTGTC。

(4)Western blot檢測(cè)Cleaved-caspase-3的表達(dá)水平

收集NC組、hypoxia組、MID+hypoxia組H9C2細(xì)胞，采用RIPA裂解液獲得各組細(xì)胞蛋白。將細(xì)胞蛋白與適量上樣緩沖液混合煮沸變性后，取適量樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。隨后利用濕法轉(zhuǎn)膜裝置將分離的細(xì)胞蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。5%的脫脂牛奶封閉膜后，采用PBS液洗膜3次，將膜置于稀釋的一抗溶液中4℃孵育過(guò)夜，PBS液洗膜3次，將膜置于稀釋的二抗溶液中室溫孵育1 h，PBS液洗膜3次，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色。以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參β-actin蛋白灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。

1.3.3 過(guò)表達(dá)miR-290-5p對(duì)心肌細(xì)胞存活和凋亡的影響

將H9C2細(xì)胞分為miR-NC+hypoxia組(轉(zhuǎn)染miR-NC 48 h后進(jìn)行缺氧誘導(dǎo))、miR-290-5p+hypoxia組(轉(zhuǎn)染miR-290-5p mimics 48 h后進(jìn)行缺氧誘導(dǎo))。按照上述步驟檢測(cè)各組細(xì)胞的存活、凋亡以及CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)情況。

1.3.4 MID調(diào)控miR-290-5p表達(dá)對(duì)缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的影響

將H9C2細(xì)胞分為anti-miR-NC+MID+hypoxia組(轉(zhuǎn)染anti-miR-NC 48 h后，進(jìn)行MID干預(yù)和缺氧處理)、anti-miR-290-5p+MID+hypoxia組(轉(zhuǎn)染anti-miR-290-5p 48 h后，進(jìn)行MID干預(yù)和缺氧處理)，按照上述步驟檢測(cè)各組細(xì)胞的存活、凋亡以及CyclinD1和Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)情況。

1.3.5 MID調(diào)控miR-290-5p表達(dá)對(duì)缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

收集NC組、hypoxia組、MID+hypoxia組、anti-miR-NC+MID+hypoxia組、anti-miR-290-5p+MID+hypoxia組H9C2細(xì)胞，按照上述Western blot步驟檢測(cè)各組細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白p-PI3K和p-AKT的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

表1 不同濃度MID對(duì)心肌細(xì)胞H9C2增殖的 影響Table 1 Effect of different concentrations of MID on the proliferation of cardiomyocyte H9C2

2 結(jié)果

2.1 不同濃度MID對(duì)心肌細(xì)胞H9C2增殖的影響

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，見(jiàn)表1，與NC組比較，hypoxia組H9C2細(xì)胞存活率顯著降低；與hypoxia組比較，8 μmol/L MID+hypoxia組、16 μmol/L MID+hypoxia組、32 μmol/L MID+hypoxia組細(xì)胞存活率顯著升高(P<0.05)。隨著MID濃度增加，H9C2細(xì)胞存活率呈先升高再降低趨勢(shì)，選擇16 μmol/L的MID進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 MID對(duì)心肌細(xì)胞H9C2凋亡的影響

流式細(xì)胞術(shù)和Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，見(jiàn)圖1和表2，與NC組比較，hypoxia組H9C2細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高；與hypoxia組比較，MID+hypoxia組細(xì)胞凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)。

2.3 MID對(duì)miR-290-5p表達(dá)的影響

RT-qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，見(jiàn)表3，與NC組比較，hypoxia組H9C2細(xì)胞miR-290-5p的表達(dá)顯著降低；與hypoxia組比較，MID+hypoxia組H9C2細(xì)胞中miR-290-5p的表達(dá)顯著升高(P<0.05)。

2.4 高表達(dá)miR-290-5p對(duì)心肌細(xì)胞H9C2增殖、凋亡的影響

結(jié)果見(jiàn)表4和圖2，與miR-NC+hypoxia組比較，miR-290-5p+hypoxia組H9C2細(xì)胞miR-290-5p和CyclinD1蛋白的表達(dá)水平、細(xì)胞存活率顯著升高，Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。

注：A：流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡；B：Western blot檢測(cè)Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)。圖1 MID對(duì)心肌細(xì)胞H9C2凋亡的影響Note. A, Flow cytometry to detect apoptosis. B, Western blot detection of Cleaved-caspase-3 protein expression.Figure 1 Effect of MID on apoptosis of cardiomyocyte H9C2

表2 MID對(duì)心肌細(xì)胞H9C2凋亡的影響

表4 高表達(dá)miR-290-5p對(duì)心肌細(xì)胞H9C2增殖、凋亡的影響Table 4 Effect of high expression of miR-290-5p on proliferation and apoptosis of cardiomyocyte H9C2

2.5 低表達(dá)miR-290-5p可以部分逆轉(zhuǎn)MID對(duì)心肌細(xì)胞H9C2增殖和凋亡的影響

見(jiàn)圖3和表5，與anti-miR-NC+MID+hypoxia組比較，anti-miR-290-5p+MID+hypoxia組H9C2細(xì)胞miR-290-5p和CyclinD1蛋白的表達(dá)水平、細(xì)胞存活率顯著降低，Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)。

