姜黃素光動力對牡蠣脂質氧化水解酶的影響

張 旭,盧 娜,李兆杰,薛 勇,袁詩涵,薛長湖,唐慶娟

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266000)

姜黃素光動力是一種新型廣譜殺菌技術,在貝類加工中有著廣泛的應用前景。前期研究表明,姜黃素光動力能夠減緩牡蠣脂質氧化水解的進程[1]。酶是導致牡蠣脂質氧化水解的主要原因。

脂質的酶促氧化主要是由脂肪氧合酶(LOX)引起的,脂肪氧合酶是含非血紅素鐵的氧化還原酶,可以催化多不飽和脂肪酸(PUFA)發生的過氧化反應[2]。脂肪氧合酶可以作用在多不飽和脂肪酸的特定位點,通過分子內加氧,生成具有共軛雙鍵的氫過氧化物,這些氫過氧化物又會分解為短鏈的醛、醇和碳氫化合物,產生不良氣味[2]。Yarnpakdee等對羅非魚在冷藏過程中的脂肪氧合酶活性進行了檢測,研究表明脂肪氧合酶在羅非魚脂質的氧化過程中起到了重要的作用[3]。Zhou等檢測了脂肪氧合酶在貽貝冷藏過程中的活性變化,結果表明脂肪氧合酶與貽貝的脂質氧化密切相關[4]。

脂質的水解是脂肪酶及磷脂酶引起的,在冷藏過程中,這些酶仍保持著一定的活力[5]。脂肪酶是一類能夠催化長鏈酰基甘油酯鍵水解的酶。磷脂酶有磷脂酶A1(PLA1)、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)、磷脂酶D(PLD)四種類型,分別作用于磷脂不同位點[6]。牡蠣中甘油酯、磷脂會在脂肪水解酶和磷脂酶的作用下降解,產生大量游離脂肪酸。游離脂肪酸一方面繼續分解產生小分子的醛和醇;另一方面,游離脂肪酸比甘油酯、磷脂更容易氧化,產生酸敗氣味[7]。Liu等研究證明,在低溫冷藏過程中,脂肪酶對甘油三酯的水解起著重要的作用[8]。王昕岑對牡蠣中脂肪水解酶的活性進行檢測,發現在冷藏過程中脂肪酶和磷脂酶依然保持著一定的活性,且與磷脂的水解密切相關[6]。

因此,檢測姜黃素光動力對脂肪氧合酶、脂肪酶和磷脂酶的影響,對探究姜黃素光動力延緩牡蠣的脂質劣化具有較為重要的意義。這些引起脂質水解和氧化的酶,大部分是分布在牡蠣肌肉和內臟器官中的內源酶,還有一部分來自于牡蠣冷藏過程中由腐敗菌產生的外源酶[9-11]。在實際檢測過程中,牡蠣的內源酶和外源酶難以區別。為避免腐敗菌產生的外源酶的影響,使牡蠣的體外酶活可以近似等于內源酶活性,本文提取了新鮮牡蠣中的脂肪氧化水解酶檢測了內源酶的活性,并通過篩選產酶菌株、統計產酶菌株數量,確定姜黃素光動力對外源酶數量的影響,創新性地檢測了牡蠣內源酶的活性,并從微生態影響外源酶的角度探究了姜黃素光動力對酶的影響,以期從酶的角度闡明姜黃素光動力減緩牡蠣脂質氧化水解的機理。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

牡蠣 青島團島農貿市場,選購大小均勻,每個質量(250±10) g,30 min內運回實驗室;姜黃素(食品添加劑級) 陜西慈緣生物科技有限公司;食品級乙醇(≥95%) 廣西海盈酒精有限責任公司;海水素 廣州益爾生物工程有限公司;細菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技(北京)有限公司;其他化學試劑 均為國產AR級普通試劑。

