紫色土塘泥微生物群落季節變化及其與環境因子的關系

李天才，趙晴云，江 瑞，付 梅，蘇勝齊*

(1.西南大學動物科技學院，重慶 400700；2.西南大學漁業資源環境研究中心，重慶 400700；3.雅礱江流域水電開發有限公司，四川 成都 610000)

【研究意義】隨著漁業養殖集約化程度的不斷提升，高密度投飼精養池塘中殘餌糞便在塘泥中持續累積使得營養物質不斷升高[1-2]，最終造成水體富營養化、氨氮中毒、疾病爆發等系列養殖生態系統健康問題也越來越顯著[3]。采用藥物對塘泥進行改良、改造只是暫時性措施，生態調節才是解決問題的可持續手段。因此，研究池塘生態系統中塘泥微生物群落特征具有非常重要的意義。【前人研究進展】塘泥微生物不僅是池塘生態系統的組成部分，也是生態修復的功能菌庫[4]，其在生長繁殖過程可消耗有機質，同時產生的多種酶是有機質分解的催化劑[5]，甚至可直接同化或降解有毒、有害物質[6]。塘泥微生物雖對環境修復有積極作用，但也常常是水產品的病原菌或條件致病原庫[4]，甚至部分種類會直接降低水產品品質[7]，在水產養殖中占據著特殊的地位。紫色土形態獨特，肥力豐富，是我國重要的農業土壤資源[8]。四川盆地集中分布著我國51.53 %面積的紫色土[8]，其中四川盆地中的川渝地區是我國重要的池塘養殖區域，池塘的建造基本以紫色土為基礎。目前關于紫色土的研究多集中于肥力、水土保持等方面[9-11]，而對紫色土池塘生態系統的研究目前較少。【本研究切入點】本試驗以蓬萊鎮組微堿性紫色土為底質模擬紫色土池塘養殖過程，測定春、夏和秋季塘泥環境因子，鑒定塘泥微生物種類，旨在解析紫色土塘泥微生物群落特征及其與環境因子之間的關系。【擬解決的關鍵問題】為紫色土池塘“泥—水”相調控提供依據和指導，同時為深入開展不同紫色土的宜漁性評價提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗系統構造

試驗用紫色土取自大足區重慶市大足區(N 29.7264°，E 105.9689°)，分類上屬蓬萊鎮組(J3s)，取土時將表層土壤刨去，挖取風化而未經耕作的0～20 cm土壤。把50 kg紫色土轉入不透明水族缸(豎切面為梯形，r1= 30 cm，r2= 40 cm，h=80 cm)中，加入曝氣自來水，土水比為1∶5[12]，土層厚12 cm[13]，覆水60 cm。每缸放養全長(69.7±1.2) mm的湘云鯽7尾[14][尾均重為(9.57±0.08) g]，每天投喂3 %體重飼料，設置3個重復，水族缸充氧，每月22日換水1/3。系統設置在室外有頂通風平臺下。試驗進行時間為2016年4月10日至9月22日，為期160 d，分別于5月22日、7月22日、9月22日使用柱狀采泥器收集塘泥樣本，將原始紫色土和試驗收集的3組樣品分別編號為S0、春、夏和秋。

1.2 塘泥環境因子測定方法[15]

溫度：每天傍晚直接用溫度計測定塘泥溫度；pH：水土比為2.5∶1混合后使用phs-3c型pH計測量；氧化還原電位(O.R.P)：塘泥樣本取出后迅速用O.R.P計直接測量。

取回的塘泥先陰干，之后進行碾磨并過0.25 mm篩網，收集100 g塘泥粉末用于測定營養成分。有機質、TN、TP、TK分別采用重鉻酸鉀法、重鉻酸鉀-硫酸消化法、氫氧化鈉堿熔-鉬銻抗比色法、火焰光度法進行測定。

1.3 塘泥微生物培養與鑒定方法

微生物(指好氧或兼性厭氧微生物，下同)培養：挑取0.5 g塘泥37 ℃溶解于0.9 % NaCl溶液中制成2.5·10-4g/mL塘泥混合液，吸取0.5 mL混合液涂布于LB培養基上[16]，設置3個重復，37 ℃無光培養24 h后統計菌落數n[17]。

