鈣化性主動脈瓣膜病小鼠模型比較及應用研究進展

宗永輝，劉新燦

(1.河南中醫藥大學,鄭州 450000； 2.河南中醫藥大學第一附屬醫院,鄭州 450000)

鈣化性主動脈瓣膜病(calcific aortic valve disease, CAVD)是指由早期未發生血液動力學影響的瓣膜硬化逐漸發展到需要瓣膜置換術的嚴重鈣化性主動脈瓣狹窄(aortic valve stenosis,AS)的進展性疾病[1]，其主要特征為炎癥，纖維化和鈣化[2]。在發達國家，鈣化主動脈瓣疾病是成年人主動脈瓣狹窄最常見的病因，并且患病率隨著年齡的增加呈非線性增長[3]。我國一項針對老年瓣膜性心臟病住院患者診療狀況的研究結果顯示，鈣化性主動脈狹窄患者占比18.99%[4]。隨著醫療衛生條件的提升以及人口老齡化的顯著，鈣化性主動脈瓣膜病的發病率將逐年上升。目前對鈣化性主動脈瓣狹窄的藥物治療未顯示出可減輕進行性瓣膜鈣化或改善生存率，癥狀嚴重者主要通過外科手術和內科介入干預[5]。所以明確鈣化性瓣膜病的發病機制，進行早期干預，延緩發病進程，是現在社會面臨的重大課題。

對瓣膜病的的發病機制的認識從以往的隨著年齡增長的被動性退化現象轉變為主動性的類似“動脈粥樣硬化”病變[2]，這一里程碑式的研究重新引起了對鈣化性瓣膜病研究的熱潮。根據臨床上對疾病發病機制的認識，再轉移到動物實驗給與驗證，是我們研究鈣化性瓣膜病的主要方法。在實驗研究中，雖然體外實驗可以觀察到對細胞因子的影響，但無法發觀察到病理生理學的代償反應；并且瓣膜所處解剖位置和環境的特殊性和復雜性，因此整體動物實驗更能合適對瓣膜病機制的研究[6]。目前動物造模方法較多[7-8]，使用的動物也不相同，如小鼠、兔、豬等。其中最常用的是小鼠模型，首先是它們的體型小，便于飼養和管理，并且具有經濟成本低等優勢；其次是較短的繁殖周期、遺傳操作的簡便性以及基因圖譜的全面性使得對CAVD的關鍵分子介體的具體研究成為可能。本文主要針對鈣化性主動脈瓣狹窄的模型優缺點及進展現進行綜述，總結見表1。

1 飲食誘導模型

1.1 高膽固醇飲食法

臨床證據表明，冠狀動脈粥樣硬化和主動脈瓣狹窄具有相似的流行病學危險因素，例如年齡，性別，高膽固醇血癥和高血壓[9-11]。對人類狹窄主動脈瓣的臨床病理研究發現，病變與包含炎性細胞和鈣化沉積物的動脈粥樣硬化斑塊相似[12-13]。臨床前研究進一步證實了在兔和小鼠動脈粥樣硬化模型中主動脈瓣小葉中的動脈粥樣硬化樣病變[14-15]。因此，動脈粥樣硬化模型常被借鑒到主動脈瓣狹窄的實驗研究。

標準飲食條件下野生型小鼠(WT)不會自發主動脈瓣鈣化，因此需要高脂飲食或者基因敲除等方式干預。低密度脂蛋白受體 (LDLR) 是肝細胞膜上一種鑲嵌式蛋白，能介導LDL和VLDL的胞吞作用，低密度脂蛋白受體缺陷(LDLr-/-)小鼠可引起內源性膽固醇升高常被應用于鈣化性瓣膜病模型的建立。C57BL/6J背景的低密度脂蛋白受體缺陷(LDLr-/-)雄性小鼠常規飲食17～22個月時，會自發出現輕度高膽固醇血癥、瓣口直徑急劇縮小、跨瓣膜收縮壓梯度升高以及左心室肥厚等早期瓣膜硬化表現[16]。Towler等[17]應用特制飲食中脂肪含量為總熱量的42%并含有0.15%膽固醇和0.5%的膽酸鹽的飼料喂食17周后，出現嚴重的膽固醇血癥(1040±37)，高血糖和瓣膜礦物質沉積以及骨橋蛋白(osteopontin，OPN)的表達。

