麻黃附子細辛湯對局灶性節段性腎小球硬化癥模型大鼠血尿生化及腎臟病理的影響

蘇哲苓 盧 嫣 韓世盛 姚天文 王 怡

（上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院腎內科，上海200437）

局灶性節段性腎小球硬化癥（FSGS）是慢性腎炎中一種常見的病理類型，西醫常用激素和免疫抑制劑治療，但往往療效欠佳且副作用較大。臨床上常使用麻黃附子細辛湯治療腎臟病[1-6]，但未見運用本方治療FSGS的相關文獻報道。本研究以FSGS模型大鼠作為實驗對象，觀察麻黃附子細辛湯對FSGS模型大鼠血、尿生化指標及腎臟病理的影響，為麻黃附子細辛湯治療FSGS的臨床應用提供依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 SPF級5周齡雄性Wistar大鼠，體質量（146±5）g，購于上海斯萊克實驗動物有限公司。動物生產許可證號：SCXK（滬）2012-0002。動物使用許可證號：SYXK（滬）2013-0109。實驗動物倫理審批號：16695。飼養于上海中醫藥大學附屬岳陽中西醫結合醫院實驗動物中心。

1.2 藥物與試劑 中藥顆粒劑麻黃附子細辛湯（生麻黃6 g，制黑附子9 g，細辛3 g），江陰天江藥業有限公司，批號：16101151。尿蛋白測定試劑盒，上海執誠生物科技有限公司，批號：ZCOCTR011、ZCNOVR007、ZCFEBR028；血生化試劑盒，上?？迫A卓越生物工程股份有限公司，批號：2016061K；Masson染色液，北京雷根生物技術有限公司，批號：DC0032；嘌呤霉素氨基核苷（PAN）試劑，美國Sigma公司，批號：113M4100V、045M4068V。

1.3 主要儀器 全自動生化儀（型號：450），上海科華卓越生物工程股份有限公司；光學顯微鏡（型號：CX41），日本Olympus株式會社；透射電鏡（型號：Tecnai G2 spirit），美國FEI公司。

2 實驗方法

2.1 分組 24只大鼠隨機分為正常組、模型組與治療組，每組8只，適應性喂養1周左右開始造模。

2.2 造模與干預 根據中日友好醫院2005年發表的嘌呤霉素氨基核苷（PAN）腎病模型造模方法，結合課題組前期成功造模方法進行造模[7]。具體方法如下：首劑靜脈注射PAN 90 mg/kg，在蛋白尿達到高峰后（約第13天）分別于第14、17、20、23、26天追加PAN 9 mg/kg，造模周期為56 d（8周）。

藥物干預與造模同步。大鼠藥物劑量根據《心血管病實驗動物學》[8]推薦劑量結合本實驗腎毒性研究需要，人鼠劑量換算按每公斤體重計算為成人劑量的20倍。成人的麻黃、附子、細辛劑量按照鄧中甲主編的2008版《方劑學》中麻黃附子細辛湯劑量：生麻黃6 g，制黑附子9 g，細辛3 g。制備麻黃附子細辛湯水溶液，每毫升含生藥0.6 g。治療組大鼠每日1次灌胃給藥，灌胃劑量為每100 g體質量1 mL，正常組和模型組灌胃等量蒸餾水，均連續灌胃56 d。

2.3 指標檢測

2.3.1 24 h尿蛋白定量 應用基礎代謝籠收集造模第0、2、4、8周時各組大鼠24 h尿液，采用免疫比濁法檢測尿蛋白。

2.3.2 血生化指標 造模第56天，各組大鼠用10%水合氯醛（0.33 mL/100 g）麻醉后，無菌下打開腹腔，腹主動脈采血，處死，留取腎臟標本。采用溴甲酚綠法檢測血漿白蛋白，采用紫外-谷氨酸脫酶法檢測血尿素氮，采用肌氨酸氧化酶法檢測血肌酐，采用氧化酶法檢測血尿酸，采用甘油磷酸氧化酶法檢測血甘油三酯，采用氧化酶法檢測血總膽固醇。

2.3.3 腎小球硬化指數及腎小管間質病變程度 留取大鼠腎臟皮質組織，經10%中性福爾馬林緩沖液固定后，石蠟包埋，切片厚約3 μm，行Masson染色，光鏡下觀察組織學變化。