多功能光源儀 青島建亮科技有限公司;JYL-C50T料理機 九陽股份有限公司;精密電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多公司;Model 680 型酶標儀 美國Bio-Rad 公司;電熱恒溫培養箱 上海精宏實驗設備有限公司;超純水系統 美國Millipore 公司;Anke臺式高速冷凍離心機 上海安亭科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 牡蠣分組及處理 根據牡蠣在10 μmol/L姜黃素的人工海水暫養3 h后,海水吸光值的變化得出每克牡蠣肉(包含內臟)的姜黃素添加量為0.0556 mg。將在未添加姜黃素的人工海水暫養3 h后的新鮮牡蠣在無菌條件下開殼,提取粗酶液進行如下分組處理:空白組:直接檢測酶活;光動力組:向粗酶液中添加0.0556 mg/g牡蠣肉的姜黃素,置于420 nm光源下,能量密度7.2 J/cm2照射2 min,檢測酶活。

1.2.2 脂肪氧化水解酶粗酶液提取

1.2.2.1 脂肪氧合酶粗酶液提取 按照參考文獻[4]中方法進行,5 g牡蠣肉,加入15 mL 50 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.0,含1 mmol/L二硫蘇糖醇和1 mmol/L乙二胺四乙酸)勻漿:25000 r/min均質4次,每次10 s,勻漿后在冰盒上攪拌30 min,4 ℃下15000×g離心1 h,上清液通過四層紗布過濾,收集濾液。

1.2.2.2 脂肪水解酶粗酶液提取 按照參考文獻[5]中方法進行,2 g牡蠣肉,加入10 mL Tris-HCl(20 mmol/L Tris-HCl pH8,150 mmol/L NaCl pH8.5)緩沖液渦旋,5000 r/min均質2次,每次30 s,磁力振蕩攪拌30 min,10000 r/min離心5 min,收集上清液。其中,脂肪酶,磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶C、磷脂酶D均屬于脂肪水解酶。

1.2.3 脂肪氧化水解酶活性檢測

1.2.3.1 脂肪氧合酶活性測定 按照參考文獻[12]中方法檢測脂肪氧合酶活性,0.1 mL脂肪氧合酶粗酶提取液,加入2.9 mL 50 mmol/L檸檬酸緩沖液、預熱的0.2 mL底物(140 mg亞油酸于5 mL含180 μL吐溫20的去離子水中,調pH至9.0,定容至50 mL)。在30 ℃起始反應,準確計時,反應2 min后立即加入4 mol/L HCl至pH3.0,酸性條件下酶失去活性,反應終止,取適量體積的反應液于234 nm下測定吸光度。酶活定義:在此條件下每分鐘增加0.001吸光度值定義為1 U。

1.2.3.2 脂肪酶活性測定 按照參考文獻[6]中方法檢測脂肪酶活性。底物溶液(3 mg/mL棕櫚酸對硝基苯酚酯)與緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0))以體積比1∶9 (V/V)混合均勻,取1.5 mL上述混合液與0.5 mL粗酶提取液混合,渦旋后置于37 ℃反應10 min,加入2 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液,使酶失活,反應終止,再加入2 mL 0.5 mol/L 碳酸鈉溶液顯色,振蕩后,在410 nm處測定吸光度值。脂肪酶水解對硝基苯酚酯產生對硝基苯酚,不同濃度的對硝基苯酚吸光度值不同,配制不同濃度的對硝基苯酚溶液,以濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標注曲線。根據標準曲線計算得到反應液中對硝基苯酚的濃度,酶活定義為在一定條件下,1 min內生成1 μmol對硝基苯酚所需的脂肪酶的量為1 U。

