響應面優化可溶態和膜結合態馬鈴薯多酚氧化酶提取工藝

李 俊,章潔瓊,劉 輝,劉永翔,3,王 輝,盧 揚,*

(1.貴州省農業科學院食品加工研究所,貴州貴陽 550006;2.貴州省農作物技術推廣總站,貴州貴陽 550001;3.貴州省生物技術重點實驗室,貴州貴陽 550006)

作為繼小麥、水稻、玉米之后的世界第四大糧食作物,馬鈴薯具有產量高、適應性強、營養全面及綜合加工用途廣泛等優點[1]。馬鈴薯去皮以后易發生褐變,導致產品品質、色澤和風味下降,這是馬鈴薯加工面臨的一大難題[2]。同時,有研究表明,全世界每年因褐變造成的果蔬損失占總損失的一半以上,且以多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase,PPO)引起的酶促褐變為主,有關酶促褐變的研究也一直是果蔬采后加工研究的熱點問題[3]。酶促褐變是指果蔬組織中的酚類物質在PPO等的作用下氧化成醌,醌再經聚合形成褐色物質的過程[4]。

PPO在植物細胞內有兩種存在形式:可溶態(sPPO)存在于細胞質或質體中,膜結合形態(mPPO)存在于質體、線粒體等細胞器膜上[5]。研究表明,PPO在大多數水果中主要以膜結合態存在,如蘋果中sPPO只占8%～15%[6]。但是有研究發現,sPPO在褐變過程中起主要作用,通常情況下,細胞內mPPO活性較低,在外界環境或人為處理下,可激發其活性,如利用非熱加工技術,在某一范圍壓力作用下,導致細胞膜被損壞或膜的通透性發生改變,使細胞內部的PPO泄露出來,或者使被束縛在細胞碎片上的酶釋放出來,使PPO酶活提高[7],表明mPPO與sPPO在酶促褐變機理研究中的同等重要性。由于mPPO的存在,使PPO結構、性質、褐變機理的問題研究起來十分復雜。

現階段國內外關于sPPO的提取分離報道較多,而關于mPPO的研究報道較少。PPO的提取方法主要有丙酮提取、丙酮粉提取、超聲波輔助浸提、超高壓提取、緩沖溶液浸提等[8],這些方法提取出的主要是sPPO,而mPPO與植物細胞結合更加緊密,所以提取方法不同于sPPO。李曉麗等[9]對比了丙酮提取法、超聲波輔助浸提法和緩沖溶液浸提法對無核白葡萄PPO的提取效果,發現緩沖溶液提取法的效果最佳。劉芳[10]對富士蘋果sPPO和mPPO特性進行對比,采用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶提取sPPO,采用Tris-HCl緩沖溶液提取mPPO,對比發現mPPO活性是sPPO的34.12倍。緩沖液浸提法是一種液-固萃取方法,因此緩沖液對提取效果影響很大[11]。常用的緩沖溶液以磷酸鹽為基底,采用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)結合吐溫-80(Tween-80)、聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、抗壞血酸(VC)中的一種或幾種配制而成[12-13]。由于mPPO和sPPO性質的差異,提取方法會直接影響到提取效果,且將馬鈴薯sPPO和mPPO區分提取的研究報道極少。

因此,本實驗通過緩沖溶液浸提法對sPPO進行提取,通過超聲波輔助緩沖溶液提取法對mPPO進行提取,并通過響應面法對兩種PPO的提取工藝進行優化,為有效解決馬鈴薯加工過程中的酶促褐變提供理論基礎和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大西洋馬鈴薯(SolanumtuberosumL.) 由貴州省馬鈴薯研究所提供;牛血清蛋白(BSA)標準品(≥98%) 北京索萊寶科技有限公司;磷酸氫二鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、鹽酸、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)、考馬斯亮蘭G-250、鄰苯二酚等均為分析純 國藥集團化學試劑有限公司。

UV-2102C型紫外可見分光光度計 尤尼科上海儀器有限公司;G-040s型超聲波清洗機 深圳市歌能清洗設備有限公司;CR21G III型高速冷凍離心機 日本日立公司;HHS型數顯恒溫水浴鍋 上海博迅實業有限公司醫療設備廠。

1.2 可溶態多酚氧化酶(sPPO)提取實驗

1.2.1 提取工藝 取新鮮馬鈴薯20 g,依次加入3 g PVP、預冷的檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L),冰浴研磨均勻,置于4 ℃冰箱中浸提。浸提液于4 ℃、12000 r/min離心30 min后,取上清液,得sPPO粗酶液。

