氧化對兔肉肌原纖維蛋白結構、乳化性和凝膠性的影響研究

葉鳳凌,池玉閩,周敏之,王 琴,賈利蓉,*,董 怡,*

(1.四川大學輕工科學與工程學院,四川成都 610065;2.渭南市食品藥品檢驗所,陜西渭南 714000)

兔肉不僅含有人體所需的8種必需氨基酸，還是一種高蛋白質、高n-3多不飽和脂肪酸、低脂肪、低膽固醇的健康肉類[1],其是鉀、磷、硒、B族維生素等營養素的良好來源[2]。兔肉的營養特性滿足了現代消費者對健康生活方式的渴望,具有廣泛的市場。肌原纖維蛋白(Myofibrillar Protein,MP)是兔肉中最重要的蛋白質,主要包括肌球蛋白、原肌球蛋白、肌動蛋白、肌動球蛋白和肌鈣蛋白等,其含量占肌肉總蛋白含量的60%左右,因此MP的結構及功能特性與肉品的凝膠性、表面疏水性、流變學特性、持水性、乳化性、質構特性等性質密切相關,直接影響著肉品品質[3]。

兔肉中豐富的不飽和脂肪酸使其具有很高的營養價值,也使其具有較高的油脂氧化敏感性[4]。肉品中脂質氧化的中間產物和終產物、活性氧(Reactive oxygen species,ROS)、金屬離子和其他來源于肌肉或在肉類加工過程中產生的氧化劑的影響而導致氧化損傷[5-7]。蛋白質氧化可引起蛋白質的骨架和側鏈的改變,從而導致蛋白質的一級、二級和三級結構發生改變[8]。這些結構變化可以誘導蛋白質的構象和功能改變,包括肽主鏈的斷裂、交聯、展開,氨基酸殘基的氧化修飾[9-10]等蛋白結構的改變,以及蛋白的持水性、乳化性、凝膠性等功能性質的變化[11],從而影響肉品質量和肉制品的加工性能[8]。

肉品中的蛋白質氧化是通過類似于脂質氧化的自由基鏈式反應進行的[12]。2,2′-鹽酸脒基丙烷(2,2′-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride,AAPH)是一種水溶性自由基引發劑,其熱解生成的烷過氧自由基(ROO·)能夠引發脂質氧化[13]。烷過氧自由基具有反應速率常數高的特點,可以大面積作用于蛋白質,對其進行氧化修飾,造成蛋白質氨基酸殘基的氧化損傷,改變蛋白的聚集程度,影響MP表面疏水性、乳化性、凝膠性等多種功能性質,從而影響肉品的營養性[14-16]。

我國是世界上最主要的兔肉生產和消費國,在一定程度上中國的兔肉制品及其加工的發展代表了兔肉制品在亞洲乃至世界的發展趨勢,但是目前肉及肉制品的蛋白氧化研究主要集中在屠宰后,肉品的宰后成熟、處理方式、加工及儲運過程中蛋白質的氧化變性對肉品品質的影響,且多針對豬肉[17]、牛肉[18]、魚肉[19]及禽類[20],對兔肉蛋白氧化的研究相對較少。目前,兔肉消費以原料肉為主,市場上銷售的即食兔肉產品種類非常有限[21],我國學者對兔肉的研究還處于初步階段[22],且多集中在:通過改變飼養條件和飼料組分提高兔肉質量[23-24],優化保鮮條件維持兔肉品質[25],不同風味兔肉產品的研發[26],以及兔肉脂質中脂肪酸組成及氧化作用[27]等方面。理論研究的不足使我國兔肉產品技術含量較低,加工成本高,缺少核心競爭力,產品附加值低,不利于我國兔肉產品的加工產業的發展。

本研究通過誘導AAPH熱降解產生ROO·作為油脂氧化的代表性自由基中間體,作用于兔肉MP,以研究不同氧化程度下兔肉肌原纖維蛋白結構及性質的變化,以期為肉類產品中脂質和蛋白質氧化之間相關性的深入研究提供依據,為兔肉加工過程中的氧化控制、品質管理、技術改造及工藝配方的改進提供理論指導,有利于深化兔肉的綜合加工與利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