載脂蛋白E(ApoE)是VLDL受體的配體，也是肝細胞CM殘粒受體的配體，載脂蛋白E缺陷(apoE-/-)同樣引起內源性膽固醇升高。在沒有飲食干預條件下，半數以上的apoE-/-小鼠在超過43周齡時主動脈流速快于150 cm/s，最高可達427 cm/s，其中伴有少數主動脈反流，并且與性別無相關性；Von Kossa染色在97周齡主動脈瓣中顯示出異位鈣化[15]，這與人主動脈瓣狹窄病程相似。在apoE-/-小鼠10周齡時給予脂肪含量為總熱量的42%并含有0.2%膽固醇的飲食，30周齡時血清膽固醇明顯增加至588 mg/dL，小葉增厚，內皮細胞活化，以及富含巨噬細胞的內皮下病變；在病變區域能夠檢測到組織蛋白酶B，α平滑肌肌動蛋白(αSMA)，堿性磷酸酶，Runx2和OPN mRNA表達[18]，雖然沒有von Kossa染色的證據表明有鈣鹽沉積，但通過雙膦酸鹽結合的成像顆粒顯示出早期微鈣化的跡象，表明該飲食模式可導致加速早期疾病形成。

模型評價：該模型優點是操作簡單，明顯的缺陷是在單純飲食干預下造模周期較長，模型成功率低；聯合基因敲除雖然能夠明顯縮短主動脈狹窄模型的建立時間，但不可避免的出現嚴重的高膽固醇血癥，導致小鼠過早死亡，并且這與人瓣膜病發病時輕度高膽固醇血癥不符。以往臨床研究表明他汀類藥物對主動脈瓣狹窄沒有明顯的療效[19-22]，動物實驗研究表明在早期進行他汀藥物的干預可延緩疾病的進展[14,23]。因此，該模型可適用于明確高膽固醇血癥在主動脈瓣膜狹窄進展中的作用以及他汀類藥物對瓣膜病的影響研究。

1.2 高脂飲食法

許多研究表明以胰島素抵抗/2型糖尿病(T2D)為特征的代謝異常狀態在CAVD的發生和進展中起重要作用[24-25]。Towler等[17]在一項關于糖尿病對血管鈣化的研究中，低密度脂蛋白受體缺陷(LDLr-/-)小鼠給予總熱量的 58%來自脂肪而沒有添加膽固醇的食物，喂食2周后膽固醇出現明顯變化，17周后血清膽固醇水平較正常飲食組升高62%，并出現高血糖，高胰島素血癥和肥胖癥，von Kossa染色發現主動脈瓣小葉上礦物質沉積。Drolet等[26]采用同樣的喂養模式喂食C57BL/6J背景的雄性小鼠，4個月后出現輕度高膽固醇血癥，肥胖和高血糖癥；超聲心動圖檢測主動脈瓣面積(aortic valve area，AVA)減小，跨瓣速度增加，瓣膜小葉增厚；免疫組化檢測證實巨噬細胞(CD68陽性細胞)，泡沫細胞等炎性細胞以及骨橋蛋白的合成；組織染色發現瓣膜小葉區域有結節性鈣沉積，再次證實了CAVD的病因是多因素的。

模型評價：高脂飲食模型明顯的優點是避免了高膽固醇飲食引起的高膽固醇毒癥，同時引起的體重增加和血糖的升高近似模擬了人類真實生活環境中，這與鈣化性瓣膜病流行病學危險因素[27]相一致。Le等[28]利用合并血脂異常和2型糖尿病的LDLr-/-/ApoB100/100/IGF-II小鼠模型，觀察到高膽固醇血癥和高血糖癥對CAVD早期病變的累積效應，證實了T2D是CAVD發生發展的獨立危險因素，可能成為未來潛在的治療靶點。因此，該模型可應用于研究血糖對瓣膜病鈣化形成的影響以及降糖藥物延緩病情進展的效果觀察。

