鼠李糖乳桿菌與嗜熱鏈球菌協同發酵制備酸花生乳研究

張 筠,趙 晶,陳喜君,楊國力,王雪嬌

(1.黑龍江東方學院,黑龍江哈爾濱 151900;2.黑龍江眾生生物工程有限公司,黑龍江哈爾濱 151900)

花生在我國分布范圍廣泛,是我國主要的油料經濟作物之一,花生營養成分豐富,尤其富含蛋白質和糖類物質,花生蛋白與動物性蛋白營養價值相似,但不含膽固醇,并且花生中含有的不飽和脂肪酸有降膽固醇的作用,能夠預防高血脂、冠心病、心腦血管等疾病[1]。花生中還含有一般糧食作物少見的膽堿和卵磷脂,具有促進腦細胞生長、增強記憶力的功能,能夠起到益智健腦的作用[2]。我國是世界花生的生產、消費和出口大國,但大部分的花生都是作為原料售出,未能更加合理地利用,深加工方面較為薄弱,隨著消費者對功能性食品需求的增大,營養成分全面的發酵花生乳漸漸走進大家視野[3]。

目前國內外學者對益生菌發酵花生乳的關注度越來越高,因為經過發酵后的花生乳能夠改善宿主腸道微生態平衡,產生多種活性物質,并且益生菌在改善宿主生理功能方面優于其他生理菌[4-5]。白衛東等[6]使用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵花生酸奶,并結合響應面試驗優化發酵工藝,得到風味優質的凝固型花生酸奶。劉太林[7]以花生乳、奶粉為研究對象,以綜合評分為指標,優化保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵花生酸奶的制作工藝。Isanga等[8]將花生蛋白酸奶與牛乳酸奶的營養成分進行比較,發現花生蛋白酸奶中蛋白質和脂肪含量較豐富。Sunny-Roberts等[9]用保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的混合菌種,發酵花生種子,最終pH處于4.2左右,在4.00～4.50的可接受范圍內,發酵后的花生乳鈣、磷、鉀的含量增加,蛋白質含量呈上升趨勢,粗纖維和總脂肪含量則相反。Fidelis等[10]研究脫脂和全脂花生大豆酸奶配方的優化,結果表明,在脫脂花生大豆酸奶中的碳水化合物與總固形物含量較高。通過以上介紹可知,在制備酸花生乳的發酵用菌方面,大多以保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus,LB)與嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus,ST)為主,二者混合雖然適合發酵傳統的牛乳制品,但在花生乳中發酵效果稍遜,并且大多花生乳與其他基料混合,比如牛奶、核桃、山藥等[11],并不是真正意義上的純酸花生乳,無法完全發揮花生蛋白的作用。因此,選擇更加適合發酵純花生乳的益生菌極為重要,本試驗引入應用廣泛的益生菌代表鼠李糖乳桿菌,多項研究表明,鼠李糖乳桿菌腸道粘附率高,能夠很好地在宿主腸道定植,鼠李糖乳桿菌還具有耐膽汁鹽、耐酸和耐抗生素生物學特性,能夠很好地耐受宿主消化道環境,幫助宿主調節腸道菌群平衡[12]。

本試驗篩選出適合花生蛋白發酵的益生菌,并且以花生仁為主要原料,經過磨漿、均質、滅菌、冷卻之后,使用鼠李糖乳桿菌與嗜熱鏈球菌發酵,整個過程不需要額外添加動物乳,以期能夠在短時間內得到蛋白含量豐富、營養價值高、風味良好、質地細膩的純酸花生乳。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

花生仁 市售;保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus,LB)、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus,LGG)、嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus,ST) 保存于黑龍江眾生生物工程有限公司實驗室;MRS肉湯培養基 生物試劑,北京奧博星生物技術有限責任公司;瓊脂 生物試劑,北京索萊寶科技有限公司;酚酞 指示劑,天津市科密歐化學試劑有限公司;氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀 分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司。

LD5-2B離心機 北京京立離心機有限公司;HWS26恒溫水浴鍋、LRH-250生化培養箱 上海一恒科學儀器有限公司;KDN-103F自動凱氏定氮儀 上海纖檢儀器有限公司;SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;SYQ-DSX-280B高壓滅菌鍋 上海中安醫療器械廠;NDJ-5S數顯粘度計 邦西儀器科技(上海)有限公司;FiveEasy Plus pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 酸花生乳工藝 花生仁→烘烤→去皮→浸泡→磨漿→過濾→調糖→均質→接種→發酵→冷藏→成品