屠宰的四川白兔(體重2500～2900 g) 購自中國四川省成都市當地市場;氯化鈉、氯化鎂、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、三氯乙酸、尿素、十二烷基磺酸鈉、2,4-二硝基苯肼 均為分析純,成都科龍化工試劑廠;乙酸乙酯、無水乙醇、鹽酸 均為分析純,成都市科隆化學品有限公司;EDTA、甘氨酸、鹽酸胍、Tris BioFroxx公司;DNPH 源葉生物公司;溴酚藍 成都金山化學試劑有限公司;AAPH 西格瑪奧德里奇貿易有限公司;SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液 Biosharp公司;SDS-PAGE凝膠制備試劑盒 Solarbio公司。

1736R高速冷凍離心機 Labogene公司;GelDoc XR+凝膠成像系統、Universal Hood II凝膠電泳儀 BIO-RAD公司;Synergy H1多功能微孔板檢測儀 BioTek Instruments,Inc;UV-18008PC紫外可見分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;TA-XT plus質構儀 Stable Micro Systems Ltd;SQP電子天平 奧多利斯科學儀器有限公司;FSH-2A可調高速勻漿機 常州潤華電器有限公司;DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器 北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 兔肉MP的提取 參考Xiong等[28]的方法,并進行了適當修改。從兔肉背長肌中提取MP,用攪拌器將約80 g肌肉切碎并斬拌60 s,使其成為均勻的肉糜,加入4倍體積的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L,含150 mmol/L NaCl,25 mmol/L KCl,3 mmol/L MgCl2和4 mmol/L EDTA)。使用勻漿機以10000 r/min在冰水浴中持續均質60 s。混合物經兩層紗布過濾,濾液在4 ℃,5000×g條件下離心15 min,沉淀用KCl溶液(pH7.0,50 mmol/L)和PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L,不含鹽)洗滌兩次。所獲沉淀為MP提取物,冷藏并在72 h內使用。

1.2.2 AAPH熱分解建立ROO·氧化體系 兔肉MP的氧化是參考Xiong等[28]的方法,并進行適當修改。將1.2.1中提取得到的兔肉MP以牛血清蛋白(BSA)為標準,用雙縮脲法測定其濃度,并用0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)稀釋MP溶液使蛋白濃度為30 mg/mL,與不同濃度的AAPH(0、0.2、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mmol/L)水溶液在37 ℃下避光反應24 h。反應結束后,立即將混合物在4 ℃、6000×g條件下離心15 min以去除AAPH,并用蒸餾水洗滌兩次。對照組MP(30 mg/mL)懸浮于含0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)后,立即在4 ℃、6000×g條件下離心15 min,并用蒸餾水洗滌兩次。

1.2.3 羰基含量的測定 MP的羰基含量參照Oliver等[29]所述方法測定,并進行適當修改。將不同氧化程度的MP分散在含有0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)中,蛋白濃度統一調整為4 mg/mL(MP以BSA為標準,用雙縮脲法測定其濃度)。將200 μL MP溶液加入200 μL 0.01 mol/L的2,4-二硝基苯肼(2,4-dinitrophenylhydrazine,DNPH;溶于2 mol/L HCl中)中,并在室溫下避光反應1 h。在反應期間反應液每15 min渦流混合一次。加入100 μL 50%三氯乙酸(Trichloroacetic acid,TCA)溶液以終止反應,并于4 ℃、11000×g條件下離心5 min,沉淀用1 mL乙醇和乙酸乙酯混合物(1∶1,v/v)洗滌3次,于通風櫥內揮干試劑,37 ℃水浴溶解于500 μL 6 mol/L鹽酸胍溶液(溶于2 mol/L HCl)中30 min,再次離心。上清液在370 nm處測量吸光度。不含DNPH的2 mol/L HCl溶液作為對照組。羰基含量計算公式:

