不同品種紫薯抗氧化物質及體外抗氧化活性比較

黃 彪,韋 航,李國良,何明燕,吳建鴻,林香信,*

(1.福建省農業科學院農業質量標準與檢測技術研究所,福建福州 350003；2.福建省農產品質量安全重點實驗室,福建福州 350003；3.福建省農業科學院作物研究所,福建福州 350003)

紫薯,因其塊根肉質部分成紫色而得名。紫薯營養成分豐富,含有淀粉[1]、多糖[2]、氨基酸[3-4]、多酚[5-7]、黃酮[5,8]、花色苷[9-11]和花青素[12]等多種物質,其中的多酚、黃酮、花青素等成分經研究表明具有良好的抗氧化、抗腫瘤、降血壓等活性功能[13-16]。紫薯豐富的營養功能成分使其在食品加工和保健食品開發等方面具有一定應用價值和開發前景。隨著紫薯系列產品加工的多樣化,紫薯的消費量也不斷增加。為滿足市場需求,推進紫薯產業的持續發展,加快紫薯種質資源的創新與選育,近年來我國一些地區如浙江、福建、廣東、廣西、安徽、海南等地方的科研院所陸續開展了紫薯種質資源的創新和選育的工作[17-19],并在相關工作中注重了相關品種的加工開發利用[20-21]。近年來在相關研究方面更注重了營養功能成分(如多酚、花青素、胡蘿卜素)強化型甘薯品種[22-24],系列鮮食及食品加工型品種的選育與創新[25],相關工作取得了較好的進展。

福建地處我國東南沿海,氣候條件屬于亞熱帶氣候,適宜的自然條件為紫薯新品種的選育及種植推廣提供了基礎,優質、適應性好的新品種甘薯,尤其是紫薯的品種創新是福建甘薯研究創新的重要方向。在紫薯研究方面,培育出了龍紫4號、龍紫6號、莆紫薯3號、莆紫薯18號、福寧紫3號、福薯24號等多個紫薯品種,為新品種的選育與應用提供了新材料,促進了紫薯產業的發展。本研究以福建產區的主栽紫薯品種為研究對象,重點分析了7份不同品種紫薯抗氧化功能性成分如總酚、總黃酮、花色苷及花青素含量,并對其體外抗氧化活性進行了比較,以期為紫薯新品種的選育及紫薯產品的開發提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

7份供試紫薯樣品龍紫4號、龍紫6號(福建龍巖)、莆紫3號、莆紫18號(福建莆田)、福寧紫3號、福寧紫4號(福建寧德)、福薯24號(福建莆田) 均由福建省農業科學院作物研究所提供；沒食子酸、蘆丁、飛燕草色素、矢車菊色素、矮牽牛色素、天竺葵色素、芍藥色素、錦葵色素 純度均大于97%,南京道斯夫生物技術股份限公司；甲醇、乙腈、甲酸 均為色譜純,美國Fisher公司；二苯基苦基苯肼(DPPH)、硫酸亞鐵、水楊酸、2′-聯氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、過硫酸鉀、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉、碳酸鈉、無水乙醇等 均為分析純,上海國藥集團化學試劑有限公司。

Wates e-2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司；Millipore Direct-Q5超純水儀 美國Millipore公司；SYG-2水浴恒溫振蕩器 常州朗越儀器有限公司；FW100型高速萬能粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司；TDL-5-A型低速大容量離心機 上海安亭科學儀器有限公司；IKA T 25樣品均質器 德國IKA公司；XW-80A旋渦混合器 上海醫科大學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 紫薯樣液的提取

1.2.1.1 紫薯總酚、總黃酮、總花色苷分析樣液的提取 參考孫海燕[6]、蔡湛等[8]的方法。稱取1.000 g磨碎的紫薯鮮樣置于棕色玻璃管中,加入10 mL含有0.1%鹽酸的74%乙醇溶液,70 ℃水浴中振蕩提取30 min,自然冷卻至室溫,將提取液轉移至離心管中,于5000 r·min-1轉速下離心5 min,離心結束后上清液全部轉移至圓底燒瓶,殘渣再加入10 mL含有0.1%鹽酸的74%的乙醇溶液重復以上操作提取2次,合并提取液,旋轉蒸發除去乙醇,用去離子水定容到10 mL,4 ℃條件下冷藏備用。