1.2.3.3 磷脂酶A1活性測定 按照參考文獻[6]中方法進行檢測磷脂酶A1活性。2.0 mL卵磷脂底物溶液(8%,用pH6.0的磷酸鹽緩沖液配制)、2.5 mL Tris-HCl(10 mmol/L,pH8.5)和0.5 mL粗酶提取液混勻。于37 ℃反應15 min,加入1 mL 95%乙醇溶液,使酶失活,終止反應,混勻后加入3 mL異辛烷振蕩。65 ℃靜置分層,冷卻至室溫后,取上層溶液加入異辛烷,混勻后加入1 mL吡啶-銅鹽顯色劑(5%,pH6.1),渦旋后靜置澄清,取上層有機相在714 nm處測定吸光度值。磷脂酶A1水解底物生成棕櫚酸,不同濃度的棕櫚酸與異辛烷和吡啶-銅鹽混勻后吸光度值也不同。配制不同濃度的棕櫚酸異辛烷溶液,加入吡啶-銅鹽顯色劑,以濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標注曲線。根據標準曲線計算得到反應液中棕櫚酸的濃度,酶活力定義為在一定條件下,1 min內生成1 μmol棕櫚酸所需的磷脂酶A1的量為1 U。

1.2.3.4 磷脂酶A2活性測定 按照參考文獻[6]中方法進行檢測磷脂酶活性。50 mmol/L Tris-HCl溶液(pH8.0,含有100 mmol/L NaCl,5 μg/mL牛血清白蛋白,5 mmol/L CaCl2,10 μmol/L 8-苯胺基-1-萘磺酸)170 μL和20 μL底物溶液(200 μmol/L的DMPC)混勻,26 ℃保溫5 min后,加入10 μL粗酶提取液開始反應,熒光發射15 min觀測其動力學曲線。吸收和發射波長分別為377和470 nm。磷脂酶A2的酶活力定義為在一定條件下,1 min內熒光強度改變1個單位定義為1 U。

1.2.3.5 磷脂酶C活性測定 按照參考文獻[6]中方法進行檢測磷脂酶C活性。2 mL的反應體系(0.25 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.2),60%山梨糖醇,10 mmol/L的底物對硝基磷酸膽堿)和100 μL的粗酶提取液混勻,于37 ℃水浴鍋內反應30 min,加入1 mL 95%乙醇溶液,使酶失活,反應終止,測定溶液在410 nm處的吸光度值。磷脂酶C水解對硝基磷酸膽堿產生對硝基苯酚,不同濃度的對硝基苯酚吸光度值不同,配制不同濃度的對硝基苯酚溶液,以濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標注曲線。根據標準曲線計算得到反應液中對硝基苯酚的濃度,酶活定義為在一定條件下,1 min內生成1 μmol對硝基苯酚所需的磷脂酶C的量為1 U。

1.2.3.6 磷脂酶D活性測定 按照參考文獻[6]中方法進行檢測磷脂酶D活性。0.4 mL反應液與0.1 mL卵磷脂底物溶液(0.1 g 95% PC溶1 mL的乙醚,加入9 mL超純水,超聲得乳濁液)混勻,加入0.1 mL粗酶提取液,于37 ℃恒溫水浴20 min,加入0.2 mL 50 mmol/L EDTA溶液,沸水浴5 min,使酶失活,反應終止,恢復至室溫后,加入0.2 mL顯色液,37 ℃下顯色30 min,于500 nm下測其吸光值。磷脂酶D能夠將卵磷脂水解成膽堿,不同濃度的膽堿呈現出不同的吸光度值,配制不同濃度的膽堿溶液,以濃度為橫坐標,吸光度值為縱坐標繪制標注曲線。根據標準曲線計算得到反應液中膽堿的濃度,酶活定義為在此條件下,1 min產生1 μmol膽堿所需要的酶量定義為1 U。

1.2.4 產外源酶菌株的篩選及菌種鑒定

1.2.4.1 菌株篩選 新鮮牡蠣肉1 g和9 mL無菌生理鹽水在食品勻漿機中均質。將勻漿液按照1∶100、1∶1000、1∶10000比例梯度稀釋后接種于不同的篩選培養基。37 ℃培養48 h后,查看平板陽性結果。篩選培養基配方如下:

產脂肪氧合酶菌株篩選培養基[13]:含有0.5%亞油酸和0.5%β-胡蘿卜素的LB瓊脂培養基。

產脂肪酶菌株篩選培養基[14]:橄欖油乳化液12 mL,中性紅0.001 g,酵母膏0.1 g,瓊脂1.5 g,海水100 mL(pH=7.2)。

產磷脂酶A1菌株篩選培養基[15]:卵磷脂2%,胰蛋白胨1%,NaCl 1%,酵母粉0.5%,溴甲酚紫3%,25 mol/L CaCl2(pH=7.0)。

產磷脂酶A2菌株篩選培養基[16-17]:含有2%卵磷脂的LB瓊脂培養基(pH=7.8)。

產磷脂酶C菌株篩選培養基[18]:蛋白胨1%,NaCl 0.5%,牛肉膏0.3%,瓊脂 2%,卵黃液2%(pH=7.2～7.4)。

產磷脂酶D菌株篩選培養基[19-20]:磷脂酰膽堿5.0 g/L,KNO35.0 g/L,K2HPO40.25 g/L,FeSO4·7H2O 0.005 g/L,瓊脂20 g/L(pH=7.0～7.4)。

1.2.4.2 菌種鑒定 挑取平板上呈現陽性結果的單菌落,按天根細菌基因組DNA提取試劑盒提取牡蠣體內細菌的DNA。以提取的DNA為模板,采用細菌通用引物27F-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG和1492R-TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T擴增16S rDNA的全序列。PCR擴增體系(50 μL)為:Taq DNA聚合酶2.5 U,引物200 nmol/L,dNTP 200 nmol/L,60 mmol/L Tris-SO4,18 mmol/L(NH4)2SO4,2.0 mmol/L MgSO4,1%甘油,100 ng/μL牛血清蛋白,模板DNA 10 ng,補ddH2O至50 μL。擴增程序為:95 ℃預變性2 min;95 ℃變性30 s、60 ℃復性30 s、72 ℃延伸6 s、20個循環。委托生工生物工程(上海)股份有限公司對擴增后的序列進行檢測。

1.2.5 菌株數量檢測

1.2.5.1 牡蠣處理方式 牡蠣分為空白對照組和光動力組(每組5只),處理方式如下:

空白對照組(L-S-):人工海水中暫養3 h,貝水比為1∶4,無菌條件下開殼。

光動力組(L+S+):于姜黃素終濃度為10 μmol/L的人工海水中暫養3 h,貝水比為1∶4。無菌條件下開殼,420 nm光源照射(能量密度為7.2 J/cm2,照射2 min)。

每只牡蠣取1 g進行高通量測序、1 g進行細菌培養統計菌落總數。

1.2.5.2 Illumina MiSeq高通量測序 1 g牡蠣加入無菌生理鹽水勻漿,按照細菌基因組DNA提取試劑盒提取牡蠣體內細菌的DNA。以提取的DNA為模板,采用細菌16S PCR引物341/357F-NNNNCCT ACGGGNGGCWGCAG和805/785R-GACTACHV GGGTATCTAATCC擴增16S rRNA的V1～V3高變區序列。擴增體系同1.2.4.2。

擴增后的產物委托北京奧維森基因科技有限公司進行高通量測序。使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構建,構建好的文庫用BioAnalyzer High-sensitivity DNA chip kit定量,文庫合格后,使用Illumina Miseq對牡蠣微生物的V3～V4區進行上機測序,QIIMEv1.8.0用來分析16S rRNA基因序列,Mothurv.1.34.4用來進行數據分析。

1.2.5.3 菌落總數統計 1 g牡蠣肉和9 mL無菌生理鹽水在食品勻漿機中均質。將勻漿液按照1∶100、1∶1000、1∶10000比例梯度稀釋后接種于LB瓊脂培養基。37 ℃培養48 h后,計數菌落形成單位。結果以lg(cfu/g)表示。

1.2.5.4 計算菌的數量 菌的數量=菌的相對豐度(%)×菌落總數(lg(cfu/g)),菌的相對豐度由1.2.5.2高通量測序結果分析得來,菌落總數由1.2.5.3中檢測得來。