式中:A表示370 nm波長處的吸光度;n表示稀釋倍數;ε表示摩爾吸光系數22000/(L/(mol·cm));ρ表示蛋白質質量濃度,mg/mL。

1.2.4 巰基的測定 參照Zhang等[30]的方法,并適當修改。將50 μL不同氧化程度的MP溶液(用上文所述NaCl的PBS緩沖液稀釋樣品至2 mg/mL),10 μL含DTNB(10 mmol/L)的Tris-Gly溶液(pH8.0)和200 μL含8 mol/L尿素的Tris-Gly溶液(pH8.0)依次添加到96孔板中。將混合物在25 ℃下避光反應30 min,使用酶標儀在412 nm處測定吸光度。對照組用不含DTNB的Tris-Gly溶液(pH8.0)處理。最終結果以蛋白巰基含量(nmol/mg肌原纖維蛋白)表達。

式中:A表示412 nm波長處的吸光度;n表示稀釋倍數;ε表示摩爾吸光系數136000/(L/(mol·cm));ρ表示蛋白質質量濃度,mg/mL。

1.2.5 二聚酪氨酸含量的測定 參考李學鵬等[31]所述的方法測定二聚酪氨酸含量,并適當修改。將不同氧化程度的MP溶液(用上文所述NaCl的PBS緩沖液稀釋樣品至0.2 mg/mL)和含0.6 mol/L KCl的PBS緩沖液(pH6.0,20 mmol/L)以體積比1∶3混合均勻。用濾紙過濾,收集濾液。蛋白質含量用雙縮脲法測定。濾液在激發波長325 nm,發射波長420 nm條件下測定熒光強度。二聚酪氨酸的量以相對熒光值AU表示,即熒光強度除以蛋白質濃度。

1.2.6 表面疏水性的測定 參考Sun等[32]所述的方法對表面疏水性進行測定。將100 μL溴酚藍溶液(1 mg/mL)與0.5 mL 不同氧化程度的MP溶液(4 mg/mL)充分混合。對照組用PBS緩沖液(pH7.0)替代MP溶液。25 ℃下水浴振蕩10 min后在8000 r/min下離心10 min。上清液用含0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)按10∶1稀釋。在595 nm處測定稀釋液的吸光度,選擇PBS緩沖液作為空白。以下公式給出的溴酚藍結合量用作疏水性指數:

1.2.7 內源性熒光強度的測定 參考Xu等[33]的方法,用含有0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)稀釋不同氧化程度的MP溶液至0.5 mg/mL。對樣品掃描內源性熒光光譜(Ex:295 nm,Em:308～400 nm,激發和發射狹縫寬度為2 nm)。不含蛋白的0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)作為空白對照。

1.2.8 粒徑的測定 參考Bao等[34]的方法,用含有0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)稀釋不同氧化程度的MP溶液至1 mg/mL。在室溫下,以PBS緩沖液作為分散劑,使用粒度儀測定MP的粒徑分布,每個樣品進行12次分析。

1.2.9 聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE) 參考Flores等[35]的方法并適當修改。將不同氧化程度的MP溶液(8 mg/mL)用上樣緩沖液1∶1稀釋,然后沸水浴加熱3 min,SDS-PAGE采用12%丙烯酰胺分離膠和4%丙烯酰胺濃縮膠。標記蛋白選擇分子量為11～245 kDa。每孔加入10 μL樣品。電泳在電泳緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,384 mmol/L甘氨酸,0.1%十二烷基硫酸鈉,pH8.3)中進行。電泳結束后用考馬斯亮藍(R-250)染色0.5 h,用含10%甲醇和10%醋酸的水溶液浸泡1 h洗脫多余染色劑,最后使用凝膠成像儀拍照。

1.2.10 乳化性能的測定 參考李學鵬等[31]的方法并稍作調整。用含有0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7,50 mmol/L)稀釋不同氧化程度的MP溶液至1 mg/mL。將大豆油分散在MP懸浮液(v∶v=1∶4)中制備水包油乳劑25 mL,置入相同的塑料離心管(直徑2.5 cm)內。乳劑在室溫下以10000 r/min均質1 min,從離心管底部5 mm處取40 μL新制備的乳狀液,分散于4 mL 0.1% 十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液中。乳液在室溫下靜置10 min后在500 nm處測定吸光度,并記錄為A0。以0.1% SDS溶液做空白。10 min后在離心管相同位置再次進行上述處理,吸光度值記作A10。乳化活性和乳化穩定性分別表示為EAI(m2/g)和ESI(%)。

