基于SSR標記的野生荷花遺傳多樣性分析及指紋編碼構建

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摘要：為進一步了解野生荷花資源的遺傳特征，明確荷花育種親本的遺傳背景，以蘇州市農業科學院荷花種質資源圃收集的15個野生荷花資源為材料，選擇17對引物，包括15對SSR引物和2對cpSSR引物進行擴增，將擴增獲得的結果用于構建野生荷花DNA指紋圖譜，并開展遺傳多樣性分析。結果顯示，15對SSR引物在15個野生荷花中共擴增位點72個，平均每對引物4.8個，其中多態性位點有72個，PPL為100%，PIC介于0.371～0.834之間;2對cpSSR引物共檢測到9個單倍型位點，平均每對引物4.5個，其中多態性位點有8個，PPL為88.9%。野生荷花材料間遺傳相似系數介于0.530 9～0.925 9之間，平均值為0.676 2，采用UPGMA聚類，以系數0.669 6為依據，可將供試的15個野生荷花分為3組。

關鍵詞：野生荷花;SSR;指紋編碼;UPGMA聚類;遺傳多樣性分析

中圖分類號： S682.320.1? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0035-05

收稿日期：2019-12-30

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（19）3119];蘇州市應用基礎研究項目 （編號：SNG2018058）。

作者簡介：徐 君（1982—），男，江蘇蘇州人，碩士，副研究員，主要從事水生植物分子生物學研究。E-mail：sacxujun@163.com。

通信作者：尹江海，碩士，副教授，主要從事農業經濟管理研究。E-mail：yjh721218@126.com。

荷花（Nelumbo nucifera Gaertn.）是睡蓮科（Nymphaeaceae）蓮屬（Nelumbo Adans.）多年生水生草本花卉，現存蓮屬植物有2個種，分別為亞洲蓮和美洲黃蓮。我國是亞洲蓮的原產地之一，北至黑龍江省富錦市，南至海南島，東至上海、臺灣等地區，西至新疆天山地區，都有荷花的分布[1]。由于荷花具有較高的觀賞、經濟、文化和生態價值[2]，一直深受育種專家和消費者的喜愛。從20世紀80年代開始，我國的育種專家通過引進美洲黃蓮，并與亞洲蓮雜交，結合輻照等育種手段，創制了大量的荷花新品種[3]。而分布于各地原生境的野生荷花蘊藏著豐富的優質性狀，是極好的荷花育種親本材料。因此搜集野生荷花資源，并對資源進行鑒定和分類，對于進一步利用好野生荷花資源服務于荷花育種工作有著重要的現實意義。

野生荷花一般為原始的單瓣品種，僅僅通過形態學很難完全區分，且形態學鑒定具花費周期較長、結果易受人為因素干擾等缺點[4]。相對于形態學鑒定，分子標記鑒定是一種快速、簡便、經濟的方法。目前，擴增片段長度多態性（AFLP）[5]、隨機擴增多態性DNA標記（RAPD）[6]、簡單重復序列間擴增（ISSR）[7]等分子標記都有被應用于荷花親緣關系分析的報道。此外，薛建華等采用開發的簡單重復序列（SSR）標記，建立了荷花品種DNA指紋圖譜構建方法[8]。雖然分子標記在荷花資源分類中已有較多應用，但現有報道多見于栽培品種，對野生荷花的系統研究幾乎沒有。本研究擬采用文獻報道多態性較好的SSR引物，對供試的15個野生荷花進行SSR擴增，利用擴增位點信息構建指紋編碼，并對這些材料進行非加權組平均法（UPGMA）聚類分析，旨在能夠從分子水平對野生荷花材料進行分類和鑒定，為野生荷花親緣關系研究及分子標記輔助育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的15個野生荷花材料（表1）采集于各地原生境，保存于蘇州市農業科學院荷花資源保存圃，采用盆栽方式栽培保存。于2018年清明節前后對所有材料進行翻盤并采用健康的種藕繁殖，同年4月采集植株嫩葉，取樣時采用0.5 cm打孔器，在葉片四周、中部各打1孔，每個材料取3張葉片，樣本洗凈后直接放入離心管用液氮處理，置于-20 ℃凍存。