微生物總DNA提取[18]：稱取1 g土樣與提取液于5 mL離心管中渦旋混合，之后迅速至于-81 ℃冷凍30 min，取出并65 ℃水浴融化，如此反復進行裂解3～5次；加入8 μl蛋白酶K(25 mg/mL)，于37 ℃搖床上震蕩30 min(225 r/min)；加入1.5 mLSDS(200 g/L)，65 ℃水浴2 h，每15 min左右顛倒混勻；微微離心(20 g，20 s)后將液相轉入新的5 mL離心管中繼續室溫離心10 min(6000 g)；土樣繼續加入提取液和0.5 mL SDS，渦旋混合后65 ℃水浴10 min，接著室溫離心20 min(6000 g)，上清液與前次上清液合并；上清液加入等體積氯仿-異戊醇(24∶1)進行抽提，之后室溫離心5 min(6000 g)；將液相轉入1.5 mL離心管中，加入0.6體積異丙醇后室溫沉積1 h，之后再進行室溫離心10 min(10 000 g)收集核酸；用冷的700 mL/L乙醇洗滌沉淀，吹干，溶于50 μl滅菌超純水中， -20 ℃保存。

PCR[16]：于冰上向PCR管中加入40.5 μl去離子水、5 μl 10×PCR反應緩沖液、1 μl模板、1 μl核酸、2 μl上下游引物(V3V4引物：341F 5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′,806R 5′-GGACNNGGGTATCTA AT-3′)、0.5 μlTaq-DNA聚合酶后渦旋混合；設置94 ℃預變性2 min，97 ℃變性1 min，50 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，30輪循環，最后1循環結束后72 ℃延伸10 min。

檢測條帶：取10 μl擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，若無條帶則調節PCR反應條件或再次提取微生物總DNA，直至檢測出現條帶。

高通量測序：樣品委托深圳市恒創基因科技有限公司代為進行高通量測序(Illumina MiSeq測序平臺)工作。

1.4 數據處理與分析

微生物密度公式C=8n×103cfu/g使用SPSS19.0軟件對獲得數據進行統計分析，采用Duncan多重比較法檢驗組間差異，設置重復的處理以均值(E±SD)為結果，在Excel2016軟件中制作圖表；塘泥微生物群落特征與環境因子之間的關系使用CANOCO4.5軟件進行分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 塘泥環境因子

由表1可知，塘泥溫度春季最低，夏季最高，總體在19.3～33.4 ℃；塘泥試驗初期由堿性快速轉變為中性，之后春、夏、秋季均穩定在7.09～7.20；塘泥O.R.P持續升高，但始終保持強還原性；塘泥有機質、TN、TP、TK等營養成分含量均呈升高趨勢。綜合比較，夏、秋季塘泥環境因子數值相近，與春季差異較大。

2.2 塘泥微生物群落特征季節變化

2.2.1 塘泥微生物群落多樣性季節變化 由表2可知，春季塘泥微生物密度顯著高于夏季和秋季(P<0.05)，分別為2.954×106、1.587×106和1.504×106cfu/g；春、夏、秋季3次取樣過程中，塘泥Shannon、Chao和Observed species等群落多樣性指數均持續升高，而塘泥Simpson Index和Pielou Index多樣性指數夏季均為最低，但均接近于1。

2.2.2 塘泥中微生物門類季節變化 經取樣測序分析，春、夏、秋季塘泥中分別包括33、42、41門微生物，共歸屬44門，其平均豐度前15的門類占總微生物比例超過94.0 %。由圖1可知，在春、夏、秋季塘泥中變形菌門和擬桿菌門均為優勢門類；酸桿菌門、梭菌、厚壁菌門和疣微菌門均為大量(大于1 %)微生物門類；綠彎菌門、Elusimicrobia、螺旋體、Latescibacteria、芽單胞菌門和纖維桿菌門等微生物門類在各季節豐度變化幅度較大；Saccharibacteria、硝化螺旋菌門和放線菌等3個微生物門類在各季節豐度均低于1.0 %。不同季節塘泥中優勢和大量微生物門類相似。

