HPLC多成分測定及主成分分析法對不同產地鮮地黃質量評價

李詢　董誠明　齊大明　李曼　邢冰　侯楊威

摘要：以采自河北、山西、河南等省的35份鮮地黃為試驗材料，以浸出物、多糖、梓醇、毛蕊花糖苷、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷為考察指標，采用HPLC多成分同時測定與主成分分析法，評價不同產地鮮地黃品質差異。結果表明，3個產地的35批鮮地黃品質差異明顯，河南省的樣品地黃苷A、毛蕊花糖苷含量較高，河北省的樣品地黃苷D含量較高，山西省的樣品多糖含量較高，35份鮮地黃樣品的綜合主成分值范圍為-0.647 9～2.974 1，河南產區(qū)的主成分分析均值最高，為0.306 8，其次是河北省，為-0.183 7，再次是山西，為-0.281 2。不同產區(qū)地黃品質存在差異，綜合分析以河南產區(qū)為佳，HPLC多成分同時測定與主成分分析相結合可以綜合評價鮮地黃的質量，為地黃原藥材的質量評價提供便捷有效的參考依據。

關鍵詞：鮮地黃;HPLC;浸出物;多糖;環(huán)烯醚萜苷;苯乙醇苷;主成分分析

中圖分類號： S567.23+9.01;R284.1? 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2020）19-0225-05

收稿日期：2019-12-19

基金項目：河南省重大科技專項（編號：171100310500）;國家標準化項目（編號：ZYBZH-Y-HEN-18）;國家重點研發(fā)專項（編號：14104584-2018-1）。

作者簡介：李 詢（1994—），女，河南鄭州人，碩士研究生，從事生藥學研究。E-mail：1025552320@qq.com。

通信作者：董誠明，教授，從事中藥材規(guī)劃范種植技術研究。E-mail：dcm371@hactcm.edu.cn。

地黃（Rehmannia glutinosa Libosch.）為玄參科多年生草本植物，主產于河南省、河北省、山西省、東北等地，以古懷慶府一帶的懷慶地黃栽培歷史最長，被稱為懷地黃，氣候、土壤等因素造成各地地黃有效成分有所差異。地黃作為臨床常用藥，質量控制至關重要，地黃中含有環(huán)烯醚萜苷類及苯乙醇苷類等主要成分，具有利尿、降糖、滋陰補血[1-3]，調節(jié)免疫，抗炎、抗衰老等作用[4-7]。2015年版《中國藥典》中以梓醇和毛蕊花糖苷的含量作為質量評價的主要指標，難以全面考察其質量。

近年來地黃在山西、河南、河北等省種植較多，為研究各產地鮮地黃的質量差異，本研究選取河南、山西、河北3地的鮮地黃（北京3號）為研究對象，以浸出物、多糖及地黃中5種苷類物質的含量為考察指標，用高效液相色譜法同時測定梓醇、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷含量。建立便捷、可靠的方法同時測定鮮地黃中多種成分含量，分析各產地地黃質量差異，可為建立鮮地黃質量標準評價體系提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

試驗樣品由筆者在不同產地采集，經河南中醫(yī)藥大學董誠明教授鑒定，為玄參科植物地黃北京3號的塊根，55 ℃低溫烘干打粉后供本試驗研究使用。樣品信息見表1。

1.2 浸出物、多糖含量檢測

浸出物按照《中國藥典》2015年版冷浸法測定;多糖含量按照苯酚-硫酸法測定[8]。

1.3 梓醇、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷含量測定

1.3.1 色譜條件

色譜柱為安捷倫ZORbAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5-Micron），流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 min，1.3%A;5 min，1.5%A;6 min，3%A;14 min，3%;15 min，4%A;20 min，4%A;25 min，20%A;40 min，20%A）;體積流量為1 mL/min;柱溫35 ℃;檢測波長0～20 min：203 nm，21～35 min：334 nm;進樣量20 μL（圖1）。

1.3.2 對照品溶液的制備 精確稱取梓醇、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷對照品，加超純水配置成濃度分別為2.4、0.3、0.2、0.2、0.3 mg/mL 的混標溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備 精確稱取生地黃樣品粉末0.8 g，置于具塞平底燒瓶中，加入甲醇50 mL，稱定質量，超聲提取1 h，放至室溫，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，精確量取續(xù)濾液20 mL，濃縮近干，殘渣用水溶解，轉移至10 mL量瓶中，臨用前用0.22 μm微孔濾膜過濾。

1.4 方法學考察

1.4.1 線性關系考察 取“1.3.2”節(jié)中制備的對照品溶液，記為溶液1，依次稀釋1.25、2.00、4.00、10.00、20.00、40.00倍，記為混標溶液2～7（溶液7僅用于毛蕊花糖苷的線性范圍考察）。按照“1.3.1”節(jié)的方法進樣，以對照品進樣量為橫坐標（x），峰面積積分值為縱坐標（y），繪制標準曲線，得到回歸方程見表2。

1.4.2 精密度試驗 精確吸取同一鮮地黃供試品溶液，按照“1.3.1”節(jié)的色譜條件測定，重復進樣6次，記錄峰面積，計算得梓醇、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷、毛蕊花糖苷的相對標準偏差（RSD）分別為0.62%、1.75%、1.46%、1.74%、0.20%，表明儀器精密度良好。

1.4.3 重復性試驗 精確稱取同一批次的鮮地黃粉末6份，按“1.3.3”節(jié)方法制備供試品溶液，按照“1.3.1”節(jié)方法進行色譜條件測定，記錄色譜圖。得梓醇、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷的RSD分別為1.88%、1.27%、1.49%、0.68%、1.73%，表明此方法重復性良好。