1.2.2 sPPO提取的單因素實驗 基于sPPO提取方法,設定提取的單因素實驗條件為:固定浸提時間為6 h,緩沖液pH為7.0,料液比分別(質量體積比,w/v)為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6;固定料液比為1∶4,緩沖液pH為7.0,浸提時間分別為2、4、6、8、10、12、14、16、18 h;固定料液比為1∶4,浸提時間為6 h,緩沖液pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。考察料液比、浸提時間、緩沖液pH對sPPO提取效果的影響。

1.2.3 sPPO提取的響應面優化試驗 在單因素實驗的基礎上,對sPPO比活力有影響的三個因素料液比、浸提時間、緩沖液pH進行響應面優化試驗,優化sPPO的提取工藝。

表1 Box-Behnken中心組合設計因素水平

1.3 膜結合態多酚氧化酶(mPPO)提取實驗

1.3.1 提取工藝 在sPPO提取后的殘渣中加入Tris-HCl緩沖液和0.25% Triton X-100,勻漿后在4 ℃冰箱中靜置4 h。在功率80 W、溫度4 ℃條件下超聲提取,然后4 ℃下11000 r/min離心15 min。在4 ℃冰箱中靜置30 min,然后35 ℃水浴保溫15 min。25 ℃下11000 r/min離心15 min,取上清液,得mPPO粗酶液。

1.3.2 mPPO提取的單因素實驗 基于mPPO提取方法,設定提取的單因素實驗條件為:固定超聲提取時間為5 h,緩沖液pH為6.0,料液比(質量體積比,w/v)分別為1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6;固定料液比為1∶4,緩沖液pH為6.0,超聲提取時間分別為1、2、3、4、5、6、7、8 h,超聲提取過程中實時監測水浴溫度,通過不斷添加冰水的方式控制水浴溫度在4±0.5 ℃;固定料液比為1∶4,超聲提取時間為5 h,Tris-HCl緩沖液pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。考察料液比、超聲時間、緩沖液pH對mPPO提取的影響。

1.3.3 mPPO提取的響應面優化試驗 在單因素實驗的基礎上,對mPPO比活力有影響的三個因素料液比、超聲時間、緩沖液pH進行響應面優化試驗,優化mPPO的提取工藝。

表2 Box-Behnken中心組合設計因素水平

1.4 多酚氧化酶活力與比活力測定

取0.05 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(pH6.5)2.5 mL于1 cm比色皿中,加入0.1 mol/L鄰苯二酚溶液0.2 mL,PPO粗酶液0.3 mL,混勻后在416 nm處比色,酶液加入后開始記時,每40 s記錄1次OD隨時間的變化值,以最初直線段的斜率(ΔOD/t)計算酶活力。一個酶活力單位定義為:在測定條件下,每分鐘催化1 μmol/L鄰苯二酚為醌所需要的酶量定義為1個酶活力單位。產物的摩爾吸光系數按ε=3700 L·mol-1·cm-1計算[10,14]。按公式(1)計算粗酶液PPO活力:

式(1)

其中:M代表酶活力(U/mL);N代表酶液稀釋倍數;V總代表PPO酶活測定反應體系的終體積(mL);V酶代表反應添加的酶液體積(mL);ΔOD416代表t時間內反應液在416 nm處吸光度的增加值;ε代表416 nm處鄰苯二酚轉化為鄰苯二醌的摩爾吸光系數(L/mol·cm);t代表反應時間(min);L代表比色皿的直徑(cm)。

提取出的sPPO和mPPO粗酶液中酶蛋白濃度不同,酶活性差別受樣品酶蛋白濃度影響較大,所以采用酶比活力表示樣品間酶活性差別。酶比活力為每毫克蛋白質所具有的酶活力數,按公式(2)計算粗酶液PPO比活力:

式(2)

其中:H代表酶比活力(U/mg);M代表酶活力(U/mL);C代表酶蛋白濃度(mg/mL)。

1.5 PPO粗酶液中蛋白濃度測定

參照Bradford[15]的方法測定粗酶液蛋白濃度。取不同濃度牛血清蛋白標準溶液2 mL,加入10 mL考馬斯亮藍G-250溶液,搖勻后室溫放置5 min,以空白溶液作為對照,用1 cm比色皿在595 nm處測定吸光值。以酶蛋白溶液濃度為橫坐標X,吸光值為縱坐標Y,繪制標準曲線為:Y=1.8385X+0.1611,R2=0.9990。樣品測定按照上述步驟操作,平行測定3次,取平均值。

