渥丹組織培養技術研究

李艷敏　張晶　王朝陽　徐夢嵐　蔣卉　符真珠　張和臣

摘要：為了保護渥丹野生資源，加快其繁殖速度，開展以渥丹鱗莖為外植體的組織培養技術研究，篩選不定芽誘導、增殖及生根的最佳培養基，并進行移栽試驗。結果表明，渥丹鱗莖的中部鱗莖片適宜不定芽誘導，采用先預處理鱗莖再整體滅菌的方法，中部鱗片的污染率為10.0%，誘導和增殖培養基均為MS+0.1 mg/L KT+1.0 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6 g/L瓊脂，誘導率為100%，增殖系數為2.78;渥丹試管苗誘導生根培養基為1/2MS+0.5 mg/L NAA+1.0 g/L AC+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，生根率為100.0%，平均根數4.1條，平均根長為3.69 cm，同時該處理的生根試管苗移栽成活率為100.0%。

關鍵詞：渥丹;鱗莖;增殖;生根;移栽

中圖分類號：S682.2+65.04+3 ??文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0052-04

收稿日期：2020-05-12

基金項目：河南省科技攻關計劃（編號：192102110148）。

作者簡介：李艷敏（1978—），女，河南湯陰人，碩士，副研究員，主要從事園林植物組培快繁技術研究。E-mail：minzili@126.com。

通信作者：張和臣，博士，副研究員，主要從事園林植物遺傳育種及分子生物學相關研究。E-mail：zhc5128@126.com。

渥丹是百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）多年生草本球根植物，產于河南、河北、山東、山西、陜西和吉林，花深紅色，有香味，可觀賞，亦可提取芳香油作香料;鱗莖含淀粉，可食用或釀酒，也可入藥，具有滋補強壯、止咳之功效[1]。渥丹是紅花百合育種的重要親本材料[2]，也是百合科生物多樣性重要資源，具有良好的發展和應用前景。為了保護渥丹種質資源，同時又能夠開發利用這一重要資源，開展了其繁殖技術研究。目前關于渥丹的研究主要有不同居群形態多樣性、核型和花粉多樣性等[2-4]，其繁殖以扦插為主[5]，關于渥丹的離體培養技術研究報道很少[6-7]，研究者主要篩選了不同部位鱗片滅菌的適宜時間和培養基對增殖培養的影響，缺少對生根培養及移栽的系統研究，研究中存在外植體污染率高的問題，以中部鱗片為外植體，污染率為595%[6]。因此，本研究選擇渥丹地下鱗莖為外植體，采用先對鱗莖進行預處理再將鱗莖整體滅菌的方式進行消毒，降低渥丹外部和中部鱗片的污染率，同時對影響生根的激素種類和濃度進行篩選，并研究活性炭對渥丹試管苗生根的影響，對不同來源的生根苗分別進行移栽，根據試管苗生根率和移栽成活率確定最佳的生根培養基，完善其組織培養技術，為渥丹的綜合利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年在河南省南陽市寶天曼山中發現渥丹野生植株，取1株苗帶回鄭州，于2018年5月至2019年5月在河南省農業科學院園藝研究所園藝植物組織培養室，開展其組織培養技術研究。

1.2 方法

將取下的小鱗莖用自來水沖洗干凈，用洗潔精、多菌靈和羧芐溶液進行預處理，然后拿到超凈工作臺上進一步消毒滅菌，具體方法是用75%乙醇滅菌30 s，然后用0.1% HgCl2滅菌8 min，用無菌水沖洗1遍，再用0.1% HgCl2滅菌8 min，無菌水沖洗3遍，然后進行接種。接種時，將鱗莖按照從外到內的包裹順序分別切割，分為外部鱗片（W）、中間鱗片（Z）和內部鱗片（N） 3種，觀察這3種外植體的污染情況、誘導出芽情況以及誘導出不定芽數量。

渥丹鱗片誘導不定芽的培養基以MS為基本培養基，附加的植物生長調節物質有BA、KT以及NAA，具體的使用濃度及配比見表1。以中部鱗片為研究材料，觀察不同誘導培養基對不定芽誘導率及不定芽個數的影響。

將誘導出來的不定芽在MS+1.0 mg/L NAA+0.1 mg/L KT+30 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂培養基上繼代培養3代， 然后獲得足夠多的生長一致的無菌苗后，進行增殖培養和生根培養。增殖培養基以MS培養基為基本培養基，附加1.0 mg/L NAA、30 g/L蔗糖、6 g/L瓊脂，KT的濃度分別為0、0.1、0.5、10 mg/L，觀察不定芽的增殖情況;生根培養基同樣以MS為基本培養基，其中大量元素減半，附加的激素種類及濃度見表2。