采用一種半定量指標，即通過計算腎小球硬化指數（GSI）來判斷腎小球的硬化程度。GSI計算公式為：GSI=[（1×n1+2×n2+3×n3+4×n4）/每片腎小球總數]×100%（n1～n4分別代表1級～4級損害腎小球個數）。在各腎組織切片中隨機檢測50個腎小球，將每個腎小球損害程度分為0～4級，0級表示腎小球無病變，1級表示1個腎小球的硬化區域為1%～25%，2級表示1個腎小球的硬化區域為26%～50%，3級表示1個腎小球的硬化區域為51%～75%，4級表示1個腎小球的硬化區域為76%～100%。

腎小管間質評分：根據光鏡明確腎小管和腎間質病變程度（每張切片腎小球＞10個），腎小管急性病變以上皮細胞變性、壞死、細胞脫落作為評判標準，腎小管和腎間質慢性病變以腎小管萎縮和腎間質纖維化的面積作為評判標準，進行半定量分析。全部腎活檢組織內病變面積＜25%為0分，≥25%、＜50%為1分，≥50%、＜75%為2分，≥75%為3分。

表2 各組大鼠干預后血生化指標比較

表1 各組大鼠各時期24 h尿蛋白定量比較（±s） 單位：mg

表1 各組大鼠各時期24 h尿蛋白定量比較（±s） 單位：mg

注： 與正常組比較，**P＜0.01；與模型組同時期比較，#P＜0.05；與本組造模第0周比較，△△P＜0.01。

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2.3.4 足突超微結構 采用透射電鏡觀察足突超微結構。選取約1 mm×1 mm大鼠腎臟皮質組織塊，2.5%戊二醛4 ℃固定，1%四氧化鋨酸后固定，乙醇梯度脫水，環氧樹脂與丙酮包埋，聚合成塊，超薄切片（50～70 nm）后醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，透射電鏡觀察、攝片。計算足突融合率：首先測量基底膜總長度，設為A，然后測量基底膜足突融合的總長度，設為B，A/B的百分率即為足突融合率。

2.4 統計學方法 采用SPSS 24.0統計軟件分析數據。計數資料用χ2檢驗，等級資料用秩和檢驗。非重復測量的計量資料，若符合正態分布，以（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析；若不符合正態分布，采用秩和檢驗。重復測量的計量資料，若符合正態分布，用重復測量方差分析；若不符合正態分布，將原始變量轉換為秩次后，用秩次變量作重復變量方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 各組大鼠各時期24 h尿蛋白定量比較 實驗前（造模第0周）各組大鼠24 h尿蛋白定量比較差異無統計學意義（P＞0.05）；造模各時期組內及組間比較見表1。

3.2 各組大鼠干預后血生化指標比較 見表2。

3.3 各組大鼠腎臟組織病理變化

3.3.1 光鏡下各組大鼠腎小球、系膜區、腎小管間質病理情況比較 正常組：腎小球毛細血管襻開放良好，系膜細胞與系膜基質未見增生，基底膜無增厚；腎小管及間質無明顯病理改變。模型組：腎小球光鏡下出現節段硬化或球囊粘連，節段性毛細血管閉塞或血管外泡沫細胞浸潤，系膜區未見明顯增生；腎小管上皮細胞扁平甚至脫落；腎間質膠原纖維增生。治療組：病理變化與模型組相似，但病變程度有所減輕。見圖1。

3.3.2 電鏡下各組大鼠腎小球足細胞變化比較 正常組：腎小球足細胞足突排列規整。模型組：腎小球足細胞足突融合，裂孔間隙消失，可見基底膜裸露，可見凋亡足細胞、空泡樣變性足細胞。治療組：病理變化與模型組相似，但病變程度有所減輕。見圖2。

