茶多酚金屬絡合物的制備及其抑菌活性

王旭捷,陳春鳳,楊 慧,李 潔,楊曉萍

(華中農業大學園藝林學學院,園藝植物生物學教育部點實驗室,湖北武漢 430070)

茶多酚(tea polyphenols,TP)是茶葉中含有的多種不同酚類及其衍生物的總稱;研究表明TP具有抗氧化、抑菌、防癌抗癌、抗輻射、防突變等作用,還具有阻斷脂肪物質氧化、保持人體生理活性以及緩解運動疲勞的作用[1-2]。TP的分子結構中含有多個酚羥基,分子內有大的π鍵共軛體系和強配位的氧原子,這樣的空間構型使其具有較強的絡合金屬離子的能力,是金屬離子的良好配體;且金屬離子的吸電子作用可促進酚羥基上的H游離。當TP與金屬離子相遇時,TP作為多基配體在其鄰位酚羥基上形成以金屬離子為中心的穩定的茶多酚金屬絡合物[3-5]。茶多酚形成金屬絡合物后其生物活性會受到影響,有研究表明TP-Zn絡合物對DPPH自由基、超氧陰離子自由基及羥基自由基的清除能力均強于TP[6]。

金屬離子與TP絡合對TP生物活性的影響,特別是對其抑菌活性的影響引起了人們的廣泛關注。研究表明,TP-Zn絡合物對多種口腔致病菌的抑菌活性均高于TP,TP-Cu絡合物對金黃色葡萄球菌的抑菌率與TP相比提高了27.6%,TP-Zn絡合物對大腸桿菌的抑菌率與TP相比提高了46.2%等[7-9]。可見,茶多酚金屬絡合物有作為一類安全高效天然抑菌劑應用的潛能。然而,由于可與茶多酚絡合的金屬離子種類繁多,不同茶多酚金屬絡合物的抑菌活性不同,且有些金屬離子毒性大、價格高、或與茶多酚絡合所需條件高等原因[10],有必要對茶多酚金屬絡合物的制備及其抑菌活性展開系統的研究。

本文擬以茶多酚鎘(TP-Cd)絡合物的制備工藝為研究對象,確定TP-Cd絡合物最佳制備工藝并制備12種不同茶多酚金屬絡合物;在此基礎上,研究這些絡合物對金黃色葡萄球菌和軟腐病菌的抑菌效果,對茶多酚金屬絡合物的抑菌活性進行評估,以期為茶多酚金屬絡合物在微生物防治等方面的應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

ATCC6538金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus) 廣東省微生物菌種保藏中心;軟腐病菌(Rhizopusstolonifera) 從典型的桃軟腐病果果實上分離、純化、鑒定,實驗室保存；茶多酚 純度≥98%,安徽紅星藥業股份有限公司;其他試劑 分析純,國藥集團化學試劑有限公司。

AUW220D型電子分析天平 日本島津制作所;DW-2型增力無極恒速攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司;LD5-10型離心機 北京醫用離心機廠;PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司;SW-CJ-1FD型超凈工作臺 北京東聯哈爾儀器制造有限公司;MS2000型紫外可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;IS-RDD3型臺式恒溫搖床 美國Crystal公司;SPL-259型生化培養箱 天津市萊玻特瑞儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 TP-Cd絡合物的制備工藝

1.2.1.1 工藝流程 茶多酚與氯化鎘溶液→均勻混合→NaHCO3溶液調節pH→1000 r/min勻速攪拌→4200 r/min離心10 min→去離子水、乙醇、丙酮依次洗滌→收集沉淀→-80 ℃冷凍干燥→TP-Cd絡合物