以上培養均以30 d為周期，增殖和生根培養時，每個處理接種9瓶，每瓶4株苗，重復3次。培養條件為（25±2） ℃，光照度2 000 lx，光照周期為12 h/d。

將不同生根誘導培養基來源的渥丹生根苗分別進行移栽，移栽基質均為珍珠巖與草炭（1 ∶1）的混合基質，栽后放在育苗室，溫度為（23±2） ℃，并蓋膜保濕，移栽1周后通風，移栽1個月后統計各處理生根苗的移栽成活情況。

增殖培養和生根培養以及移栽均采用單因素完全隨機設計，所得數據用DPS 6.55軟件進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 不同部位鱗片消毒及出芽效果

渥丹不同部位鱗片，其消毒效果也不相同。從表3中可以看出，外部鱗片（W）的污染率最低，為0，其次是中部鱗片（Z），污染率為10.0%，內部鱗片（N）出現都是白色的細菌污染，污染率最高，為385%，應該是由于鱗片在內部，滅菌液無法充分對其消毒造成，因此選擇中外部鱗片作為外植體，污染率低。

不同部位鱗片誘導出芽的能力有差別，從表3中可以看出，W的誘導率僅7.1%，而Z和N的誘導率分別為70.0%、69.2%，是W誘導率的10倍左右，說明Z和N作為渥丹外植體，誘導效率最好。結合污染率和誘導率，中部鱗片適宜作為渥丹組織培養的外植體。

2.2 不同培養基對中部鱗片誘導效果的影響

將中部鱗片接種到不同的誘導培養基上，觀察誘導培養基對其不定芽誘導的影響。從表4可以看出，在培養基2和培養基5中，鱗片的誘導率均為100%，誘導出來的不定芽數量分別為2、4個，其他3種培養基誘導率均為50%，誘導出來的不定芽均為1個，說明培養基2和5適合中部鱗片不定芽誘導，以培養基5最為合適，即0.1 mg/L KT+10 mg/L NAA的組合能夠用于鱗片不定芽誘導。

2.3 增殖培養基篩選

從表5以看出，僅添加1.0 mg/L NAA的對照，其增殖系數為2.28，苗鱗莖片大，葉片多，同時伴有玻璃化現象發生。添加不同濃度的KT后，試管苗的增殖系數和生長狀況有不同變化，添加0.1 mg/L KT的B1處理，其增殖系數為2.78，與對照差異不顯著，但試管苗分化的鱗莖多，有生根現象;當KT濃度進一步增加到0.5 mg/L（B2處理）和 1.0 mg/L（B3處理）時，增殖系數開始下降，其中B2處理增殖系數為1.97，與CK、B1處理差異不顯著，B3處理增殖系數為1.55，顯著低于B1處理，但是與CK和B2處理差異不顯著，并且渥丹試管苗鱗莖片大，葉片少，生長勢弱。因此，渥丹增殖的適宜培養基為MS附加1.0 mg/L NAA和0.1 mg/L KT。

2.4 不同生根培養基對渥丹試管苗生根及移栽的影響

從表6可以看出，渥丹試管苗在不添加激素的空白培養基中，可以達到100.0%的生根率，但是平均根數少，僅2.9條;添加不同濃度和種類的生長素以及AC后，生根率和平均根數及平均根長均呈現不同的變化。單添加不同濃度的NAA（處理號T1～T3）后，與對照相比，生根率和平均根長顯著下降，但是T1和T2處理的平均根數顯著增加，以T2處理的平均根數最多，為5.0條;將NAA和AC配合使用（處理號T4～T5）時，生根率和對照相比差異不顯著，但是平均根數顯著高于對照，并且T5處理的生根率為100.0%，平均根數為4.1條，平均根長 3.69 cm，顯著高于對照;將NAA和IBA配合使用（處理號T6～T7時），T7處理的生根率與對照無差異，平均根數顯著高于對照，但是平均根長顯著低于對照。因此，與對照相比，添加適宜濃度的NAA和IBA后，可以促進渥丹試管苗平均根數的增加，但是會抑制根長生長;添加適宜濃度的AC后，可以促進渥丹試管苗平均根數和平均根長，提高生根苗質量。

將不同來源的渥丹生根試管苗經過相同的煉苗方式，移栽到相同基質后，移栽成活率可以達到89.4%及以上，不同處理的植株移栽成活率稍有差異，來源于T5的生根苗，移栽成活率最高，為1000%，與CK差異不顯著;在移栽苗生長勢方面，來源于CK、T1、T4、T5處理的植株挺立，生長勢良好，這些處理的試管苗平均根長均在1.0 cm以上，來源于T2、T3、T6處理的植株生長勢弱，植株不挺立，這3個處理的試管苗平均根長均低于1 cm，說明平均根長對試管苗移栽后的生長影響較大。