1.2 DNA的提取與驗證

全基因組DNA提取采用經典十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法[9]，提取的DNA樣本采用120 V電壓1% 瓊脂糖凝膠電泳檢驗。并用Nano drop 2000對DNA的純度和濃度進行檢測，將所提DNA濃度稀釋至20 ng/μL，置于 4 ℃保存備用。

1.3 荷花SSR標記

參考Yang等基于我國古代蓮全基因組開發的核微衛星（nSSR）引物[10]，選擇12對（SSR016、SSR030、SSR040、SSR045、SSR049、SSR064、SSR067、SSR074、SSR088、SSR285、SSR472和SSR482）;參考Tian等篩選的SSR引物[11]，選擇2對（Nelumbo13和Nelumbo14）;參考Kubo等篩選的SSR引物[12]，選擇1對（ns034）;參考Xue等從蓮葉綠體全基因組中開發的單倍標記葉綠體基因組微衛星標記（cpSSR）引物[13]，篩選2對（Lotus12和Lotus17）。一共有15對SSR引物和 2對cpSSR引物（序列信息詳見表2）用于野生荷花指紋編碼構建及親緣關系鑒定。正向引物5′端用4種熒光修飾[羧基熒光素（FAM）、六氯-6-甲基熒光素（HEX）、羧基-X-羅丹明（ROX）和羧基四甲基羅丹明（TAMRA）]，所有引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

PCR反應試劑采用TOYOBO公司的KOD-Plus試劑盒。PCR反應體系：10×KOD buffer? 2.5 μL;2 mmol/L dNTPs? 2 μL;25 mmol/L MgSO4 05 μL;10 μmol/L Forward Primer? 1 μL;10 μmol/L Reverse Primer? 1 μL;Template DNA? 1 μL;KOD-Plus 1 U;補水至25 μL。PCR反應參數：95 ℃ 5 min;95 ℃ 30 s，適宜退火溫度（各引物的退火溫度見表2）30 s，72 ℃ 30 s 共35個循環;72 ℃延伸 5 min。擴增反應完成后產物置于 4 ℃ 保存備用。

熒光引物擴增后產物利用ABI 3730測序儀進行毛細管電泳，并對毛細管電泳結果采用GeneMarker進行標準化分析，內參大小依次為5111、75.71、100.73、139.81、149.80、160.75、20081、250.78、300.79、340.78、350.78、400.80、450.78、490.82、500.90 bp。

1.4 數據統計分析

統計各引物擴增得到的擴增峰數量，采用人工讀取的方法，對照內參在相同遷移位置上，有峰的計為1，無峰的計為0，每個峰相當于1個等位基因位點。使用Excel軟件建立供試野生荷花材料與等位基因位點之間的0/1矩陣圖，統計每對引物擴增出的總位點數（T）、多態性位點數（N），記錄每個位點擴增片段的長度及每對引物擴增的多態性位點百分率（PPL）。PPL計算公式：PPL=（N/T）×100% 。利用Cervus 3.0.7軟件計算15對SSR引物的多態性信息含量（PIC）;利用NTSYS 2.0.1軟件計算供試材料間的遺傳相似性，構建UPGMA聚類圖。將15個荷花材料通過不同引物擴增獲得的等位基因位點，按照擴增片段長度從小到大的順序依次用阿拉伯數字編碼，位點超過9個以上，用個位數帶下劃線表示，構建野生荷花指紋編碼。

2 結果與分析

2.1 SSR擴增結果

利用篩選的17對引物，對15個野生荷花樣本基因組DNA進行擴增，擴增位點數、多態性位點數、PIC見表3。15對SSR引物在15個野生荷花中共擴增位點72個，平均每對引物4.8個，其中多態性位點有72個，PPL為100%。15對SSR引物擴增15個野生荷花的PIC介于0371～0.834之間，平均值為0.605，其中12對SSR引物的PIC大于0.5，說明15個野生荷花材料具備一定的多態性。2對cpSSR引物共檢測到9個單倍型位點，平均每對引物4.5個，其中多態性位點8個，PPL為88.9%。引物擴增位點片段的長度有較大差異。SSR引物中，ns034擴增的片段最短，為 102～124 bp，引物SSR088擴增的片段較長，為285～301 bp。此外，cpSSR引物中Lotus12擴增的片段最長，為380～434 bp。