1.3 數據處理

每組實驗做5個平行,運用Excel 進行數據分析與處理,采用SPSS 18.0軟件中ANOVA分析進行數據統計與作圖,數據以mean±SD表示。

2 結果與分析

2.1 姜黃素光動力對牡蠣內源性脂質酶活性的影響

空白組和光動力組的牡蠣脂質氧化水解酶的內源酶活性如圖1所示。可以看出在牡蠣體內,脂肪氧合酶的活性最高,其次是磷脂酶A2、磷脂酶A1、磷脂酶D、脂肪酶和磷脂酶C,這與王昕岑[6]的研究結果是相似的。

圖1 姜黃素光動力對牡蠣內源脂質氧化水解酶活性的影響

從圖1A中可以看出,光動力組的脂肪氧合酶活性低于空白組,且其脂肪氧合酶的活性降低10%,說明姜黃素光動力可以在一定程度上降低內源性脂肪氧合酶的活性。姜黃素光動力能夠使脂肪酶的活性從(0.04±0.01) U/g降低至(0.03±0.00)U/g,其脂肪酶活性極顯著低于空白組(P<0.01),說明姜黃素光動力能夠降低內源性脂肪酶的活性(圖1B)。圖1C中,姜黃素光動力處理能夠使磷脂酶A1的活性降低約10%,其磷脂酶A1活性呈現出低于空白組的趨勢(圖1C),說明姜黃素光動力能夠在一定程度上降低內源性磷脂酶A1的活性。光動力組的磷脂酶A2活性低于空白組約29%(圖1D),說明姜黃素光動力處理能夠在一定程度上降低內源性磷脂酶A2的活性。圖1F顯示,光動力組的磷脂酶D活性低于空白組約11%,說明姜黃素光動力處理在一定程度上能夠降低內源性磷脂酶D的活性。

從圖1E中磷脂酶C的活性變化可以看出,姜黃素光動力使磷脂酶C的活性略有升高,從(0.0039±0.003) U/g升高至(0.0046±0.005) U/g,這可能是因為姜黃素光動力處理后,磷脂酶C處于更加適宜的環境條件,使磷脂酶C的活性有小幅升高。王昕岑的研究表明,磷脂的水解主要與磷脂酶A2密切相關密切相關,而與其他磷脂水解酶的相關性較小[6],且在本文中,磷脂酶C活性最低,因此內源性磷脂酶C活性的小幅度提高對脂質水解影響較小。

表1 產脂肪酶菌株的測序及序列比對結果

綜上所述,姜黃素光動力可以降低內源性脂肪酶、脂肪氧合酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D酶的活性,延緩牡蠣脂質的氧化和水解。

2.2 姜黃素光動力對牡蠣中產脂質酶菌株的影響

在篩選能夠產生脂質氧化水解酶的菌株時,選擇了新鮮牡蠣作為樣品,發現僅在脂肪酶和磷脂酶C的篩選培養基上出現了陽性結果,沒有篩選到能夠產生脂肪氧合酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D的菌株,這說明在新鮮的牡蠣體內可能不存在產生脂肪氧合酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D的菌株。

2.2.1 產脂肪酶菌株的篩選及其在姜黃素光動力下的數量變化 在篩選產脂肪酶的培養基中含有中性紅,中性紅在中性環境下成黃色,酸性環境下成紅色,菌株產生的脂肪酶可以將橄欖油水解為脂肪酸,使中性紅呈現紅色,因此,在產脂肪酶的菌株周圍會產生紅色的水解圈。在篩選牡蠣體內產脂肪酶菌株的過程中,篩選出了兩株產脂肪酶的菌株(圖2)。兩株菌株在菌落形態上所不同,Lipase-1為白色菌落,菌落較小且凸起,邊緣光滑,Lipase-2為白色菌落,菌落小且較為扁平,邊緣光滑,經16S rRNA測序并在NCBI 序列比對鑒定,兩株菌株均為假單胞菌(Pseudomonas)。