1.6 數據處理

采用Origin(Version 8.6)作圖,Design-Expert(Version 8.0)進行響應面分析,SPSS(Version 17.0)進行統計學分析,P<0.05認為有統計學顯著性差異,P<0.01認為有統計學極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 sPPO提取的單因素實驗結果

由圖1A可知,隨著料液比比例增加,sPPO的比活力顯著升高(P<0.05),當料液比達到1∶3時,sPPO比活力達到最大值,繼續增加料液比,會使sPPO比活力緩慢降低。原因可能是料液比過低,使馬鈴薯中sPPO無法充分溶出,提取不充分,導致sPPO比活力會隨著料液比增加而升高,但當料液比比例過高后,sPPO酶溶解量不再增加,提取液被稀釋,會對比活力造成一定的影響[16]。由圖1B可知,浸提時間會顯著影響sPPO的比活力(P<0.05),當浸提時間達到12 h,sPPO的比活力達到最大值,之后隨著浸提時間增加基本保持恒定。不同于李曉麗等[9]的報道,浸提時間的延長,酶蛋白在溶液中構象不穩定會導致無核白葡萄中PPO活力降低,馬鈴薯PPO性質相對穩定。由圖1C可知,緩沖液pH在7.0時sPPO比活力達到最大值,過高或過低的緩沖液pH均使sPPO比活力顯著降低(P<0.05)。可能原因如下:sPPO的輔基是銅離子,銅離子在酸性條件下會被解離出來,從而使酶失去活性,而銅離子在堿性條件下會轉化為氫氧化銅沉淀,脫離酶蛋白,使酶失去活性;反應體系的pH影響底物,從而減弱催化反應效率[17]。

圖1 料液比(A)、浸提時間(B)、緩沖液pH(C)對sPPO比活力的影響

2.2 sPPO提取的響應面優化試驗結果

2.2.1 Box-Behnken設計與結果 根據單因素實驗結果,以Box-Behnken中心組合設計原則,選取料液比(A)、浸提時間(B)、緩沖液pH(C)為自變量,以sPPO比活力為響應值,設計三因素三水平響應面試驗對sPPO提取工藝進行優化,實驗方案及實驗結果如表3所示。

表3 響應面優化實驗方案及實驗結果

2.2.2 回歸方程與顯著性分析 將表3的實驗數據,利用Design-Expert 8.0軟件進行二次多項式逐步回歸擬合,得回歸模型方程為:

Y=130.60+2.40A+3.06B+1.41C-1.68AB+1.68AC+0.60BC-3.03A2-5.60B2-11.30C2

模型的可靠性可以從方差分析及相關系數來考察,結果見表4。

表4 回歸模型方差分析

由表4可知,模型F=288.74,所得sPPO提取條件的回歸方程極顯著(P<0.0001);F失擬=4.83,失擬項不顯著(P>0.05),從而該模型可以對sPPO提取工藝條件進行準確的預測和分析。R2=99.73%,說明sPPO比活力的變化有99.73%來源于料液比、浸提時間和緩沖液pH的影響。方差分析結果表明:一次項和二次項都有顯著性因素,其中A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2對響應值均有極顯著性影響(P<0.01),三個因素對sPPO提取的影響大小依次為:浸提時間(B)>料液比(A)>緩沖液pH(C)。

2.2.3 響應面分析 圖2表示料液比分別與浸提時間和緩沖液pH的交互作用對sPPO比活力的影響。由圖2可知,固定浸提時間,隨著料液比升高sPPO比活力均呈先升高后降低趨勢;固定料液比,sPPO比活力均隨緩沖液pH的升高呈現先升高后降低趨勢,與單因素實驗結果變化趨勢一致。由方差分析可知,不同因素交互作用對sPPO比活力影響顯著,與其相對應的等高線形狀為橢圓形,表明料液比和浸提時間、料液比和緩沖溶液pH的交互作用對響應值的影響顯著。

圖2 料液比、浸提時間和緩沖液pH的交互作用

根據回歸模擬方程,得到最優sPPO提取工藝條件為:料液比為1∶3.16,浸提時間12.31 h,緩沖液pH為7.07。在此條件下sPPO比活力的預測值為131.3 U/mg,考慮到實際操作的可行性,將最優提取工藝修正為:料液比為1∶3.2,浸提時間12 h,緩沖液pH為7.1,在該條件下測定sPPO比活力平均值達(130.5±2.4) U/mg,與預測值基本一致。因此該模型可以很好的反映最優的sPPO提取工藝條件。