1.3 其他飲食誘導模型

Huk等[29]給野生型C57BL/6J小鼠喂食含有200 IU/g視黃醇棕櫚酸酯過量維生素A的食物(Harlan，TD.110146)持續12個月，檢測到主動脈瓣的峰值壓力梯度和速度顯著增加，小葉明顯鈣化結節。該模型主要通過視黃酸(retinoic acid，RA)介導的鈣化信號導致轉錄因子Sox9抑制及其靶基因失調，成骨基因Runx2和骨鈣蛋白(bone Gla protein,BGLAP)表達增強，這與先前研究結果一致[30-31]，提示過量膳食維生素A是CAVD發病的危險因素。

模型評價：該模型的優點與其他飲食誘導模型一樣，操作簡便。但缺點也比較明顯，由于造模周期較長，對后續開展相關研究不利，并且對研究人員精力和經濟上都是一種挑戰。利用此模型可以研究成人過量膳食維生素A對促進CAVD進展的影響，給予CAVD患者在膳食習慣上的指導。

2 基因修飾模型

2.1 基因敲除模型

彈性纖維作為主動脈瓣細胞外基質(extracellular matrix，ECM)的重要組成部分，在結構和功能上具有重要作用[32]。彈性纖維由彈性蛋白(核心蛋白)和微纖維(原纖維蛋白及相關蛋白)，以及各種糖蛋白，如emilins和fibulins組成[33]。Fibulin4-/-小鼠可導致TGF-β信號通路激活，引起主動脈瓣成纖維細胞激活，小葉增厚，骨形態發生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)激活和營養不良性鈣化[34]。同樣Emilin1-/-小鼠也能導致瓣膜組織內TGF-β因子失調，引起經典通路Smad2/3和非經典途徑細胞外信號調節激酶1和2(Erk1/2)激活，17月齡時主動脈瓣增厚，峰值速度和相應的壓力梯度顯著增加，組織內血管生成，巨噬細胞浸潤，αSMA表達以及纖維化[35]；值得注意的是此模型未檢測出鈣鹽沉積的跡象，但它提供了ECM病理結構的變化，與人瓣膜病的早期病理改變是一致的。Angel等[36]利用此模型證實了主動脈瓣膜病發病前后蛋白組變化與生物力學存在明顯的相關性，ECM中蛋白質的變化早于血流動力學的變化。

以往研究證實炎癥與鈣化性主動脈瓣膜病存在聯系，并且白介素(IL)-1β參與了CAVD的發病機制[37-38]。Isoda等[39]發現BALB/c背景的白介素-1受體拮抗劑缺陷(IL-1Ra-/-)雄性小鼠在標準飲食條件下，16周齡時出現主動脈瓣葉增厚，巨噬細胞浸潤并含有分化的肌成纖維細胞，43周齡時檢測到鈣化病變。

模型評價：基因敲除小鼠模型在眾多疾病發病機制研究中常用的方法，其優點是小鼠往往是近交品系，同源性好，便于基因編輯操作，能夠明確某種特定因素缺失對疾病造成的影響。缺點是基因敲除僅對單一位點實施干預，會影響與鈣化性主動脈瓣膜病其他危險因素的相互促進作用，有時還會造成動物模型典型表現(鈣化)欠缺。