1.2.1.2 紫薯花青素組分分析樣液的提取 參照NY-T 2640-2014植物源性食品中花青素的測定(高效液相色譜法)。稱取樣品5.000 g于具塞比色管中,加溶劑(無水乙醇∶水∶鹽酸=2∶1∶1,V/V)定容至25 mL,超聲功率300 W常溫條件下提取30 min。超聲提取后,沸水浴恒溫90 ℃水解1 h,取出冷卻至室溫,再用溶劑定容至25 mL。靜置,取上清液置于離心管中,5000 r·min-1離心5 min,0.45 μm水相濾膜過濾,待測。

1.2.1.3 紫薯自由基清除實驗樣液提取 稱取5.000 g磨碎的紫薯鮮樣置于棕色玻璃管中,加入5 mL含有0.1%鹽酸的74%乙醇溶液,70 ℃水浴中振蕩提取30 min,自然冷卻至室溫,轉移至離心管中,于5000 r·min-1轉速下離心5 min,離心結束后上清液全部轉移至圓底燒瓶,殘渣再加入5 mL含有0.1%鹽酸的74%乙醇溶液重復以上操作提取2次,合并提取液,旋轉蒸發除去乙醇,用去離子水定容到10 mL,4 ℃條件下冷藏備用。

1.2.2 測定方法

1.2.2.1 總酚的測定 總酚測定采用福林酚比色法[26],以沒食子酸為標準品比對。配制1000 mg·L-1的沒食子酸標準儲備溶液,用移液管分別移取2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0 mL的沒食子酸標準儲備溶液于100 mL容量瓶中,分別用水定容至刻度,搖勻,得到濃度分別為20、40、60、80、100、200 mg·L-1的沒食子酸標準工作溶液。用移液管分別移取沒食子酸工作液、水(作空白對照用)及測試液各1.0 mL于25 mL刻度比色管內,在每個試管內分別加人5.0 mL的福林酚(Folin-Ciocalteu)試劑,搖勻,反應5 min,繼續加入4.0 mL 7.5% Na2CO3溶液,再加水定容、搖勻,室溫放置60 min后于765 nm處測定吸光值。根據沒食子酸工作液的濃度與吸光值制作標準曲線(y=3.97x-0.008,R2=0.9991),并根據測試液的吸光值計算樣品中含量。

1.2.2.2 總黃酮的測定 總黃酮含量的測定照Dewanto等[27]報道的方法,以蘆丁為標準品比對。配制200 mg·L-1的蘆丁標準儲備溶液,分別取蘆丁標準準備溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL,加純水至10 mL,再分別加入質量分數為5%的NaNO2溶液1.5 mL,搖勻,靜置6 min后加入質量分數為5%的Al(NO3)3溶液1.5 mL,搖勻,靜置6 min后再加人質量分數為4%的NaOH溶液20 mL,混勻,用分光光度計510 nm處測定吸光度值,制作標準曲線。取測試液10 mL于比色管中,以去離子水進行空白對照,按照上述相同的測定步驟依次加入NaNO2溶液、Al(NO3)3溶液、氫氧化鈉溶液混勻后于510 nm處測OD值,根據標準曲線方程(y=3.454x-0.007,R2=0.9995)計算樣品中的總黃酮含量。

1.2.2.3 總花色苷的測定 采用pH示差法[28-29]測定總花色苷含量。取KCl緩沖溶液(0.025 mol·L-1,pH1.0)和CH3COONa緩沖溶液(0.400 mol·L-1,pH4.5)各9.0 mL,將測試液1.0 mL分別加入其中,用去離子水作為空白對照,分別測定其在520、700 nm下的吸光度(A)。提取液花色苷含量按下式計算:

A=(A520-A700)pH1.0-(A520-A700)pH4.5

花色苷大都以糖苷的形式存在,消光系數與分子量Mw以矢車菊素葡萄糖苷計,Mw=449.2,ε=26900,DF為樣品的稀釋倍數。

1.2.2.4 花青素組分的測定 花青素組分的測定采用超高效液相色譜法(HPLC),參考標準NY-T 2640-2014液相色譜條件。色譜柱:Waters CORTECS C18柱(150 mm×4.6 mm,2.7 μm)；柱溫:35.0 ℃；檢測器:二極管陣列檢測器；檢測波長:530 nm；流速:0.8 mL·min-1；進樣量:5 μL；流動相A為含1%甲酸水溶液,流動相B為含1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脫程序如表1所示。每個樣品重復測定3次。

表1 HPLC梯度洗脫條件

1.2.2.5 DPPH自由基清除能力測定 配制0.1 mmol·L-1的DPPH溶液,取按方法1.2.1.3提取的不同品種紫薯樣品測試液0.5 mL分別加入2.0 mL 0.1 mmol·L-1的DPPH乙醇溶液,暗處反應30 min,在517 nm波長處測定吸光值A1。以無水乙醇代替樣品為空白對照,于波長517 nm測定吸光值A0。用無水乙醇代替DPPH溶液,測定2.0 mL無水乙醇與1.0 mL樣品稀釋液混合后在517 nm處的吸光值A2。每組做3個重復,求平均值。

DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.2.2.6 OH自由基清除能力測定 取按方法1.2.1.3提取的不同品種紫薯樣品測試液0.5 mL,分別加入1.0 mL 6mmol·L-1的硫酸亞鐵溶液和1.0 mL 10 mmol·L-1的水楊酸-乙醇,再加入1.0 mL 6 mmol·L-1雙氧水用以啟動反應,用振蕩器混合均勻,于37 ℃水浴10 min,在波長510 nm下測定吸光值A1。以無水乙醇代替樣品測定空白對照,于波長510 nm測定吸光值A0。用無水乙醇代替水楊酸-乙醇溶液,測定2.0 mL無水乙醇與1.0 mL樣品稀釋液混合后在510 nm處的吸光值A2,每組做3個重復,求平均值。

OH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.2.2.7 ABTS自由基清除能力測定 配制ABTS和K2S2O8的混合溶液,混合溶液中ABTS和K2S2O8的最終濃度分別為7.0、2.5 mmol·L-1,將混合液室溫避光條件下靜置12～16 h。實驗之前,將其用pH為7.4的磷酸鹽緩沖液進行稀釋,直到稀釋液在波長734 nm條件下的吸光度值為0.70左右,得到ABTS工作液。取按方法1.2.1.3提取的不同品種紫薯樣品測試液0.5 mL,加入ABTS反應液2.0 mL,50%甲醇2.5 mL,混勻,6 min后于734 nm處測定吸光值A1。以無水乙醇代替樣品測定空白對照,于波長517 nm測定吸光值A0。以磷酸緩沖液代替ABTS工作液,測定2.0 mL磷酸緩沖液與1.0 mL樣品稀釋液在517 nm處的吸光值A2,每組3個重復,求平均值。

ABTS自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

1.3 數據分析

Excel 2007對實驗數據進行整理,每個樣品進行3次重復試驗；DPS 7. 05進行數據統計及差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同品種紫薯中總酚、總黃酮、花色苷含量比較

新鮮紫薯樣品中的總酚、總黃酮、總花色苷含量如表2所示,不同品種紫薯總酚、總黃酮及總花色苷的含量表現出一定的差別。紫薯樣品中總酚含量為0.91～1.97 mg·g-1,福寧紫3號、龍紫4號紫薯總酚含量較高,分別為(1.97±0.03)、(1.64±0.02) mg·g-1,均極顯著高于其他品種(P<0.01)；而福薯24號和蒲紫18號紫薯樣品中總酚含量相對較低,兩者不存在顯著性差異,但是極顯著低于其他品種(P<0.01)。紫薯樣品中總黃酮含量為0.32～1.20 mg·g-1,福寧紫3號、龍紫4號紫薯樣品中總黃酮含量相對于其他品種較高,分別為(1.20±0.02)、(0.93±0.03) mg·g-1,顯著高于其他品種(P<0.05)；福寧紫4號、福薯24號、莆紫3號及莆紫18號樣品中的總黃酮含量較低,且它們之間無顯著性差異。紫薯樣品中總花色苷含量為0.45～0.70 mg·g-1,總花色苷含量最高的品種為福寧紫3號和龍紫6號,分別為(0.70±0.02)、(0.66±0.01) mg·g-1,極顯著高于其他品種(P<0.01),花色苷含量最低的為莆紫18號、福薯24號,兩者不存在顯著性差異,但是極顯著低于其他品種(P<0.01)。

表2 不同品種紫薯中總酚、總黃酮和總花色苷含量(鮮重)

表3 6種花青素組分的回歸方程和相關系數

表4 不同紫薯花青素組分含量(mg·kg-1,n=3)

2.2 不同品種紫薯花青素含量比較

6種花青素標準樣品及樣品的HPLC如圖1、圖2所示。以標液各組分質量濃度X為橫坐標(μg·mL-1)、色譜峰面積Y為縱坐標,得到各組分的定量標準曲線。各組分峰面積和濃度線性關系良好,回歸方程的相關系數r均大于0.995(表3)。