1.2.1.2 制備條件的篩選 根據上述工藝流程,稱取TP和氯化鎘分別溶解于250 mL水中,進行單因素實驗,考察制備條件中各因素變量對茶多酚沉淀率的影響。TP-Cd絡合物的制備條件為:固定反應條件為TP/Cd2+摩爾比1∶3,反應溫度30 ℃,反應時間30 min,考察pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)對茶多酚沉淀率的影響;固定反應條件為TP/Cd2+摩爾比1∶3,pH為6.5,反應時間30 min,考察反應溫度(10、20、30、40、50 ℃)對茶多酚沉淀率的影響;固定反應條件為TP/Cd2+摩爾比1∶3,pH為6.5,反應溫度30 ℃,考察反應時間(10、20、30、40、50 min)對茶多酚沉淀率的影響;固定反應條件為pH為6.5,反應溫度30 ℃,反應時間30 min,考察TP/Cd2+摩爾比(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)對茶多酚沉淀率的影響。

采用酒石酸亞鐵比色法測定上清液中殘余茶多酚的含量[11],按下式計算茶多酚沉淀率:

茶多酚沉淀率(%)=(1-上清液中茶多酚的含量/原液中茶多酚的含量)×100

1.2.1.3 最佳條件的優化 在單因素實驗基礎上,選擇TP/Cd2+摩爾比、pH、反應溫度、反應時間為考察因素,采用正交表L9(34)進行正交試驗,正交試驗因素水平設計如表1所示。以茶多酚沉淀率為評價指標進行優化。

表1 正交試驗因素與水平

1.2.2 茶多酚金屬絡合物的制備 在1.2.1的基礎上,分別探究TP-Cu、TP-Zn、TP-Mn、TP-Pb、TP-Fe(Ⅲ)、TP-Al、TP-Se、TP-K、TP-W、TP-Cr、TP-Ca絡合物的制備工藝,并分別制備茶多酚金屬絡合物。

1.2.3 茶多酚金屬絡合物的抑菌活性

1.2.3.1 培養基的組成 甘露醇氯化鈉培養基(胰蛋白胨10 g,牛肉膏1 g,氯化鈉75 g,甘露醇10 g,酚磺肽0.025 g,瓊脂14 g);PDA培養基(土豆200 g,葡萄糖20 g,瓊脂15～20 g)

1.2.3.2 菌種活化與培養 刮取培養基上少數金黃色葡萄球菌菌落,轉接于甘露醇氯化鈉液體培養基中,置于恒溫搖床37 ℃、180 r/min培養16 h,重復3次。取已活化的菌液100 μL,平板菌落計數法調整菌落濃度[12],4 ℃保存,備用。

圖1 反應條件對茶多酚沉淀率的影響

取預先保存的軟腐病菌,在邊緣生長旺盛處,用打孔器打直徑為1.0 cm的菌餅,將有菌絲一面向下接種到PDA培養基中央,28 ℃培養24 h,重復3次。

1.2.3.3 對金黃色葡萄球菌增殖的影響 分別稱取一定量的TP和茶多酚金屬絡合物,紫外殺菌30 min后,充分溶于無菌水中,按倍半稀釋法配制成濃度梯度為0.8～0.0015625 mg/mL的溶液。吸取金黃色葡萄球菌菌液100 μL,依次接種于1.0 mL不同濃度的樣品溶液中,無菌水為對照,37 ℃、180 r/min作用4.0 h后,分別取樣品液100 μL,均勻涂布在甘露醇氯化鈉培養基上,37 ℃,倒置培養24.0 h,計數,計算抑菌率[13-14]。

1.2.3.4 對軟腐病菌增殖的影響 分別稱取一定量的TP和茶多酚金屬絡合物,紫外殺菌30 min后,充分溶于無菌水中,配制成濃度為8.0和4.0 mg/mL的溶液。取稀釋后的溶液1.0 mL,與9.0 mL的PDA培養基混合,無菌水為對照,制成含樣培養基。

取預先活化好的軟腐病菌,在邊緣生長旺盛處,用打孔器打直徑為1.0 cm的菌餅,將有菌絲一面向下轉移到含樣培養基中央,28 ℃培養至對照長滿培養皿邊緣或不再生長時,測量菌絲直徑,計算抑菌率[15]。