挑選無霉變、無蟲蝕、顆粒飽滿的花生仁進行烘烤,溫度為120 ℃,時間為17 min,趁熱手工去皮[13],將去皮后的花生仁60 ℃浸泡4 h,充分浸潤能夠使花生蛋白更好地溶出,提高利用率[14-15],將花生仁與水按一定比例磨漿,使用四層紗布過濾,加入蔗糖,60 ℃均質5 min,85 ℃滅菌15 min后,冷卻至37 ℃接種,接種完成后,置于37 ℃恒溫培養箱發酵4 h,最后放入4 ℃冰箱冷藏[16]。

1.2.2 發酵前處理條件研究

1.2.2.1 花生仁與水比例的確定 固定磨漿溫度60 ℃、磨漿時間3 min、接種量(LB∶ST=1∶1)為3 mL/100 mL,研究當花生仁與水的比例分別為1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12時,對花生乳可溶性蛋白含量以及酸花生乳品質的影響,確定花生仁與水的最佳比例。

1.2.2.2 滅菌條件的確定 對花生乳進行滅菌處理,防止雜菌生長,本試驗研究不同時間(10、15、20 min)及溫度(85、90、95、110 ℃)對酸花生乳風味、色澤及組織狀態的影響。

1.2.3 菌種選擇

1.2.3.1 菌種活化 將各菌種以體積比3%的接種量加入MRS肉湯培養基中,37 ℃恒溫培養12 h[17-18]。

1.2.3.2 菌種選擇 以pH、酸度、粘度和乳酸菌活菌數為指標,接種量為6 mL/100 mL,分別研究保加利亞乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和嗜熱鏈球菌在花生乳中的發酵性能,確定適合花生乳發酵的菌種。

1.2.4 單因素實驗 以菌種比=1∶1、接種量5 mL/100 mL、發酵時間4.5 h及蔗糖添加量6 g/100 mL為基準,研究菌種比(1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1)、接種量(1、2、3、4、5、6 mL/100 mL)、發酵時間(3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5 h)和蔗糖添加量(0、2、4、6、8、10 g/100 mL)對酸花生乳pH、酸度、粘度和感官評分的影響。

1.2.5 正交試驗 通過單因素試驗確定正交試驗條件[19],以感官評分為指標,進行正交試驗,試驗設計見表1。

表1 正交試驗設計

1.3 指標檢測

1.3.1 酸度的測定 參照GB/T 5009. 239-2016《食品酸度的測定》進行酸度的測定[20]。

1.3.2 pH的測定 使用FiveEasy Plus pH計測定樣品的pH。

1.3.3 粘度的測定 使用NDJ-5S數顯粘度計測定樣品的粘度,發酵12 h,每2 h測定一次,每次2 min內測定完畢。

1.3.4 可溶性固形物的測定 使用阿貝折光計測定,根據折光率確定可溶性固形物含量。

1.3.5 感官評定 由10位(男女各半)經過培訓的食品專業人員組成評價小組,對發酵花生乳的色澤、滋味、氣味和組織狀態進行感官品評,每人的評分為各項指標之和,感官評價標準見表2,最終得分為10人的平均分。

表2 感官評價標準表

1.3.6 蛋白質的測定 參照GB 5009.5-2016《食品中蛋白質的測定》中凱氏定氮法,進行蛋白質的測定[21]。

1.3.7 可溶性蛋白含量測定 采用考馬斯亮藍法進行可溶性蛋白含量的測定。

1.3.8 乳酸活菌數的測定 參照 GB 4789.35-2016《食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》進行活菌數的測定[22]。

1.3.9 菌落總數、大腸桿菌和致病菌檢測 菌落總數的測定參照GB 4789.2-2016《食品微生物學檢驗菌落總數》;大腸菌群的測定參照GB 4789.3-2016《食品微生物學檢驗大腸菌群計數》;致病菌的測定參照GB 29921-2013《食品中致病菌限量》[23-25]。

1.4 數據處理

采用Origin 8.5作圖,使用SPSS 22.0數據分析軟件,進行單因素試驗和正交試驗方差顯著性分析,并采用LSD多重比較法和Student-Newman-Keuls多重比較法,進一步多重比較,采用正交設計助手Ⅱ V3.1對正交試驗進行設計和分析,所有試驗均進行三次平行試驗。

2 結果與分析

2.1 發酵前處理工藝優化

2.1.1 花生仁與水比例的確定 花生乳作為發酵基液直接影響著花生蛋白的利用率和成品的品質[26-28],因此本試驗以可溶性蛋白含量為指標,結合不同花生仁與水比例對酸花生乳成品感官的影響,確定花生仁與水的添加比例,結果見表3。