式中,A500表示在500 nm處的吸光度;ρ表示蛋白質質量濃度,g/mL;φ表示乳化液的油體積分數(v/v)；2、2.303為固定常數。

式中,A10和A0分別表示在500 nm處0 min和靜置10 min后時的吸光度。

1.2.11 熱凝膠的制備與測定

1.2.11.1 熱凝膠的制備 參考Xia等[36]的方法,并稍有修改。用含有0.6 mol/L NaCl的PBS緩沖液(pH7.0,50 mmol/L)稀釋不同氧化程度的MP溶液至30 mg/mL。取5 g MP溶液放入平底西林瓶(直徑22 mm,高50 mm)中,并在20 ℃時放入恒速升溫水浴鍋中以1.2 ℃/min的增量加熱至75 ℃,保持10 min后停止加熱并立即在冰浴冷卻1 h,并在4 ℃冰箱中保存過夜,制得蛋白凝膠。

1.2.11.2 凝膠的質構分析 參考Xiong等[28]的方法,使用質構儀對樣品進行質構分析。凝膠在冰箱中4 ℃固化過夜后,除去表面液體,在25 ℃水浴中平衡凝膠樣品1 h。探針類型選擇P/0.5。預速度、測試速度和后速度分別設置為1.0、0.5和1.0 mm/s。測量距離為5.0 mm,觸發力為5 g,觸發方式為自動。數據采集時間為200 pps。最后表示為硬度、彈力、凝聚力和咀嚼性。

1.3 數據處理

所有試驗均平行三次操作,數據以平均值±標準差(SD)表示。采用Origin 8.0軟件分析并作圖,SPSS軟件對數據結果進行統計分析。平均值之間在P<0.05時差異顯著。所有樣品均至少設置3個重復。

2 結果與分析

2.1 AAPH濃度對兔肉MP中羰基含量的影響

圖1為ROO· 氧化體系中AAPH濃度對兔肉MP羰基含量的影響。對照組的羰基含量為0.85 nmol/mg,在37 ℃反應24 h,AAPH濃度為0 mmol/L的樣品組的羰基含量與對照組無顯著差異。而隨著AAPH濃度的增加,MP羰基含量逐漸增加,在10 mmol/L AAPH處理下羰基含量高達3.44 nmol/mg。其中,AAPH濃度為2.5 mmol/L的處理組較1.0 mmol/L的處理組羰基含量顯著升高(P<0.05),而濃度繼續升高時羰基含量增加緩慢,說明2.5 mmol/L AAPH可高效引起MP氧化羰基化。蛋白質羰基含量是評判蛋白質氧化程度的敏感性指標[37]。丙二醛(MDA)作為脂質氧化的副產物也能促進家兔MP的羰基化[38]。羰基是蛋白發生氧化的標志性產物,結果顯示,兔肉MP的氧化程度隨AAPH濃度增加而升高。羰基含量的增加可能與賴氨酸、蘇氨酸、脯氨酸等氨基酸的側鏈易被氧化形成羰基衍生物有關[39],此外,氧化引起的肽鏈斷裂也會引起羰基增加[40]。本實驗結果表明,ROO·自由基可以引起兔肉MP中羰基含量顯著增加(P<0.05),促進蛋白氧化反應的發生。

圖1 AAPH濃度對兔肉MP中羰基含量的影響

2.2 AAPH濃度對兔肉MP中游離巰基含量的影響

肌球蛋白和肌動蛋白是MP中含量最高的2種蛋白質,肌球蛋白分子中約含有42個巰基,肌動蛋白分子中約含有12個巰基[41]。蛋白氧化可導致一些敏感性含硫氨基酸,如半胱氨酸、蛋氨酸等中的游離巰基被氧化成二硫鍵,造成巰基含量減少,因此,巰基含量可作為檢測蛋白質氧化程度的指標。