3.3.3 各組大鼠腎小球硬化指數、腎小管間質評分和足突融合率比較 見表3。

4 討論

4.1 局灶節段硬化性腎病大鼠模型 模型組大鼠24 h尿蛋白水平較正常組明顯升高，并且在第2周達到高峰，后期蛋白尿逐漸減少，可能與腎入球動脈硬化、腎小管萎縮、腎小球纖維化，導致蛋白尿、血肌酐等體內的代謝物較難排出體外有關。模型組大鼠血白蛋白下降、腎功能和血脂指標明顯上升，且腎小球光鏡下出現明顯節段硬化，腎小管上皮細胞扁平甚至脫落，腎間質膠原纖維增生，電鏡下腎小球足細胞足突廣泛融合成片狀，可見凋亡足細胞、空泡樣變性足細胞。因此，我們認為本研究所使用的造模方法可獲得較好的FSGS模型。

4.2 麻黃附子細辛湯的干預效果及意義 本研究結果顯示，麻黃附子細辛湯作用于FSGS模型大鼠時，不但沒有加劇腎功能損傷，反而使大鼠24 h尿蛋白定量好轉，腎小球硬化指數降低，腎小管間質評分好轉，足突融合率減輕，說明麻黃附子細辛湯可有效延緩FSGS進展。同時，本研究亦發現麻黃附子細辛湯可改善大鼠因FSGS引起的脂質代謝紊亂。藥理學研究表明麻黃附子細辛湯具有抗炎、免疫調節等作用，其作用可能與激素相似[9]。本研究對臨床上麻黃附子細辛湯用于FSGS及因此引發的脂質代謝紊亂的治療具有重要指導意義。

4.3 “有故無殞”理論對中藥毒性研究的指導意義 “有故無殞”理論始見于《素問·六元正紀大論》，原意為孕婦在患有大積大聚之病時，只要辨證論治準確，適度使用性味峻烈的藥物既可祛除疾病，又不會傷害母體及胎兒，但是用藥要適度?！秲冉洝贰坝泄薀o殞”理論告訴我們，當人體有?。础坝泄省保r，疾病承擔藥物的治療作用（藥性），不會損傷人體（即“無殞”）。麻黃附子細辛湯中單味藥附子（含烏頭堿）、細辛（含馬兜鈴酸）的腎毒性研究有較多報道[10-16]。但是這類藥物的腎毒性研究多以正常生理狀態動物作為實驗對象，忽略了“中藥應該在中醫理論指導下使用”這一基本原則[17]。而且中藥講究的是復方配伍，方劑配伍是中藥臨床增加療效、減少毒性的重要方法。曹蘭秀等[18]研究發現附子細辛配伍，附子可有效降低細辛的毒性。本研究結果為“有毒”中藥及“含有毒中藥”的組方在“有故無殞”理論指導下的臨床安全應用提供了實驗依據。

圖1 各組大鼠腎臟組織病理變化（Masson染色，×200）

圖2 各組大鼠腎臟組織電鏡下足突細胞變化（醋酸鈾-檸檬酸鉛染色，×6 000）

表3 各組大鼠干預后腎小球硬化指數、腎小管間質評分和足突融合率比較

4.4 辛溫法治療慢性腎炎的探討 辛溫方麻黃附子細辛湯始見于《傷寒論》。根據性味及歸經，此方具有開宣肺氣、通調水道、調暢三焦氣機、祛風通絡、疏通津液、生復陽氣、運化濁飲等功效?！瓣柣瘹?，陰成形”出自《素問·陰陽應象大論》，張景岳注解道：“陽動而散，故化氣；陰靜而凝，故成形?！?/p>

筆者認為，有形之邪，本乃體內精微物質，因外邪侵襲、脈絡不通、陽氣不運，導致原本循經運行于脈內的精微物質被迫行于脈外而成有形之邪。對于慢性腎炎而言，“有形之邪”就是原本的精微物質（水液、血液、蛋白等）不能循經運行于脈內，被迫溢于脈外，而成水腫、血尿、蛋白尿、高脂、足突融合等病理產物。此時可予“辛通溫化法”論治，以達到“宣散表邪，少火生氣，以氣化形，疏通脈絡，使濁陰排出體外，精微物質復循行于脈內，輸布潤澤全身”的目的，在治療時需注意中病即止。此觀點也在本實驗中得到了有效論證。

本研究雖然得到預期效果，但未對不同劑量的中藥進行研究。在今后的課題研究中，我們將設置小劑量、正常劑量、中毒劑量甚至更多的劑量組，使其更具有說服力。