超聲輔助提取福橘果皮類胡蘿卜素的工藝優化

倪玉潔,馬文霞,謝 倩,葉清華,何淑敏,張靜芳,董 浩,陳清西

(福建農林大學園藝學院,福建福州 350002)

福橘(CitrusreticulataBlanco.cv Fuju)別名紅橘、漳州橘,為蕓香科柑橘屬植物。福橘原產于福州,在福建地區已經種植了1000多年,并在1985年被正式確定為福州市市果[1-2]。福橘屬寬皮柑橘,果皮寬松易剝,顏色艷麗,呈橙紅色或鮮橙紅色[3]。大部分果實用于鮮食或貯藏后食用,果皮則被丟棄。實際上,福橘果皮占全果總重量的20%左右,目前,還未見有對福橘果皮深加工和利用的研究和報道。加工產品少,副產品利用率不高,是福橘產業發展的一大缺陷[4]。所以,增強果皮的綜合利用,提高福橘產品的附加價值,增升福橘產業的包容性,實現加工轉化增值,對福橘資源的整合產業的發展至關重要。

柑橘果皮積累了大量的類胡蘿卜素,作為一種天然色素,可用于制成食品營養強化劑和著色劑[5-7]。目前,類胡蘿卜素提取方法主要有溶劑提取、酶輔助提取、微波輔助提取、超聲輔助提取、超臨界流體萃取等[8]。超聲輔助提取利用超聲過程中產生的空化作用和熱效應,使植物細胞壁破裂,加快目標物質溶出[9-10]。類胡蘿卜素是脂溶性化合物,組成成分復雜,一般選用極性大小不同的混合有機溶劑進行提取,其中丙酮、己烷和乙醇的混合液最常用來同時提取極性和非極性類胡蘿卜素[11-12]。Barba等[13]在對新鮮蔬菜水果類胡蘿卜素進行測定之后,建議使用正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1對類胡蘿卜素進行提取;Lee等[14]將正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1作為提取劑對橙汁中的類胡蘿卜素進行提取并進行定性和定量分析。目前,超聲波輔助有機溶劑提取法在提取有機酸[15]、多糖[16]、總黃酮[17]、酚[18-19]等方面已被廣泛使用。

因此,本試驗以正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1(含0.1% 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚,BHT)為提取劑,考察不同條件對類胡蘿卜素提取的影響,以單因素試驗結果為基礎,結合響應面試驗結果,優化超聲法提取類胡蘿卜素的最佳條件,以期為福橘果皮的深度開發與資源整合利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

福橘果實 2019年1月4日采于福建省福州市連江縣曉澳鎮道澳村英貴家庭農場,采后洗凈,取果皮有色層凍于液氮,存于-80 ℃冰箱;丙酮、無水乙醇、正己烷、BHT 均購于上海滬試試驗室器材股份有限公司,為分析純。

KQ-300DE數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;Allegra 64R臺式高速冷凍離心機 美國BECKMAN公司);UV WinLab V6紫外可見分光光度計 美國PerkinElmer公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 類胡蘿卜素的提取 精確稱取研磨后的鮮樣粉末0.0800 g,置于10 mL離心管中,按一定液料比加入正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1(含0.1% BHT)混合液,混勻后在一定的超聲時間、溫度和超聲功率下進行提取。冷卻后于室溫12000 r/min下離心10 min,取上清液。按照上述步驟重復提取,合并上清液,取出1 mL以正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1(含0.1% BHT)混合液進行定容,此為待測液。類胡蘿卜素在光照條件下易分解或異構化,試驗全程在避光條件下進行。

1.2.2 單因素實驗 以正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1(含0.1%BHT)溶液為提取劑,參照郭琳琳[20]的方法,設定單因素初始條件液料比、超聲時間、超聲溫度、超聲功率以及提取次數分別為60∶1 (mL/g)、20 min、30 ℃、240 W和1次。

考察液料比對提取量的影響時,按照20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1 mL/g的液料比加入提取劑,其余條件同1.2.1。

考察超聲時間對提取量的影響時,以液料比60∶1 (mL/g)加入提取劑,超聲時間設置為0、5、10、20、30、40 min,其余條件同1.2.1。

考察超聲溫度對提取量的影響時,固定液料比和超聲時間分別為60∶1 (mL/g)和10 min。將超聲溫度設置為30、35、40、45、50、55 ℃,其余條件同1.2.1。

考察超聲功率對提取量的影響時,按液料比60∶1 (mL/g)加入提取劑、設定超聲時間和溫度分別為10 min和50 ℃,設置超聲功率為150、180、210、240、270 W,其余條件同1.2.1。

考察提取提取次數對提取量的影響時,按液料比、超聲時間、溫度和功率分別為60∶1 (mL/g)、10 min、50 ℃和240 W進行試驗,分別提取1、2、3、4、5次。