圖1 6種花青素標準品的HPLC圖

圖2 紫薯樣品的HPLC圖

從表4可以得知,紫薯中花青素組分主要為芍藥色素、飛燕草色素和矢車菊色素。福寧紫3號紫薯樣品中花青素含量較高,龍紫4號、福薯24號和莆紫18號紫薯樣品中的花青素含量則相對較低。不同紫薯樣品中,花青素組分的組成不盡相同。如在花青素含量較高的福寧紫3號和龍紫6號紫薯樣品中,花青素組分含量高低依次為芍藥色素、飛燕草色素和矢車菊色素；而在福寧紫4號紫薯樣品中,花青素組分含量高低順序則為芍藥色素/矢車菊色素、飛燕草色素。在分析的樣品中,含量最高的花青素為芍藥色素,其次為飛燕草素；這兩者在福寧紫3號紫薯樣品中的含量均極顯著高于其他品種(P<0.01)。

對照表2、表4紫薯中花色苷和花青素的含量,可得知花色苷含量較高的品種,花青素的含量也較高,但不同紫薯花青素組分的比例有所不同。花色苷是通過花青素與糖苷結合而形成,通過對花色苷進行水解得到花青素,運用高效液相色譜法對不同品種紫薯樣品進行分析,可以得知紫薯樣品中主要的花青素組分為芍藥色素、飛燕草色素和矢車菊色素,這與Terahara、韓豪等的報道一致[30-31]。但是目前國內對不同品種紫薯花青素組分的確定及含量相關研究還不多。劉超等[12]利用高效液相色譜法對不同品種紫甘薯中花色素進行分析,得到多種單體含量,但鑒于花青素單體較為復雜,在研究中未完全確定紫薯中具體花青素成分。而韓豪等[31]則是通過超高效液相色譜三重四級桿-串聯質譜技術(UPLC-MS/MS)定性分析了紫薯樣品中的花色苷組成,確定了紫薯花色苷中與糖苷結合的花青素單體有芍藥色素、飛燕草色素和矢車菊色素等。花青素是一類具有良好抗氧化、抗腫瘤、消炎抑菌功能活性的成分,可以作為天然色素用于食品加工業上的著色劑和食品防腐劑,也可用于化妝品行業用于增色劑,在食品、藥品及化妝品行業有著廣泛的用途[32-33]。本實驗的結果對福建產區主要品種紫薯花青素進行測定比較,對于紫薯類食品及功能保健產品開發具有一定的參考價值。

2.3 不同品種紫薯體外抗氧化活性比較

2.3.1 不同品種紫薯清除DPPH自由基活性比較 由圖3可以得出,測試的7種紫薯中,福寧紫3號和龍紫4號紫薯樣品提取液的DPPH自由基清除率較高,對DPPH清除率分別可達到88.4%和83.8%,極顯著高于其他品種紫薯樣品(P<0.01)；而福薯24號的DPPH自由基清除為61.7%,極顯著低于其他品種紫薯樣品(P<0.01)。

圖3 不同品種紫薯DPPH自由基清除活性比較

2.3.2 不同品種紫薯清除OH自由基活性比較 由圖4可以得出,福寧紫3號紫薯和龍紫4號紫薯樣品提取液的OH由基清除率高,分別達到49.1%和42.4%,極顯著高于其他品種紫薯樣品(P<0.01)；而莆紫18號和福薯24號的DPPH清除率分別為29.9%和31.4%,極顯著低于其他品種紫薯(P<0.01)。

圖4 不同品種紫薯OH自由基清除活性比較

2.3.3 不同品種紫薯清除ABTS自由基活性比較 ABTS與K2S2O8反應生成自由基陽離子,在抗氧化劑存在下,自由基陽離子與之反應,變成沒有顏色的ABTS。根據樣品溶液吸光度的變化,計算自由基清除活性。由圖5可以得出,福寧紫3號紫薯和龍紫4號紫薯樣品提取液的ABTS自由基清除活性較高,清除率分別為90.1%和85.1%,均極顯著高于其他品種紫薯樣品(P<0.01)；而莆紫18號和福薯24號的清除率分別為71.7%和72.8%,極顯著低于其他品種紫薯樣品(P<0.01)。

圖5 不同品種紫薯ABTS自由基清除活性比較

3 結論

通過對福建產區7個不同品種紫薯活性成分如總酚、總黃酮、總花色苷和花青素組分進行比較,并對不同品種紫薯體外抗氧化活性進行分析,結果表明,福寧紫3號紫薯中活性成分如總酚、總黃酮、總花色苷、花青素含量均為最高,對自由基表現出最好的清除活性；所分析的紫薯樣品中含有的主要花青素組分為芍藥色素、飛燕草色素和矢車菊色素,其中福寧紫3號紫薯中的花青素含量最高,莆紫18號紫薯中的花青素含量則最低。本研究結果可為紫薯的品種選育及應用提供一定的參考,為紫薯類產品的開發與利用提供相關參考依據。