2.2.3 塘泥中豐富前10微生物屬季節變化 對春、夏、秋3個樣本中塘泥微生物進行屬級統計分析，并將不同季度占比前10的屬繪制成圖2。統計分析發現，3個樣本中共檢測到2783種微生物(OUTs)，其中大多數為尚未定義或研究的類群，可分類到屬的共有323屬，可分類到種的共有76種。由圖2可知，不同季度占比前10的屬共包括16個屬；未培養的腐螺旋菌科、噬氫菌屬、Draconibacteriaceae-uncultured和未培養的芽單胞菌科在春、夏、秋季占比均在前10之列；2個季節中占比均在前10之列的屬數量：春季和夏季有5個、春季和秋季有6個、夏季和秋季有8個。不同季節塘泥中占比前10的微生物屬差異明顯，相同的屬在不同季節占比也十分不同。

表1 塘泥環境因子季節變化

表2 塘泥微生物群落多樣性季節變化

圖1 塘泥中微生物門類季節變化(%)Fig.1 Accounted for the phylum taxa abundance of the pond mud in different season at phylum level

2.2.4 塘泥中功能微生物季節變化 在池塘養殖過程中，許多微生物對漁業生產有其獨特的功能和作用，于生產有利的可歸為益生菌，而不利的則可歸為有害菌。由表3可知，春、夏、秋季塘泥中出現益生菌包括硝化菌和放線菌，有害菌包括黃桿菌、腸桿菌、氣單胞菌和假單胞菌；硝化菌和放線菌在春、夏、秋季塘泥中均有一定豐度，夏季塘泥中兩種益生菌占比均為最高，春季均最低；春季塘泥中4種有害菌占比均大于0.01 %，夏季塘泥中前3種有害菌占比大于0.01 %，秋季塘泥中僅有黃桿菌和氣單胞菌占比大于0.01 %。

對主要微生物屬編號，以便下文RDA分析作圖Numbered the main genus for RDA analysis and plotting圖2 塘泥中主要微生物屬比例季節變化(%)Fig.2 Accounted for the genus taxa abundance of the pond mud in different season at genus level

2.3 塘泥微生物群落與環境因子的關系

在復雜情況下，微生物種群與多個環境因子之間的關系常使用Canoco軟件進行多元統計分析，該軟件可以對環境因子和群落信息進行綜合分析并分別指出它們間的相互關系[19]。

2.3.1 塘泥微生物群落多樣性與環境因子的關系 由圖1可知(Lengths of gradient<3)，微生物密度與塘泥環境因子均呈負相關性，O.R.P、SOM、TN和AP與微生物群落多樣性呈較強的相關性，其它環境因子則較弱。由Canoco分析數據表明，僅SOM(-0.90)、TP(-0.87)和AP(-0.94)與第一排序軸相關性系數絕對值大于0.85，即在春、夏、秋季中塘泥SOM、TP和AP是影響微生物群落多樣性的主要環境因子，且與微生物密度呈顯著負相關性(P<0.05)。

2.3.2 塘泥中微生物與環境因子的關系 由圖2可知(Lengths of gradient<3)，春、夏、秋季分別位于3個象限且距離較遠，表明塘泥微生物群落季節差異十分明顯，而夏和秋季距離相對最近即塘泥微生物群落結構相似性相對較高。從Canoco分析數據發現，僅T(0.87)、pH(0.89)和AP(0.86)與第一排序軸相關性系數絕對值大于0.85，即在春、夏、秋季中塘泥T、pH和AP是影響群落中豐度較高微生物分布的主要環境因子，而不同微生物與主要環境因子關系各有不同，總體上顯著負相關的微生物種類較多(Fluviicola、噬氫菌屬、Fluviicoccus、Lacibacter和env.OPS17，P<0.05)，顯著正相關的微生物種類較少(Hados.Sed.Eubac.3和硝化螺菌屬，P<0.05)。在春、夏、秋季中益生菌均與環境因子呈正相關性，有害菌中除腸桿菌屬與環境因子呈正相關性外，其它3種均與環境因子呈負相關性，且與主要環境因子顯著負相關(P<0.05)。益生菌與夏季距離最短，與春季距離最長，表明夏季益生菌豐度較高，春季最低；總體上有害菌與春季距離最小，即春季有害菌豐度最高。