圖2 產脂肪酶的菌株篩選結果

假單胞菌廣泛存在于土壤和海水中,是一種無芽孢、有鞭毛、能運動的革蘭氏陰性菌。假單胞菌是貝類腐敗過程中的優勢菌,這是因為它可以產生脂肪酶、蛋白酶等多種酶[21-22]。對假單胞菌產生脂肪酶的研究較為廣泛,查代明等認為在所有微生物來源的脂肪酶中,假單胞菌產生的脂肪酶具有最好的性能[23],羅偉認為在低溫條件下,假單胞菌更易產生脂肪酶[24],這與本文中的測序結果是吻合的。

根據16S rDNA測序數據分析,將假單胞菌的數量變化進行了統計(圖3),發現姜黃素光動力處理極顯著降低了假單胞菌的數量(P<0.01)。因此推測,姜黃素光動力一方面通過直接作用于牡蠣的內源性脂肪酶,并降低其活性,另一方面也可以減少分泌脂肪酶的菌數量,從而減少外源脂肪酶的量。

圖3 姜黃素光動力對假單胞菌數量的影響

2.2.2 產磷脂酶C(PLC)菌株的篩選及其在姜黃素光動力下的數量變化 在篩選產磷脂酶C的培養基中,在產磷脂酶C的菌株周圍會產生透明的水解圈。水解圈的形成是因為菌株產生的磷脂酶C會分解卵黃液中的卵磷脂。在篩選牡蠣體內產磷脂酶C菌株的過程中,篩選出了兩株產磷脂酶C的菌株(圖4)。兩株菌株在菌落形態上所不同,PLC-1為白色菌落,菌落較大,中間凸起,邊緣光滑,PLC-2為淡黃色菌落,圓形,邊緣光滑,菌落中間隆起,經16S rRNA鑒定后,PLC-1為腸桿菌(Enterobacteriaceae),PLC-2為嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas)。

圖4 產磷脂酶C的菌株篩選結果

嗜麥芽寡養單胞菌是一種在養殖水體中普遍存在的菌類,是革蘭氏陰性桿菌,兩端鈍圓,無莢膜,無芽孢[25-26]。腸桿菌是一類革蘭氏陰性菌。Fox等從牛奶中分離產生磷脂酶C的菌株,發現有三株屬于腸桿菌,這說明腸桿菌中的確存在可以產生磷脂酶C的菌株[27]。

根據16S rDNA測序數據分析,將腸桿菌和嗜麥芽寡養單胞菌的數量變化進行了統計(圖5),結果表明,姜黃素光動力極顯著降低了這兩種菌的數量(P<0.01)。因此,姜黃素光動力可以減少分泌磷脂酶C的菌數量,減少產酶量。

表2 產磷脂酶C菌株的測序及序列比對結果

圖5 姜黃素光動力對腸桿菌(A)和嗜麥芽寡養單胞菌(B)數量的影響

綜上所述,姜黃素光動力通過減少產酶菌株的數量,減少外源性脂肪酶和磷脂酶C的數量,延緩牡蠣脂質的劣化。

3 結論

姜黃素光動力能夠通過降低牡蠣內源性脂肪氧合酶、脂肪酶、磷脂酶A1、磷脂酶A2、磷脂酶D的活性延緩脂質劣化,也可以通過減少分泌脂肪酶的菌(假單胞菌)、分泌磷脂酶C的菌(腸桿菌和嗜麥芽寡養單胞菌)數量,減少外源脂質酶的數量,來延緩牡蠣脂質的劣化。

本研究從酶的角度闡明了姜黃素光動力延緩牡蠣脂質氧化水解的機理,但脂質的水解和氧化可能并不僅僅是由于酶引起的,在后續實驗中可以通過分析微生物組成,解析微生物與脂質劣化的關系,從多個角度闡明姜黃素光動力延緩脂質劣化的機理,為該技術在貝類保鮮中推廣應用提供更加全面的理論依據。