綜上，渥丹試管苗在T5處理中生根率和生根質量最好，并且移栽成活率也最高，為渥丹試管苗的最佳生根培養基。

3 結論與討論

外植體滅菌技術是植物組織培養研究中的一項重要內容，鱗莖由于生長在土壤中，帶菌較多，滅菌較困難，污染率較高[8]，在以往的渥丹離體培養報道中，對鱗莖的滅菌方式是沖洗鱗莖，剝下鱗片，按不同部位進行洗潔精刷洗，流水沖洗，再用0.1% HgCl2溶液2次滅菌，污染率得到了良好的控制，但是對外部鱗片和中部鱗片而言，污染率依然分別在43.33%、28.33%以上[2]。在本研究中，對渥丹地下鱗莖的滅菌方法進行了改良，首先在預處理環節，對鱗莖進行整體處理，并采用頭孢和羧芐溶液初步消毒，然后再在超凈臺上用75%乙醇和0.1% HgCl2進行消毒，無菌水沖洗結束后，再開始剝下鱗片接種。采用此方法滅菌，有效地降低了污染率，尤其降低了外部鱗片和中部鱗片的污染率，但是由于鱗莖整體滅菌，滅菌液不能很好地滲透到內部鱗片，出現內部鱗片滅菌不徹底，均為細菌污染，污染率高。不同部位的鱗片，其誘導率有差異，誘導能力從強到弱依次為中部鱗片>內部鱗片>外部鱗片，這與趙靜等的研究結果[9]一致，與楊偉茹等的研究結果[6，10]不一致，這可能與滅菌方式不同有關。魯潤龍以百合鱗片進行組織培養時發現，芽原基來源于鱗片表皮細胞及其鄰近皮層細胞分裂加快，撕去表皮細胞時，則無法形成芽原基，不能形成鱗莖[11]。在本研究中，外部鱗片的誘導率很低，可能是因為外部鱗片與滅菌液接觸時間長，滅菌液對鱗片表皮損傷嚴重，從而降低了其誘導分化能力。

植物生長調節劑在試管苗不定根形成過程中起決定性作用，適宜濃度的生長調節劑不僅有利于誘導根原基，還有利于不定根的生長，但過高濃度的生長調節劑會抑制根原基的生長，進而影響根伸長[12]。在百合的組織培養研究中，藥用百合生根時，幼苗生根時采用1/2MS附加NAA時，誘導出的根短且粗壯，有根毛，移栽易成活[13];南川百合無根苗生根的最佳培養基為1/2MS+0.5 mg/L NAA，生根率為86.7%[9];野百合試管苗以不加任何激素的1/2MS生根最好，添加0.2 mg/L NAA時對生根有抑制作用[14];活性炭具有吸附作用，同時能夠提供一種黑暗環境，有利于植物生根[15]，百合生根時培養基中添加活性炭后生根時間早，不定根濃密粗壯[12]。本研究結果表明，渥丹試管苗生根培養時，培養基中添加0.1～0.5 mg/L生長素可以提高生根數量，NAA的濃度達到1.0 mg/L時，生根率、平均根數和平均根長都顯著降低;將NAA和IBA配合使用，對試管苗生根率和根數有促進，但是顯著抑制根生長。在不添加任何激素的空白培養基中，生根率可以達到100.0%，但是生根質量一般，主要表現在根數和根長方面，平均根數為2.9條，平均根長為2.26 cm;在生根培養基中添加0.5 mg/L NAA和10 g/L AC的T5處理中，生根率為100.0%，平均根數為4.1條，平均根長為3.69 cm，顯著高于對照處理，并且在對生根試管苗進行移栽后發現，T5處理的移栽成活率為100.0%，對照處理的移栽成活率為98.5%，說明活性炭可以促進渥丹試管苗生根，提高生根率和生根質量，有利于移栽，這與張俊秀的研究結果[12]一致。

綜上，以渥丹鱗莖為外植體進行組織培養，采用預處理后再將鱗莖整體消毒的方法，可以降低污染率，中部鱗莖片適宜不定芽誘導，誘導和增殖培養基均為MS+0.1 mg/L KT+1.0 mg/L NAA+30 g/L 蔗糖+6 g/L瓊脂，誘導率為100%，增殖系數為2.78;渥丹試管苗誘導生根培養基為1/2MS+0.5 mg/L NAA+1.0 g/L AC+20 g/L蔗糖+6 g/L瓊脂，生根率為100.0%，平均根數4.1條，平均根長為3.69 cm，同時該處理的生根試管苗移栽，其成活率為100.0%。

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