1.4.4 穩(wěn)定性試驗 精確吸取同一鮮地黃供試品溶液20 μL，分別于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、24 h，按照“1.3.1”節(jié)的色譜條件測定。結果梓醇、地黃苷A、地黃苷D、益母草苷及毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.47%、0.31%、1.31%、1.61%、0.88%，表明室溫條件下供試品溶液在24 h 內基本穩(wěn)定。

1.4.5 加樣回收率 精確稱取已測定含量的25號樣品粉末6份，每份0.2 g，分別精確加入梓醇、地黃苷D、地黃苷A、益母草苷及毛蕊花糖苷對照品6.51、0.12、0.37、0.72、0.32 mg，按照“1.3.3”節(jié)的方法制備供試品溶液（所有試劑均減半），按照“1.3.1”節(jié)的色譜條件測定，結果顯示平均加樣回收率分別為99.87%、101.78%、96.14%、97.69%、102.57%，RSD值分別為0.96%、1.23%、1.35%、0.58%、1.03%，表明此方法能夠很好地提取出指標性成分。

1.4.6 樣品測定

35份鮮地黃樣品按“1.3.3”節(jié)進行制備，以“1.3.1”節(jié)條件測定，每個樣品重復3次。

2 結果與分析

按照“1.2”“1.3”節(jié)所述檢測35份樣品中考察指標的含量，結果見表3。浸出物含量最高的是N21，多糖含量最高的是X13，梓醇含量最高的是N22，毛蕊花糖苷含量最高的是N22，地黃苷D含量最高的是B5，地黃苷A含量最高的是N22，益母草苷含量最高的是N33。

運用主成分分析法，浸出物、梓醇、地黃苷D、地黃苷A、益母草苷、毛蕊花糖苷、多糖含量為指標性成分，對35份地黃樣品中的百分含量進行綜合分析。根據降維結果，共挑選出3個主成分PC1、PC2、PC3，特征值分別為2.674、1.372、0.887。累計貢獻值為70.476%，具有代表性，可以用來評價地黃質量。綜合主成分值可以反映不同地黃的質量，得分越高表示成分質量分數越高，地黃質量越好。由表4可知，35份鮮地黃樣品的綜合成分值在-0.647 9～2.974 1，表明不同產地鮮地黃的成分量范圍。綜合值排序可以看出N22號即河南省溫縣趙堡鎮(zhèn)趙堡村的鮮地黃質量最好，X13號即山西省永濟市韓陽鎮(zhèn)韓陽村的鮮地黃質量最差，河南省、河北省、陜西省鮮地黃指標性成分主成分分析均值分別為0.306 8、-0.183 8、-0.281 2，河南各地的平均分最高，山西產地的平均分最低。

3 討論

本研究建立了鮮地黃中5種化學成分同時測定的HPLC方法，該法高效、準確、重復性好，能客觀準確地反映出不同產地鮮地黃化學成分含量的差異，對于評價鮮地黃質量優(yōu)劣具有一定的參考價值。多指標測定有利于更加全面地考察鮮地黃的藥效物質基礎，結合浸出物、多糖含量有利于更加全面、客觀評價鮮地黃藥材的質量。

本研究采用主成分分析法，通過變量之間的相關性減少變量將數據降維，將本試驗所得的7個指標進行綜合全面評價，從而有效地反映不同指標與鮮地黃質量的關系，更加全面客觀地評價不同產地地黃品質差異。結果表明，不同產地鮮地黃差異明顯，河南省的樣品中地黃苷A、毛蕊花糖苷含量較高，河北省的樣品地黃苷D含量較高，山西省的樣品多糖含量較高，與各地環(huán)境氣候及人為因素有關。經主成分分析，得出各產地鮮地黃綜合質量為河南優(yōu)于河北優(yōu)于山西，這與地黃道地性相符，河北地區(qū)所用地黃種栽基本來源于河南省，因此質量優(yōu)于山西省。

參考文獻：

[1]趙素容，盧兗偉，陳金龍，等. 地黃梓醇降糖作用的實驗研究[J]. 時珍國醫(yī)國藥，2009，20（1）：171-172.

[2]董 炤，陳長勛. 梓醇藥理作用的研究進展[J]. 中成藥，2013，35（5）：1047-1051.

[3]于 震，王 軍，李更生，等. 地黃苷D滋陰補血和降血糖作用的實驗研究[J]. 遼寧中醫(yī)雜志，2001，28（4）：240-242.

[4]唐永富，黃丹菲，謝明勇，等. 毛蕊花苷和異毛蕊花苷對樹突狀細胞增殖的影響[J]. 中國藥學雜志，2008，43（23）：1785-1787.

[5]王 軍，于 震，李更生，等. 地黃苷A對“陰虛”及免疫功能低下小鼠的藥理作用[J]. 中國藥學雜志，2002，37（1）：20-22.

[6]宋小敏，廖理曦，董 馨，等. 毛蕊花糖苷抑制脂多糖誘導的BV-2小膠質細胞炎癥反應及機制研究[J]. 中國中藥雜志，2016，41（13）：2506-2510.

[7]邢海燕，苗 鑫，張曉菲，等. BDNF乙?；揎梾⑴c毛蕊花糖苷對Aβ25-35致PC12細胞損傷的保護作用[J]. 中國新藥雜志，2018，27（16）：1910-1917.

[8]張駱琪，劉蘇偉，王 飛，等. 地黃多糖超聲提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性[J]. 中成藥，2018，40（12）：2662-2667.