2.3 mPPO提取的單因素實驗結果

由圖3A可知,隨著料液比比例增加,mPPO的比活力顯著升高(P<0.05),當料液比達到1∶5時,mPPO比活力達到最大值,隨后mPPO比活力緩慢降低。由圖3B可知,當浸提時間達到6 h,mPPO的比活力達到最大值,之后隨著浸提時間增加基本保持恒定。由圖3C可知,緩沖液pH在7.0時mPPO比活力達到最大值,過高或過低的緩沖液pH均使mPPO比活力顯著降低(P<0.05)。料液比、超聲時間和緩沖液pH對mPPO比活力的影響趨勢與sPPO相同,但是mPPO比活力顯著高于sPPO比活力,mPPO很容易被激活,且mPPO被激活后性質比sPPO活躍,是導致馬鈴薯加工過程中褐變的主要影響因素[18]。

圖3 料液比(A)、超聲時間(B)、緩沖液pH(C)對mPPO比活力的影響

2.4 mPPO提取的響應面優化實驗結果

2.4.1 Box-Behnken設計與結果 根據單因素實驗結果,以Box-Behnken中心組合設計原則,選取料液比(A)、超聲時間(B)、緩沖液pH(C)為自變量,以mPPO比活力為響應值,設計三因素三水平響應面試驗對mPPO提取工藝進行優化,實驗方案及實驗結果如表5所示。

表5 響應面優化試驗方案及實驗結果 Table 5 Experimental scheme and results of response surface optimization

2.4.2 回歸方程與顯著性分析 將表5的實驗數據,利用Design-Expert 8.0軟件進行二次多項式逐步回歸擬合,得回歸模型方程為:

Y=684.56+7.71A+12.64B+2.90C+1.90AB-5.58AC-13.18BC-11.68A2-15.53B2-20.50C2

模型的可靠性可以從方差分析及相關系數來考察,結果見表6。

表6 回歸模型方差分析

由表6可知,模型F=131.94,所得mPPO提取條件的回歸方程極顯著(P<0.0001);F失擬=2.10,失擬項不顯著(P>0.05),從而該模型可以對mPPO提取工藝條件進行準確的預測和分析。R2=99.41%,說明mPPO比活力的變化有99.41%來源于料液比、超聲時間和緩沖液pH的影響。方差分析結果表明:一次項和二次項都有顯著性因素,其中A、B、C、AC、BC、A2、B2、C2均顯著,各因素對mPPO比活力具有交互影響的非線性關系,三個因素對mPPO提取的影響大小依次為:超聲時間(B)>料液比(A)>緩沖液pH(C)。

2.4.3 響應面分析 圖4表示緩沖液pH分別與超聲時間和料液比對mPPO比活力的交互影響。由圖4可知,無論緩沖液pH處于何種水平,mPPO比活力隨著料液比升高均呈先升高后基本維持穩定,隨超聲時間的增加呈現先升高后保持恒定的趨勢,與單因素實驗結果變化趨勢一致。由方差分析可知,不同因素交互作用對mPPO比活力影響顯著,與其相對應的等高線形狀為橢圓形,表明緩沖溶液pH和超聲時間、緩沖溶液pH和料液比交互作用顯著。

圖4 料液比、超聲時間和緩沖液pH的交互作用

根據回歸模擬方程,得到最優mPPO提取工藝條件為:料液比為1∶5.20,超聲時間6.64 h,緩沖液pH為6.71。在此條件下mPPO比活力的預測值為687.7 U/mg,考慮到實際操作的可行性,將最優提取工藝修正為:料液比為1∶5.2,浸提時間7 h,緩沖液pH為6.7,在該條件下測定mPPO比活力平均值達(686.4±7.9) U/mg,與預測值基本一致。因此該模型可以很好的反映最優的mPPO提取工藝條件。

3 結論

本實驗以大西洋馬鈴薯為原料,通過超聲波輔助-緩沖溶液浸提法提取馬鈴薯中sPPO和mPPO,并通過響應面法對提取過程中料液比、提取時間、緩沖液pH等因素進行優化,以酶比活力為評價指標,確定最優的sPPO和mPPO提取工藝。優化后的sPPO提取工藝為:料液比為1∶3.2,浸提時間12 h,緩沖液pH為7.1,在該條件下測定sPPO比活力平均值達(130.5±2.4) U/mg,三個因素對sPPO提取的影響大小依次為:浸提時間>料液比>緩沖液pH。優化后的mPPO提取工藝為:料液比為1∶5.2,浸提時間7 h,緩沖液pH為6.7,在該條件下測定mPPO比活力平均值達(686.4±7.9) U/mg,三個因素對mPPO提取的影響大小依次為:超聲時間>料液比>緩沖液pH。通過實驗所得響應面模型可以對sPPO和mPPO提取工藝進行準確的預測和分析。