抑菌率(%)=[1-(處理菌絲生長直徑-菌餅直徑)/(對照菌絲生長直徑-菌餅直徑)]×100

1.3 數據處理

2 結果與分析

2.1 TP-Cd絡合物的制備工藝優化

2.1.1 單因素實驗結果 pH、反應溫度、反應時間和TP/Cd2+摩爾比對茶多酚沉淀率的影響如圖1所示。

結果表明,隨溶液pH、反應溫度、反應時間和TP/Cd2+摩爾比的變化,茶多酚沉淀率均呈先升高后降低的趨勢。pH對茶多酚沉淀率的影響較大。TP在酸性環境下比較穩定,但與金屬離子的絡合能力較差;當環境pH逐漸趨于堿性時,TP的反應活性提高,茶多酚沉淀率逐漸達到最大;此時再提高溶液的pH,TP容易失去其結構中的酚羥基配體,氧化成醌類化合物,導致茶多酚沉淀率降低[16]。TP/Cd2+摩爾比也是影響茶多酚沉淀率的一個重要因素。TP/Cd2+摩爾比達到1∶1之前,溶液中的TP沉淀未達到飽和,隨著Cd2+濃度的增加,茶多酚沉淀率逐漸增大;當TP/Cd2+摩爾比為1∶1時,茶多酚沉淀率達到最大。由于Cd2+與TP絡合有其特定的配位數,沉淀已達到飽和狀態,過量的Cd2+不僅不再與TP發生絡合反應,還可能引起TP的氧化,使其失去絡合能力[17];故此時繼續增加氯化鎘的用量,茶多酚沉淀率不再升高。除此之外,隨著反應溫度的升高和反應時間的延長,分子擴散速度增快,有效地促進了TP的沉淀;但隨著溫度和時間的持續增加,TP逐漸發生氧化,茶多酚沉淀率下降。綜合考慮成本、能耗等因素,制備條件以TP/Cd2+摩爾比1∶1、pH6.5,30 ℃下作用30 min為宜。

2.1.2 正交試驗結果 對表2試驗結果進行統計分析,表明4種因素均顯著影響茶多酚沉淀率,其影響程度為TP/Cd2+摩爾比(A)>pH(B)>反應溫度(C)>反應時間(D),最優水平組合為A1B2C2D3,即制備TP-Cd絡合物的最優條件為:TP/Cd2+摩爾比為1∶1,反應pH為6.5,反應溫度30 ℃,反應時間30 min;在此條件下,茶多酚沉淀率為93.91%。

表2 正交試驗結果

2.2 不同茶多酚金屬絡合物的制備

分別在其最優條件下制備了12種茶多酚金屬絡合物。

由表3可知不同茶多酚金屬絡合物粉末顏色不同,其中,TP-Cu、TP-Se、TP-Fe(Ⅲ)絡合物以黑色為主,TP-Zn、TP-Mn、TP-Cr絡合物以黃色為主,其余的以棕褐色為主;TP-Al、TP-Fe(Ⅲ)絡合物有金屬光澤,TP-W絡合物略帶金屬光澤。

表3 茶多酚金屬絡合物的顏色

2.3 茶多酚金屬絡合物對金黃色葡萄球菌的影響

表4結果表明,除TP-Se和TP-K絡合物外,與TP相比,其他茶多酚金屬絡合物的抑菌活性均顯著增強。大多數金屬離子與配體絡合后,對配體的生物活性具有明顯的增強效應,這與目前已有的一些研究結果是一致的[18]。在此結果的基礎上,對抑菌活性較好的TP-Cu、TP-Zn、TP-Mn、TP-Cd和TP-Pb絡合物進行進一步地研究。由表5可看出這5種茶多酚金屬絡合物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性有顯著性差異(P<0.05),且具有濃度依賴性,其中,TP-Cu絡合物的抑菌活性最強;TP-Cd絡合物在高濃度下抑菌活性較強,在低濃度下抑菌活性喪失較快。綜合研究結果可知,茶多酚金屬絡合物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性為:TP-Cu>TP-Cd>TP-Zn>TP-Pb>TP-Mn>TP-W≈TP-Al>TP-Fe(Ⅲ)>TP-Cr≈TP-Ca>TP>TP-K>TP-Se。