表3 花生仁與水比例的確定

由表3可知,當花生仁與水的比例處于1∶6～1∶12時,花生乳中可溶性蛋白含量少,且發酵效果不好;當花生仁與水比例為1∶2時,液體粘稠不易分離,且操作難度增大,不易發酵;當花生仁與水的比例為1∶4時,可溶性蛋白含量最大,且發酵效果最好,組織狀態好。因此確定花生仁與水的比例為1∶4。

2.1.2 滅菌條件的確定 本實驗研究不同溫度及不同時間的滅菌條件對花生乳的影響,結果見表4。

表4 滅菌條件的確定

由表4可知,85 ℃、10 min時,花生乳能夠有很好的組織狀態和色澤,但有生腥味,因此不建議使用;95～110 ℃溫度太高,使顏色普遍變深,色澤暗淡,有焦糊味。溫度較高,時間較長,不僅會對花生乳感官造成不良影響,還會使蛋白質變性,穩定性降低。綜合比較,85 ℃、15 min時花生乳的各項感官都比較好,因此本實驗采取的滅菌條件為85 ℃、滅菌15 min。

2.1.3 菌種篩選

2.1.3.1 產酸能力測定 將活化后的菌種加入花生乳中,37 ℃恒溫發酵24 h,每4 h測定一次酸度和pH,結果見圖1、圖2。

圖1 不同乳酸菌發酵花生乳pH變化

圖2 不同乳酸菌發酵花生乳酸度變化

由圖1、圖2能夠看出,不同菌株發酵花生乳產酸能力不同,pH下降趨勢與酸度上升的趨勢基本相同,由這兩個產酸指標可知,三株菌產酸能力的排序為鼠李糖乳桿菌>保加利亞乳桿菌>嗜熱鏈球菌,鼠李糖乳桿菌發酵花生乳比保加利亞乳桿菌產酸能力更強,這可能是因為花生乳中的營養物質更適合鼠李糖乳桿菌生長。通過《伯杰細菌鑒定手冊》可知,保加利亞乳桿菌在牛奶中能夠產生相同數量的乳酸[29],發酵效果比較好,但是并不證明在植物蛋白中也能夠獲得同樣的效果,張洪禮等研究發現傳統發酵劑在植物蛋白中的效果,不如新生益生菌[30],與本實驗研究結果一致。

2.1.3.2 產粘能力測定 不同乳酸菌發酵花生乳的產粘能力,結果見圖3。

圖3 不同乳酸菌發酵花生乳粘度值變化

由圖3可知,不同菌株在發酵花生乳產粘能力不同,其中鼠李糖乳桿菌和嗜熱鏈球菌能夠在較短的時間內得到很高的粘度,鼠李糖乳桿菌的粘度一直優于保加利亞乳桿菌,良好的粘度值能夠提高產品的穩定性和口感。

2.1.3.3 乳酸菌數測定 將活化后的菌種加入花生乳中,比較嗜熱鏈球菌、鼠李糖乳桿菌和保加利亞乳桿菌發酵核桃乳的乳酸菌數,結果見表5。

表5 不同乳酸菌發酵花生乳活菌數變化

由表5可知,鼠李糖乳桿菌和嗜熱鏈球菌發酵花生乳,繁殖能力優于保加利亞乳桿菌,乳酸菌活菌數較高。

經過以上研究,鼠李糖乳桿菌發酵花生乳產酸能力、產粘能力和繁殖能力均優于保加利亞乳桿菌,鼠李糖乳桿菌發酵后活菌數能夠在短時間內達到國家標準1×106cfu/mL[31],單菌發酵分解蛋白能力弱,桿菌與球菌搭配能夠減少后酸化現象[32],因此本實驗選擇鼠李糖乳桿菌和嗜熱鏈球菌協同發酵花生乳。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 菌種比例的確定 由圖4可知,不同菌種比例發酵花生乳產生的效果不同,隨著嗜熱鏈球菌所占比例的增加,產酸能力下降,粘度上升,酸度達到GB 19302-2010《食品國家標準 發酵乳》要求的70°T。

圖4 不同菌種比酸花生乳的pH、酸度及粘度

由圖5可知,嗜熱鏈球菌比例增加感官評分較高,顏色呈現白色、花生香味濃郁、口感適宜、組織狀態好,這可能是由于在4.5 h時,鼠李糖乳桿菌產酸能力強,嗜熱鏈球菌產粘能力強,隨著嗜熱鏈球菌比例的增加,口感和穩定性都比較好。因此,確定ST∶LGG=1∶1、2∶1和3∶1,為正交試驗菌種比的三個水平。