2.2 基因過表達模型

Cadherin-11(Cad-11)是一種細胞間粘附蛋白，可介導細胞遷移并促進間充質細胞分化為骨和軟骨[40]。先前研究表明，在人和動物的鈣化性主動脈瓣VIC中發現Cad-11表達明顯增加[41-42]；Cad-11缺乏可導致GTP-RhoA和Sox9失活，影響胚胎瓣膜的形成和重塑，進而阻止了成年小鼠的鈣化[43]。Sung等[44]運用轉基因技術創建了Nfatc1Cre; R26-Cad11Tg/Tg小鼠模型，小鼠在一個月時主動脈瓣厚度或橫截面積沒有顯著差異和其他身體缺陷，10個月時出現主動脈鈣化和狹窄伴反流，瓣膜明顯增厚(>70%)，橫截面積增加(>46%)，射血速度增快，存在成骨細胞標志物肌纖維母細胞(αSMA)和成骨細胞(Runx2，骨鈣素)以及陽性的Von Kossa和茜素紅染色。該模型小鼠病理學及生物分子學與人鈣化性主動脈瓣膜病表現出一致性，作為一種新的模型證實了Cadherin-11過表達通過體內GTP-RhoA介導的成骨和營養不良性鈣化以及Sox9介導的細胞外基質重塑誘導主動脈狹窄。

表1 鈣化性主動脈瓣膜病小鼠模型Table 1 Mouse models of calcified aortic valve disease

Chu等[45]綜合考慮高膽固醇血癥和高血壓與主動脈瓣膜病的相關性，首次在APOE-/-小鼠基礎上利用轉基因技術建立了腎素(REN+)、血管緊張素(AGT+)為一體的纖維化性主動脈瓣狹窄(fibrotic aortic valve stenosis，FAVS)模型。標準飲食12個月后表現出嚴重的主動脈瓣狹窄，相鄰瓣膜吻合線明顯增長，瓣膜基底部膠原蛋白網狀化，伴有輕度鈣化。雖然瓣膜鈣化不明顯，但類似于兒童和一些成年人的主動脈瓣狹窄[46-47]。

模型評價：該模型優點是可以針對特定的主動脈狹窄發病危險因素利用轉基因技術檢測該基因過表達對機體的影響。缺點是實驗成本較高。雖然轉基因技術比較成熟,但操作復雜，實驗者需要到專業機構購買特定小鼠，并且價格昂貴。

3 先天發育異常模型

流行病學顯示先天異常主動脈瓣患者主動脈瓣狹窄的發病率明顯高于三尖瓣，并且發病時間會提前10-20年[48-50]。此外鈣化性主動脈瓣狹窄的地理分布是異質的，并且顯示出聚類效應，表明遺傳因素與瓣膜病之間的相關性[51]。

Garg等[52]在同一個家族的五代人的先天性心臟病研究中，首次發現了轉錄調節因子NOTCH1突變是主動脈瓣鈣化的遺傳基礎，并且通過突變基因的轉基因小鼠中證實能夠引起心臟瓣膜缺陷。Notch1雜合子(Notch1+/-)雄性小鼠喂食含0.2%膽固醇的高膽固醇飲食10個月后，與WT對照組相比主動脈瓣鈣化程度增加5倍，小葉中Bmp2表達增加了3倍以上，雖然小鼠均為沒有表現出二尖瓣，但是在三尖瓣中存在鈣化，證明Notch1在發育過程中和在抑制出生后的鈣化中具有獨立的功能[53]。

骨膜素(periostin，POSTN)基因編碼的蛋白骨膜素在胚胎發育的心臟流出道(OFT)心內膜墊中高度表達，誘導心臟形成主動脈瓣等多種結構[54]。POSTN基因缺失(postn-/-)小鼠通過誘導Notch1負調控因子δ樣同系物(DLK1)的過度表達，主動脈瓣嚴重變形，并呈雙尖瓣樣形態，標準飲食6月齡時，von Kossa染色主動脈瓣小葉上有大量鈣沉積物，并伴有轉錄因子Runx2、OPN和骨鈣素的表達[55]。

上皮生長因子受體(epithelial growth factor receptor,EGFR)信號傳導通路在調節小鼠主動脈瓣的胚胎發育過程中起關鍵性作用，其主要功能受體缺陷可導致主動脈瓣異常和功能障礙[56]。Weiss等[57]研究表明上皮生長因子受體突變(EgfrVel/+)小鼠瓣膜發育異常發生率約75%，形態類似于人的單尖瓣主動脈瓣；8個月時主要表現為狹窄伴或不伴關閉不全，并且瓣膜功能障礙隨年齡增長更加明顯；雖然該模型小鼠未表現明顯的出間質細胞分化以及鈣化跡象，但這與兒童和年輕成人的先天型單尖瓣主動脈瓣臨床表現相似[58]，因此可以作為一種先天型單尖瓣瓣膜病動物模型。