表4 茶多酚金屬絡合物對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

表5 茶多酚金屬絡合物對金黃色葡萄球菌的抑菌率

2.4 茶多酚金屬絡合物對軟腐病菌的影響

表6結果表明,不同的金屬離子與TP絡合后,對TP抑菌活性的影響存在顯著差異。TP與Cu2+、Cd2+、Zn2+、Se4+、Mn2+絡合后對軟腐病菌的抑菌活性顯著提升,而與Pb2+、Cr2+絡合則使抑菌活性完全喪失。TP及茶多酚金屬絡合物對軟腐病菌的抑菌活性為:TP-Cu≈TP-Cd>TP-Zn>TP-Se>TP-Mn>TP-W>TP-Ca>TP>TP-Al>TP-K>TP-Fe(Ⅲ)>TP-Pb>TP-Cr。

表6 茶多酚金屬絡合物對軟腐病菌的抑菌率

研究普遍認為,TP對細菌和真菌的抑菌作用是通過抑制菌體與菌絲的生長、破壞細胞壁和細胞膜的形成、改變菌體的正常形態、進而影響細胞內生物大分子的功能表達來實現的[19]。TP與金屬離子絡合后,分子的共軛效應增強,使得絡合物與細菌細胞中DNA、蛋白質等的結合能力增強,從而導致抑菌活性增強[20-21]。不僅如此,金屬離子本身具有一定的抑菌活性,TP與金屬離子絡合后可能產生了協同增效作用,從而增強其抑菌活性。不同的金屬離子與TP絡合后形成的絡合物在結構和穩定性上必然存在一定的差異,進而影響它們與細胞膜和細胞內生物大分子的結合和破壞能力[22-24],從而導致它們抑菌活性的不同。

研究還表明茶多酚金屬絡合物對真菌的抑菌活性顯著低于細菌,這與TP對細菌的抑菌活性強于真菌的研究報道一致[25]。這可能是由于真菌和細菌在細胞壁組成成分上的差異影響了TP及茶多酚金屬絡合物對它們的親和力和穿透力,進而影響了抑菌活性，且金屬離子在細胞內酶的催化反應中的作用也各不相同,這些均可能影響茶多酚金屬絡合物對微生物生長和繁殖的作用[26]。

3 結論

茶多酚可與金屬離子絡合形成穩定的茶多酚金屬絡合物,以TP-Cd為代表,其最優制備工藝為:TP/Cd2+摩爾比為1∶1,反應pH為6.5,反應溫度30 ℃,反應時間30 min;不同茶多酚金屬絡合物的抑菌活性存在一定差異,但從整體來看,大多數茶多酚金屬絡合物的抑菌活性顯著優于TP,其中,TP-Cu、TP-Cd和TP-Zn對細菌和真菌均表現出較強的生長抑制作用,抑菌活性最強。TP-Cu、TP-Cd和TP-Zn等絡合物不僅制備工藝簡單,能顯著(P<0.05)增強TP的抑菌活性,還能有效降低重金屬離子的毒副作用，但研究發現其存在溶解性差等問題,這為其研發和實際生產應用帶來了不便,需要通過進一步地研究解決。此外,為了明確其作用機理和實際利用價值,茶多酚金屬絡合物的長效抑菌作用、詳盡的抑菌機理及其對人體是否具有毒副作用都需要進一步的研究來證實。但總體來說,茶多酚金屬絡合物,尤其是TP-Cu、TP-Cd和TP-Zn等絡合物,具有進一步研究并開發成為新型抑菌劑的潛能;該研究不僅為茶資源的綜合利用提供了新的思路,也為天然產物在微生物防治方面的研究、開發與利用提供了理論依據。