1.2.3 響應面設計試驗 以單因素試驗結果為根據,同時結合實際操作,選擇對類胡蘿卜素提取量大的影響因素和水平進行3因素3水平的響應面試驗。固定超聲時間和提取次數分別為10 min和2次。以超聲功率(A)、超聲溫度(B)和液料比(C)為自變量,以果皮類胡蘿卜素提取量為響應值,使用Design Expert 8.0軟件,根據Box-Behnken試驗設計原理設計試驗,試驗設計因素水平見表1。

表1 各因素水平編碼

1.2.4 類胡蘿卜素的測定 參照馬少君等[21]的方法選用450 nm為檢測波長,以提取劑為空白對照。根據Beer-Lambert定律對類胡蘿卜素提取量進行計算[22-23],公式如下:

1.3 數據分析

以Excel 2003整理數據,以SPSS 19.0進行顯著性分析,用Origin 17.0和Design Expert 8.0進行作圖。

2 結果與分析

2.1 類胡蘿卜素提取的單因素試驗結果

2.1.1 液料比對類胡蘿卜素提取的影響 由圖1可知,類胡蘿卜素提取量隨溶劑用量的增多先上升后下降,隨后穩定下來,在液料比60∶1 (mL/g)時達到最高值。這可能是由于溶劑增多,加上超聲作用,樣品和提取劑得到了充分接觸,使得類胡蘿卜素充分溶出,但提取劑過量,將削弱超聲對細胞壁的破碎作用,影響目標物質的溶出,降低提取效率[24-25]。

圖1 液料比對類胡蘿卜素提取的影響

2.1.2 超聲時間對類胡蘿卜素提取的影響 由圖2可知,隨著超聲時間的延長,類胡蘿卜素提取量在超聲10 min時達到最大值,此后緩慢下降,當超聲時間>20 min時,提取量顯著下降(P<0.05)。類胡蘿卜素易受溫度、氧氣的影響發生降解,可能是由于超聲作用一方面加快了類胡蘿卜素的溶出速率,一方面提取時間過長,類胡蘿卜素受氧化作用而降解[26]。

圖2 超聲時間對類胡蘿卜素提取的影響

2.1.3 超聲溫度對類胡蘿卜素提取的影響 由圖3可知,隨著超聲溫度的升高,類胡蘿卜素提取量不斷升高,在50 ℃時達到最高值0.528 mg/g,繼續升高溫度提取量顯著下降(P<0.05)。這可能是由于溫度過高,受高溫作用影響,類胡蘿卜素發生了降解[27]。

圖3 超聲溫度對類胡蘿卜素提取的影響

2.1.4 超聲功率對類胡蘿卜素提取的影響 由圖4可知,隨著超聲功率的增加,類胡蘿卜素提取量持續升高,當超聲功率達到240 W時,提取量達到最高值隨后又顯著下降(P<0.05)。這可能是由于超聲作用加速了細胞壁的破碎,從而增強了類胡蘿卜素的溶出,當超聲作用增大到空間效應飽和時,繼續加強超聲功率會加強超聲波的散射和衰弱,不利于類胡蘿卜素的提取[28]。

圖4 超聲波功率對類胡蘿卜素提取的影響

2.1.5 提取次數對類胡蘿卜素提取的影響 由圖5可知,提取次數越多類胡蘿卜素的提取效果越好,但在第2次提取之后,提取量趨于穩定,且之后提取量之間沒有顯著性差異(P>0.05)。說明經過兩次提取,可基本將樣品中的類胡蘿卜素提取出來。再增加提取次數對類胡蘿卜素的提取量影響不大。因此,為簡化試驗步驟,將提取次數設置為2次。類胡蘿卜素長期暴露在空氣中,易被氧化分解。因此,為保證重復實驗的穩定性和一致性,利用響應面法優化提取工藝時將提取次數固定為2次,不作為優化因素。

圖5 提取次數對類胡蘿卜素提取的影響

2.2 類胡蘿卜素提取條件的優化

2.2.1 響應面試驗設計及結果 在單因素實驗基礎上,運用Box-Behnken中心組合原理設計試驗,試驗設計與結果見表2。通過Design Expert 8.0分析試驗結果,得到回歸方程:Y=0.75-0.020A+0.019B-0.016C+0.017AB+0.0036AC+0.0033BC-0.083A2-0.092B2-0.17C2。

表2 響應面試驗設計及結果

表3 響應面二次回歸模型方差分析

2.2.2 響應面分析 在回歸模型中,將其中一個因素固定在0水平,代入方程考察另外兩個因素之間的相互作用。根據響應面試驗結果,運用Design Expert 8.0軟件做出響應面圖和等高線圖(圖6)。圖6中可以看出,三個響應面圖坡面均較為平緩,等高線圖均呈現橢圓形,表明類胡蘿卜素提取量受兩兩因素交互作用影響小。但任意兩個因素的交互作用都存在一個最高點,說明通過改變液料比、提取溫度和功率三個因素,可以使類胡蘿卜素的提取效果達到最佳。