圖5 不同菌種比酸花生乳的感官評分

2.2.2 接種量的確定 不同接種量發酵花生乳產生的效果不同,由圖6可知,當接種量處于1～2 mL/100 mL時,酸度未能達到70°T,粘度低;接種量為6 mL/100 mL時,偏酸,對口感和滋氣味均有不良的影響;當接種量為4 mL/100 mL時,產酸能力適宜,粘度最大。

圖6 不同接種量酸花生乳的pH、酸度及粘度

由圖7可知,當接種量1～2 mL/100 mL時,感官評分低,發酵不完全,組織松散,發酵風味不足;當接種量為6 mL/100 mL時,色澤暗淡、乳清易析出且分層明顯,有異味;當接種量為4 mL/100 mL時,感官評分最高。因此,確定接種量3、4和5 mL/100 mL,為正交試驗的三個水平。

圖7 不同接種量酸花生乳的感官評分

2.2.3 發酵時間的確定 不同發酵時間對發酵花生乳產生的效果不同,由圖8可知,發酵時間處于6.5～7.5 h時,酸花生乳過酸,粘度小,影響口感;發酵時間為4.5 h時,酸度適宜,粘度最高。

圖8 不同發酵時間酸花生乳的pH、酸度及粘度

由圖9可知,當發酵時間處于6.5～7.5 h時,乳清易析出,酸味明顯;當發酵時間為4.5 h時,此時感官評分最高。因此,確定發酵時間3.5、4.5和5.5 h,為正交試驗的三個水平。

圖9 不同發酵時間酸花生乳的感官評分

2.2.4 蔗糖添加量的確定 不同蔗糖添加量對酸花生乳產生的效果不同,由圖10可知,當蔗糖添加量處于0～4 g/100 mL時,產酸能力不強,粘度低;當蔗糖添加量處于8～10 g/100 mL時,酸度過大,粘度低;當蔗糖添加量為6 g/100 mL,酸度適宜,粘度最高。

圖10 不同蔗糖添加量酸花生乳的pH、酸度及粘度

由圖11可知,當蔗糖添加量為0時,甜味不明顯,滋氣味不足,影響口感;當蔗糖添加量處于8～10 g/100 mL時,味道太濃烈,且易析出乳清,組織狀態不佳;當蔗糖添加量為2、4和6 g/mL時,感官評分較好。因此,確定蔗糖添加量2、4和6 g/mL,為正交試驗的三個水平。

圖11 不同蔗糖添加量酸花生乳的感官評分

表6 正交試驗結果

2.3 正交試驗結果

2.3.1 正交試驗感官評價結果及分析 以感官評分為標準,進行因素水平設計,表6為正交試驗結果,通過直觀分析和方差分析(見表7)可知,該正交試驗模型顯著,各因素對感官評分影響重要程度排序為:B>D>A>C,即接種量>蔗糖添加量>菌種比>發酵時間,最佳組合為A2B3C2D3,即ST∶LGG為2∶1,接種量為5 mL/100 mL,發酵時間為4.5 h,蔗糖添加量為6 g/100 mL。

表7 方差分析結果

表8為正交試驗理化指標檢測結果,試驗號為3、4、6、7、8、9的樣品,粘度較高,酸度在71～92 °T之間,酸甜適宜,與感官評分結果接近。

表8 正交試驗理化指標測定結果

2.3.2 驗證性試驗 根據正交試驗得到的最佳組合A2B3C2D3進行驗證性試驗,結果如下:pH為4.36,酸度為76°T,粘度為1532 mPa·s,感官得分為90,該工藝條件真實有效,并在該條件下進行品質指標測定,測定結果見表9。

由表9可知,在最佳條件下制備的酸花生乳,色澤呈現均勻一致的乳白色、花生香氣與發酵風味協調一致、花生香味濃郁、口感適中及組織狀態良好,蛋白質含量與可溶性固形物含量均達標,乳酸菌活菌數高,有害菌及致病菌未檢出。

表9 酸花生乳各項指標測定結果

3 結論

本研究以鼠李糖乳桿菌和嗜熱鏈球菌為主要研究對象,二者發酵花生乳能夠獲得很好的效果,產酸、產粘能力強,乳酸菌數高,通過工藝研究確定最佳發酵條件為ST∶LGG為2∶1,接種量為5 mL/100 mL,發酵時間為4.5 h,蔗糖添加量為6 g/100 mL,此時,pH為4.36,酸度為76 °T,粘度為1532 mPa·s,感官得分為90,蛋白含量為4.78 g/100 g,可溶性固形物為9.5%。本研究不僅酸度達到要求,還能夠在短時間內得到營養風味俱佳的酸花生乳,并優化了酸花生乳品質指標的檢測,如蛋白質、可溶性固形物和粘度的檢測,完善了乳酸菌發酵花生蛋白的研究體系。