2.6 PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

見(jiàn)圖4和表6，與NC組比較，hypoxia組H9C2細(xì)胞p-PI3K和p-AKT的表達(dá)水平顯著降低；與hypoxia組比較，MID+hypoxia組H9C2細(xì)胞p-PI3K和p-AKT的表達(dá)水平顯著升高；與anti-miR-NC+MID+hypoxia組比較，anti-miR-290-5p+MID+hypoxia組H9C2細(xì)胞p-PI3K和p-AKT的表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。

3 討論

缺氧是心肌梗死的主要危險(xiǎn)之一。缺氧狀態(tài)下，心肌細(xì)胞線粒體功能異常，能量代謝紊亂，同時(shí)引起大量的生理和病理反應(yīng)，引起心肌細(xì)胞損傷和凋亡[9]。因此，如何減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和凋亡對(duì)防治心肌梗死具有重要意義。

表3 MID對(duì)miR-290-5p表達(dá)的影響Table 3 Effect of MID on miR-290-5p expression

圖2 Western blot檢測(cè)CyclinD1、 Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)Figure 2 Western blot detects expression of CyclinD1, Cleaved-caspase-3 protein

圖3 低表達(dá)miR-290-5p可以部分逆轉(zhuǎn)MID對(duì)H9C2心肌細(xì)胞 CylinD1和Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)的影響Figure 3 Low expression of miR-290-5p can partially reverse the effect of MID on the expression of CylinD1 and Cleaved-caspase-3 in cardiomyocytes H9C2

表5 低表達(dá)miR-290-5p可以部分逆轉(zhuǎn)MID對(duì)心肌細(xì)胞H9C2增殖、凋亡的影響Table 5 Low expression of miR-290-5p can partially reverse the effect of MID on the proliferation and apoptosis of cardiomyocyte H9C2

圖4 Western blot檢測(cè)p-PI3K、p-AKT蛋白的表達(dá)Figure 4 Western blot detects p-PI3K, p-AKT protein expression

長(zhǎng)期以來(lái)，MID被認(rèn)為對(duì)心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。劉保江等[10]研究發(fā)現(xiàn)MID預(yù)處理可改善心臟收縮和舒張功能，減輕再灌注心律失常發(fā)生頻率，提高心肌細(xì)胞抗氧化能力，降低脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，減輕心肌細(xì)胞損傷程度。覃軍等[11]指出MID缺氧前預(yù)處理可明顯增高心肌組織及血漿中血管

表6 PI3K/AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)Table 6 Expression of PI3K/AKT signaling pathway related proteins

內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)量，對(duì)改善缺血心肌功能具有積極作用。本研究發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率和促凋亡蛋白表達(dá)水平均顯著升高，說(shuō)明缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型建立成功。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)一定濃度的MID預(yù)處理可改善缺氧誘導(dǎo)對(duì)心肌細(xì)胞的存活抑制作用，并減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，與前人研究結(jié)論相吻合[5, 10-11]。以上研究說(shuō)明，MID預(yù)處理通過(guò)抑制缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，提高心肌細(xì)胞存活率，對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用。

miR-290-5p是miR-290-295簇的成員之一，研究顯示miR-290-295在小鼠胚胎干細(xì)胞中具有潛在的促生存功能，其表達(dá)缺失可導(dǎo)致小鼠部分胚胎致死和生殖細(xì)胞缺陷[12]。此外，miR-290-295簇還可促進(jìn)細(xì)胞G1期向S轉(zhuǎn)換，加速細(xì)胞增殖，在防止小鼠胚胎干細(xì)胞凋亡中發(fā)揮保護(hù)作用[13]。然而，miR-290-5p在缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中的作用尚未可知。本研究顯示缺氧誘導(dǎo)后心肌細(xì)胞miR-290-5p的表達(dá)顯著降低，而咪唑安定預(yù)處理可提高缺氧誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞miR-290-5p表達(dá)水平。進(jìn)一步功能分析顯示，過(guò)表達(dá)miR-290-5p可提高缺氧誘導(dǎo)下心肌細(xì)胞存活率，降低缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，并升高促增殖蛋白CyclinD1、降低促凋亡蛋白Cleaved-caspase-3的表達(dá)水平，與MID預(yù)處理對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用相同。此外，本研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-290-5p表達(dá)還可部分逆轉(zhuǎn)MID對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞和存活抑制的影響。以上研究說(shuō)明上調(diào)miR-290-5p是MID對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷發(fā)揮保護(hù)作用的重要機(jī)制。

PI3K/AKT信號(hào)通路的激活在缺氧缺血損傷后心臟保護(hù)中起著關(guān)鍵作用[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-181c、miR-335等多種miRNA通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路改善心肌缺血復(fù)氧損傷[16-17]。本研究顯示MID預(yù)處理可減輕缺氧誘導(dǎo)對(duì)PI3K/AKT信號(hào)通路的抑制作用，而抑制miR-290-5p表達(dá)則部分逆轉(zhuǎn)MID對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路活化的影響。提示MID通過(guò)上調(diào)miR-290-5p激活I(lǐng)3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)而對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述，本研究證實(shí)MID通過(guò)上調(diào)miR-290-5p可減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌細(xì)胞存活，對(duì)缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制與激活PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)，這為MID在臨床預(yù)防缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷中應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。