圖2顯示了ROO·氧化體系中AAPH濃度對兔肉MP游離巰基含量的影響,對照組的游離巰基含量為55.52 nmol/mg,隨著AAPH濃度的升高,游離SH含量顯著降低(P<0.05),10 mmol/L AAPH處理組游離巰基含量降至4.26 nmoL/mg。巰基含量的變化主要源于兩個方面:敏感性含硫氨基酸(如半胱氨酸、蛋氨酸)的游離巰基受自由基攻擊后會被氧化形成二硫鍵,使MP巰基含量減少;氧化導致蛋白質結構伸展,從而使臨近的游離巰基相互交聯形成二硫鍵[6]。Zhou等[42]研究豬肉MP氧化情況時,發現隨著AAPH濃度增大,MP中游離巰基下降,而二硫鍵含量升高,推測MP氧化引起蛋白斷裂或聚集等結構方面的改變使游離巰基間距縮小,游離巰基形成了二硫鍵交聯。本研究中兔肉羰基含量和游離巰基含量的變化說明了AAPH熱分解產生ROO·的氧化體系可引起兔肉MP中側鏈氨基酸的氧化,從而使MP發生氧化修飾,且隨著AAPH濃度增大,MP氧化程度越大。

圖2 AAPH濃度對MP中游離巰基含量的影響

2.3 AAPH濃度對MP中二聚酪氨酸含量的影響

酪氨酸易受活性氧自由基氧化攻擊,屬于敏感型氨基酸。在蛋白氧化過程中會產生越來越多的酪氨酸自由基和酪氨酸殘基,相互結合形成二聚酪氨酸[32]。二聚酪氨酸含量可用相對熒光值(AU)來表示[43]。本研究發現,在氧化體系中,二聚酪氨酸含量變化類似于羰基含量,相較于對照組,高濃度的AAPH(10.0 mmol/L)可以導致二聚酪氨酸含量的顯著增加(P<0.05)。這與Chen等[43]及崔文斌[44]發現的氧化強度增加可顯著提升肉蛋白中二聚酪氨酸含量的研究結果相符。本研究結果說明,酪氨酸殘基對ROO·自由基也很敏感,易在ROO·自由基攻擊下發生交聯聚合形成二聚酪氨酸,這也進一步說明ROO·自由基氧化體系可影響MP結構。

圖3 AAPH濃度對兔肉MP中二聚酪氨酸含量的影響

2.4 AAPH濃度對兔肉MP表面疏水性的影響

圖4顯示了AAPH濃度對兔肉MP表面疏水性的影響,對照組的表面疏水性最弱,隨著AAPH濃度的增加(0～0.2 mmol/L),兔肉MP的表面疏水性顯著增強(P<0.05),這很可能是由于蛋白質氧化引起的蛋白質三級結構展開,疏水性基團暴露增加從而表現出疏水性的上升[30,45]。AAPH濃度為0.2～2.5 mmol/L時,表面疏水性隨AAPH濃度增加有所減弱但變化不顯著(P>0.05)。這可能是由于MP表面的疏水性基團通過疏水相互作用聚集使得表面疏水性降低,氧化引起MP結構的裂解和聚集是同時發生的,但這一時期的聚集強度稍強[46]。進一步提高AAPH濃度后(2.5～10.0 mmol/L),MP表面疏水性再次增加,可能是當氧化太劇烈時,聚合的蛋白質結構被破壞,非極性氨基酸再度暴露于蛋白質外表面,表面疏水性再次增強。本研究結果表明,氧化可以改變MP的構象結構,從而影響其表面疏水性[47]。

圖4 AAPH濃度對兔肉MP表面疏水性的影響

2.5 AAPH濃度對兔肉MP內源性熒光的影響

蛋白質分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸具有熒光性,蛋白質熒光光譜的變化可以用于反映和監測蛋白質的構象變化,色氨酸熒光法已被廣泛應用于蛋白質三級構象變化的檢測[48-49]。在圖5中可以發現,隨著AAPH濃度的增加,蛋白質的內源性熒光強度逐漸降低,表明在氧化過程中蛋白質顯色氨基酸的顯色基團位置發生改變或遭到破壞。方海硯等[50]也觀察到羥自由基氧化體系中MP內源熒光強度隨著H2O2濃度的增大而逐漸降低。本研究發現,與對照組相比,經24 h 37 ℃保溫處理后,無添加AAPH的樣品熒光強度明顯降低,但在羰基和游離巰基的含量變化上兩組差異不顯著,說明熱處理對兔肉MP熒光強度有影響,而對羰基含量和巰基含量無影響。