2.2 15個野生荷花材料的遺傳差異分析

根據SSR標記位點擴增結果計算15個野生荷花材料之間的遺傳相似系數（表4），發現15個材料兩兩間的遺傳相似系數為0.530 9～0.925 9，相似系數平均值為0.676 2，遺傳相似系數越大說明材料間的遺傳差異越小。南埂野生蓮和汶溪紅蓮的遺傳相似系數最小，為0.530 9，說明二者遺傳差異較大。同樣采集于云南文山普者黑地區的野生荷花普者黑紅荷和普者黑白荷之間的遺傳相似系數最大，為0.947 4，二者遺傳差異最小。對表4中15個野生荷花材料兩兩間共105個相似系數進行UPGMA聚類分析，結果如圖1所示，以遺傳相似系數 0.669 6 為依據，可將15個材料分為3個組，其中Ⅰ組有2個野生荷花材料，分別為南埂野生蓮和蓮湖野生蓮;Ⅱ組有6個野生荷花材料，分別為山廟前野生蓮、微山湖紅蓮、東湖紅蓮、白洋淀紅蓮、西湖紅蓮、太湖紅蓮;Ⅲ組有7個野生荷花材料，分別為清塘野生蓮、洞庭湖野生蓮、汶溪紅蓮、濟寧野生紅蓮、普者黑白荷、普者黑紅荷、蘇州青蓮子。由此可見，同省份的荷花并未完全分在一組。

2.3 野生荷花指紋編碼的構建

15對SSR二倍體標記共有30位數字，2對cpSSR標記共有2位數字，因此本試驗使用的17對引物擴增對應每個野生荷花材料的DNA編碼由32位數字組成。將每對引物對15個野生荷花材料擴增獲得的所有位點按照片段大小從小到大進行編碼，建立編碼標準如表5所示。根據該標準，對15個野生荷花的擴增結果進行數據錄入，構建15個野生荷花材料的指紋編碼（表6），結果顯示該方法可以將15個野生荷花材料完全區分開。

3 討論與結論

荷花是我國重要的經濟和觀賞作物， 在景觀布置、水環境治理等方面也有較多的應用。從遺傳多樣性角度而言，荷花的遺傳背景相對狹窄，要利用好荷花滿足不同的產業需求，必須充分發掘現有的荷花資源。野生荷花多為單瓣型[14]，與栽培荷花相比，性狀相似，觀賞性不足，但野生荷花中包含有很多特殊性狀，如有學者在云南普者黑地區發現的株型超過3米的野生荷花，為大株型荷花新品種選育提供了非常好的親本材料[15]。因此，做好野生荷花鑒定工作，對引導荷花育種，尤其是特色荷花育種，全面開發荷花資源具有重要的意義。

要單獨采用表型鑒定的方法區分野生荷花材料相對較困難，有報道顯示，SSR標記是一種有效、可靠的分子標記，可用于荷花親緣關系鑒定和指紋圖譜的構建[8]。本研究采用前期研究所篩選的17對引物，包括15對SSR引物和2對cpSSR引物，對來源不同的15個野生荷花材料基因組DNA進行擴增，發現15對SSR引物可擴增位點72個，其中多態性位點有72個，PPL為100%;2對cpSSR引物可擴增位點9個，其中多態性位點有8個，PPL為889%。不同來源的野生荷花雖然表型性狀相似，但擴增位點多態性比例高，說明其中具有豐富的基因多樣性可以被挖掘。UPGMA分析結果顯示，15個野生荷花材料互相之間遺傳相似系數平均值為0.676 2，說明部分供試的野生荷花材料之間的相似度還是比較高的，其來源可能比較接近。盡管如此，通過SSR標記可以有效地區分15個野生荷花，每種荷花均有其特殊的指紋編碼，這為進一步明確野生荷花親緣關系，將其用于荷花育種提供了基礎。

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