圖6 各因素交互作用響應面和等高線圖

2.2.3 最優工藝及驗證試驗 通過Design Expert 8.0軟件對福橘果皮類胡蘿卜素提取回歸方程進行優化分析,預測在液料比59.04∶1 (mL/g),超聲溫度50.47 ℃,超聲功率236.65 W條件下,類胡蘿卜素的提取量理論值為0.756 mg/g。為方便操作,將最佳條件調整為液料比、超聲功率和超聲溫度分別為59∶1 (mL/g),240 W和50 ℃。在該條件下重復2次,得到類胡蘿卜素提取量的平均值達到(0.747±0.027) mg/g,與預測值基本一致。因此,該模型具有一定的可信度,通過響應面試驗可以優化超聲法對福橘果皮類胡蘿卜素提取工藝條件。

3 討論與結論

柑橘外果皮包括有色層和白皮層兩部分,其主要呈色物質—類胡蘿卜素主要儲存在有色層之中[29]。曾東慧等[30]以溫州蜜柑為材料,測得其果皮類胡蘿卜素含量達到0.351 mg/g;邵金華等[31]測得柚皮中含有類胡蘿卜素0.306 mg/g。而本試驗結果顯示福橘果皮有色層類胡蘿卜素含量高達到(0.747±0.027) mg/g,足見福橘果皮中也積累了豐富的類胡蘿卜素。

在應用超聲輔助提取類胡蘿卜素的過程中,提取量會隨著提取因素的變化而變化,且試驗對象不同,其提取工藝也有所差異。如提取劑的種類和極性影響目標物質的溶出速率,超聲溫度對溶質的溶解效果產生直接作用,超聲功率對溶劑穿透力和溶質溶出速度有重要影響,而液料比、超聲時間和提取次數通過影響物料和溶劑的接觸來影響提取量[21]。在運用這一方法提取類胡蘿卜素方面,米雪等[32]認為按液料比40∶1 (mL/g)加入無水乙醇,在超聲功率和溫度分別為100 W和60 ℃條件下提取30 min時,對柿皮中類胡蘿卜素的提取效果最好;李憲鈔等[33]以丙酮為提取劑,得到玉米苞葉中的類胡蘿卜素最佳提取工藝:液料比、超聲溫度和時間分別為17∶1 (mL/g)、33 ℃、48 min;劉長付等[34]以西紅柿為試材,得到最優的類胡蘿卜素提取工藝是以液料比30∶1 (mL/g)加入丙酮∶石油醚=3∶2混合液,在超聲功率和溫度為450 W、24 ℃條件下提取2次,每次25 min。因此,面對不同的提取材料,需要選擇相應的提取工藝才能達到最佳的提取效果。

目前,在柑橘類胡蘿卜素的提取上,多采用有機溶劑提取、酶輔助提取、微波輔助提取和超聲輔助提取。胡建中[35]采用有溶劑提取提取橘皮中的類胡蘿卜素,得出在溫度40 ℃,提取時間2 h,固液比1∶20 mL/g條件下提取2次得到的提取效果最佳;廖春燕等[36]用微波法提取橘皮中的類胡蘿卜素,最后得出以石油醚為提取劑浸提30 min后,在固液比1∶20 mL/g,微波功率560 W條件下提取2次,每次60 s的效果最好;Cinar[37]利用纖維素酶和果膠酶組合法提取橙皮中的類胡蘿卜素,得到在纖維素酶和果膠酶分別為0.1 g/100 g和5 mL/100 g組合條件下,效果最好。本試驗以正己烷∶丙酮∶乙醇=2∶1∶1(含0.1%BHT)為提取劑,采用超聲輔助提取福橘果皮中的總類胡蘿卜素。以單因素實驗結果為依托選擇響應面試驗因素和水平,以Box-Behnken試驗設計原理設計試驗,進行響應面分析。最后確定最佳提取工藝為液料比59∶1 (mL/g)、超聲功率240 W和溫度50 ℃,提取時間和次數分別為10 min和2次。與前人研究中的有機溶劑提取、酶輔助提取和微波輔助提取法相比,該方法耗時少成本低,操作簡便。運用該方法得到福橘果皮中類胡蘿卜素的提取量最大可達到(0.747±0.027) mg/g,與預測值基本一致。說明福橘果皮中積累了豐富的類胡蘿卜素,利用超聲輔助提取福橘果皮類胡蘿卜素能達到良好效果,也為福橘果皮的綜合利用和深入開發提供了指導。