圖5 AAPH濃度對兔肉MP內源性熒光的影響

2.6 AAPH濃度對兔肉MP粒徑的影響

MP平均粒徑的變化可以反映蛋白質交聯聚集或破碎的狀態。如圖6所示,隨著AAPH濃度的增加,蛋白粒徑逐漸增大,當AAPH濃度為5.0 mmol/L時,粒徑達到最大值,為4200 nm。而當AAPH濃度持續增加到10.0 mmol/L時,粒徑減小到2670 nm。這說明一定濃度范圍(AAPH 0～5.0 mmol/L)內,ROO·氧化體系引起的蛋白氧化有利于粒徑小的蛋白發生分子間聚集,使蛋白粒徑增加;而當MP被過度氧化,則會導致肽鏈斷裂,從而使蛋白粒徑降低。周麟依等[51]研究也發現0～10 mmol/L的MDA處理條件下,MDA濃度越高蛋白粒徑越大。

圖6 AAPH濃度對兔肉MP粒徑的影響

2.7 AAPH濃度對兔肉MP凝膠電泳圖譜的影響

目前,測定蛋白裂解、交聯程度常用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE),根據電泳圖譜上不同樣品條帶間的差異可判斷蛋白質是否存在裂解或交聯聚合反應[52]。如圖7所示,兔肉MP分子量分布主要集中在100～245和35～48 kDa范圍內,從對照組到添加1.0 mmol/L AAPH的處理組,隨著AAPH濃度的增加,肌球蛋白重鏈(Myosin HC,210 kDa)、肌動蛋白(Actin,42 kDa)和肌球蛋白輕鏈(Myosin LC,15～24 kDa范圍)的電泳條帶強度明顯降低,而在100～180 kDa范圍內出現新的條帶,且條帶隨AAPH的增加而變清晰,這可能是分子量大于180 kDa的蛋白質輕度氧化而降解以及小分子量蛋白發生交聯的共同結果。當AAPH濃度達到10.0 mmol/L時,所有條帶明顯減弱,幾乎完全消失,這表明劇烈氧化造成了蛋白質發生了降解。由此可知,在AAPH熱分解產生ROO·氧化體系中,兔肉MP在低氧化濃度下可同時發生小分子量蛋白質交聯聚集和大分子量降解,而在高氧化濃度下則以蛋白質降解為主,這與Zhang等[30]的研究結果相似。

圖7 AAPH濃度對兔肉MP SDS-PAGE圖譜的影響

2.8 AAPH濃度對兔肉MP乳化性的影響

乳化作用是將兩種互不相溶的液體均勻的混合在一起的作用,乳化性是蛋白質重要的功能性質之一[53]。蛋白乳化性可影響肉品的彈性、嫩度、保水性等性能,是肉蛋白的重要功能性質之一。乳化性可以通過乳化活性和乳化穩定性來表達,乳化活性反映了在乳液形成過程中,蛋白質在油/水界面的吸附能力[54],乳化穩定性是指防止相分離(抵抗乳狀分層、絮凝和沉淀等分離現象)維持乳狀液穩定的能力[16]。

由圖8和圖9可知,隨著AAPH濃度增大,兔肉MP的乳化活性逐漸上升,而乳化穩定性呈下降趨勢,但均僅在AAPH濃度較大時與對照組有顯著差異(P<0.05,乳化活性中AAPH濃度≥2.5 mmol/L,乳化穩定性中AAPH濃度≥5.0 mmol/L),說明較強的氧化具有顯著改變兔肉MP乳化活性及乳化穩定性的效果。這可能是因為蛋白經過氧化,結構伸展,展露出更多的親油基團和親水基團,能夠較好地交聯油相和水相,因此乳化活性上升;同時,蛋白質不斷地聚集和變性,連續相中沒有足夠的蛋白質來完全包裹住脂肪滴,乳濁液分層加快,表現出乳化穩定性下降的趨勢。