模型評價：先天發育異常誘導模型的建立為CAVD遺傳因素的研究提供了新的途徑，通過對先天發育異常小鼠的觀察進一步認識調控瓣膜胚胎發育的信號通路在CAVD發生發展的作用，也可以研究先天型瓣膜病(單尖瓣、二尖瓣)在生物力學方面的作用。缺點是模型成功率低，耗時長，并且在復制模型時操作復雜。

4 手術誘導模型

由于血液動力應力引起的機械損傷被認為是AS的重要危險因素[59]，一種導絲損傷瓣膜的AS模型被建立。Honda等[60]最早通過將超聲導絲在超聲心動圖引導下通過右頸總動脈插入并移動到雄性C57/BL6小鼠的左心室中，導絲的尖端位于瓣膜的左心室側前后移動20次并旋轉50次，從而造成主動脈瓣損傷。大部分小鼠損傷1周后主動脈速度持續性增加，損傷后4周，瓣膜小葉明顯增生，射血分數降低，增生瓣膜顯示出活性氧的產生增加以及炎性細胞因子和骨軟骨形成因子的表達，12周后表現出明顯主動脈瓣狹窄，茜素紅染色顯示瓣膜鈣化。但是該方法在操作過程中無法控制對瓣膜造成的損傷程度，導致瓣膜狹窄伴反流的混合型瓣膜病模型和死亡率增加。后來，Niepmann等[61]在此基礎上改用多種類型的導絲進行分級損傷瓣膜，對于輕度和中度損傷，使用尖端縮短并焊接的直導絲(雅培HI-TORQUE 0.014′′)，前后移動20次后再分別以2次/秒的速度旋轉50次和100次；對于嚴重損傷，使用尖端附帶15°角度的傳統導絲(Asahi INTECC MIRACLEbros6)，旋轉200次，以此控制瓣膜的輕、中、重損傷程度。該方法能明顯控制不同程度狹窄中主動脈反流的發生率，并且術后24 h死亡率從20%降到4.4%。

模型評價：該模型優點是操作簡單，造模周期短，模型成功率較其他模型高，其缺陷是造成瓣膜的急性損傷，病理周期短，與人主動脈瓣狹窄漫長的病程不一致。但在病理組織學是相似的，能夠形成主動脈狹窄以及鈣化，并且具有易操作性，可以作為一種新興動物實驗模型。模型可應用于炎性機制的研究和抑制炎性反應對CAVD進程的影響。

5 展望

動物模型是研究CAVD的病理生物學機制和潛在的治療干預的重要工具。目前大多數CAVD小鼠模型的建立集中在炎性機制和加快疾病進程的合并癥，如高膽固醇血癥、糖尿病、高血壓等，但仍存在不足之處，未來理想模型應該能夠精確測量主動脈瓣所處的高度動態的生物力學效應。由于主動脈瓣獨特的解剖位置，使其暴露于血流誘導的剪應力、壓力負荷、彎曲變形和ECM的機械阻力下，這些機械刺激中的每一個都調節瓣膜細胞的生物學，因此可能對體內平衡和疾病都有貢獻。小鼠模型由于受物種的限制，首先在組織結構上缺乏與人主動脈瓣的三層結構，其次是體型小不利于力學方面的精確測量。我們應該看到在其他動物模型的優勢，如豬在組織結構和形態大小與人瓣膜是相似的，可能成為研究生物力學的絕佳模型。然而小鼠模型在基因修飾上的便利性，為生物力學相關信號通路研究提供了可行性。不同物種的CAVD模型都有其局限性和優勢，我們利用其優勢上的互補，幫助我們對疾病機制更深入的認識。