圖8 AAPH濃度對兔肉MP乳化活性的影響

圖9 AAPH濃度對兔肉MP乳化穩定性的影響

2.9 AAPH濃度對兔肉MP凝膠質構的影響

熱加工條件直接影響著MP熱誘導形成凝膠的質地,與肉品的組織結構、外觀和持水性等密切相關,影響肉品的經濟效益。兔肉MP熱制凝膠的質構特性如凝膠硬度(g)、彈力(mm)、凝聚力及咀嚼性(N×mm)的變化分別如圖10所示,凝膠的四項質構指標均隨著AAPH添加量的增加先升高后下降,并在1.0 mmol/L達到最高,可見輕度氧化能夠改善兔肉MP凝膠的硬度等特性[55],而過度氧化可導致凝膠的彈性、凝聚力等性質變差[42,56]。有研究顯示,由羥基自由基誘導的鳙魚MP的適度氧化可形成彈性良好的凝膠網絡,提高蛋白質凝膠的質地和保水力[57]。Zhou等[42]研究發現高濃度AAPH引起的肌球蛋白降解會導致凝膠網絡變差。二硫鍵和非二硫共價鍵是形成MP凝膠體系的關鍵,而離子鍵與氫鍵不是維持凝膠穩定構象的主要化學作用力[58],非二硫共價鍵為熱誘導凝膠中主要的化學作用力,氧化程度過高可破壞非二硫共價鍵使得凝膠強度降低[59]。

圖10 AAPH濃度對兔肉MP凝膠質構的影響

2.10 相關性分析

由表1可知,游離巰基與二聚酪氨酸(r=-0.950)、羰基含量(r=-0.968)、乳化活性(r=-0.981)、蛋白粒徑(r=-0.867)均呈現極顯著負相關(P<0.01),與內源性熒光(r=0.944)、乳化穩定性(r=0.880)極顯著正相關(P<0.01);羰基含量與二聚酪氨酸(r=0.951)、乳化活性(r=0.975)、蛋白粒徑(r=0.798)呈顯著正相關(P<0.05),與內源性熒光(r=-0.931)、乳化穩定性(r=-0.919)極顯著負相關(P<0.01),可以看出,各蛋白氧化指標之間均有一定的相關性,其中部分指標之間有極強的相關性,說明在蛋白氧化過程中,多種物理化學反應同時在發生,并相互影響。硬度與彈力、咀嚼性、凝聚力這幾項物性指標相互之間均有極顯著的正相關性(P<0.01),表明隨氧化的進行,蛋白凝膠的物理特性變化方向一致。

表1 各指標相關性分析

3 結論

本研究采用不同濃度AAPH形成的烷過氧自由基對兔肉MP進行氧化,以探討不同氧化程度對兔肉MP的影響。隨著AAPH濃度的升高,蛋白的游離巰基含量、內源性熒光強度、蛋白乳化穩定性呈下降趨勢,而羰基含量、二聚酪氨酸含量、蛋白粒徑則呈上升趨勢,表明AAPH形成的烷過氧自由基模擬氧化體系能夠對兔肉MP產生明顯地氧化作用,且隨著AAPH濃度升高兔肉MP氧化程度加劇,引起蛋白質空間構型發生改變,蛋白質之間的交聯程度上升,疏水基團遷移,導致MP表面疏水性和粒徑發生了變化,也使蛋白質的乳化活性逐漸增強而乳化穩定性逐步降低。熱誘導凝膠強度和SDS-PAGE結果進一步表明,適度氧化導致大分子蛋白質的松弛和斷裂有助于促進凝膠網絡的形成,改善蛋白質凝膠的結構;而過度氧化會嚴重破壞蛋白質結構,削弱其凝膠形成能力和熱誘導凝膠強度,導致凝膠硬度、彈力、凝聚力、咀嚼性等性質變差。由此可見,MP氧化能夠明顯改變兔肉蛋白的結構和性質,在實際生產中能夠對兔肉的肉品品質產生影響。因此,兔肉在后續生產加工中應控制蛋白氧化程度以保障肉品品質。

后續可進行人體胃腸消化模擬,研究兔肉MP氧化后體外消化特性的變化,探究氧化對兔肉MP體外消化特性的影響,進一步對兔肉制品的生產提供理論指導。