表3 塘泥中功能微生物比例季節變化

圖3 塘泥微生物群落多樣性與環境因子RDA分析Fig.3 Redundancy analysis (RDA) of seasonal variations of the microbial community diversity index with environmental factors

3 討論與結論

塘泥中營養物質主要來自沉積和化能自養生物合成，而在養殖池塘中投飼殘餌、水產品排泄物和生物體沉積更為顯著，這是導致池塘塘泥營養物質不斷增加的主要原因[20-21]。試驗中，春夏季期間營養物質劇增，而夏秋季變化不顯著，這可能是因為春夏期間氣溫低且變化幅度大，魚攝食不積極且塘泥微生物和相關分解酶活性相對較低，導致殘餌大量沉積，而夏秋期間則氣溫較高，魚攝食積極且微生物和相關酶活性較高，使得沉積物變化不顯著。水體有機質分解會大量消耗塘泥間隙和底層水的溶解氧，致使塘泥和底層水轉變為厭氧的還原環境，在這種條件下有機質分解往往產生有機酸和無機酸，導致塘泥酸化，pH降低[13]。故而在養殖過程中，養殖戶常向池塘投放生石灰以調節酸堿度。張金宗等[22]在研究廣東增城的池塘發現塘泥厚度以年均10～15 cm速度升高，這部分新增的淤泥含大量養殖殘餌、營養成分豐富，可在清塘過程中將此收集、曬(烘)干并加工成有機肥料[23]。

塘泥營養物質的變化受微生物及其分泌酶的影響，而微生物群落結構也受到營養物質在內的環境因子的作用，通常微生物生長對養分的需要求始終趨向于較高的C、N、P含量[24]。這與試驗中Shannon、Chao、Observed species等多樣性指數均隨塘泥有機質含量增大而升高現象相符。進一步分析發現環境因子中SOM、TP和AP對塘泥微生物群落多樣性綜合影響達到顯著，即在紫色土池塘中SOM、TP和AP是塘泥微生物群落多樣性的主要環境影響因子。試驗中培養的微生物密度逐季下降，即好氧或兼性微生物在塘泥中漸漸消亡，這表征出塘泥間隙和底層水環境中氧氣越來越低。所以在養殖過程中需注意天氣變化導致水層對流，避免底層水上升導致魚缺氧或中毒。主要及功能微生物屬與環境因子冗余分析發現，塘泥微生物群落差異表現為春季與夏、秋季間明顯，而夏、秋季間趨小，環境因子差異表現類似差異，這充分說明環境因子是微生物群落的影響因素，不同環境下相同微生物種群的豐度可能不同。本試驗表明溫度、pH和AP是影響塘泥主要微生物類群和功能微生物的主要因素，但這并不意味該4種環境因子一定是影響所有微生物的主要因素，同時其它環境因子仍然可能是影響某些微生物的主要因素[25]。從圖4可知，其它4種非主要環境因子與數種微生物屬之間的相關性同樣顯著。

圖4 塘泥微生物與環境因子的RDA分析Fig.4 Redundancy analysis (RDA) of pond mud microbial communities with environmental factors

研究[26-27]表明，硝化螺菌、亞硝化單胞菌和硝化螺旋菌等在底泥中仍可進行硝化作用，將氮素轉化為易溶解和利用的NO3-N。試驗中，硝化細菌與塘泥中TN含量變化趨勢一致，可能是與含氮有機物含量升高引起硝化細菌大量繁殖并將其氧化分解有關，這有利于池塘底泥的修復和緩沖能力的增強。放線菌在漁業養殖系統中可以起到一定的抑制致病微生物滋生和改善水質的功能[28-29]。黃桿菌屬包括多種魚類致病細菌，其中柱狀黃桿菌可使幾乎所有淡水魚類感染柱形病[30]，病魚將呈現爛鰓、體表潰瘍、組織壞死及鰭條腐爛等癥狀，致死率幾乎達100 %，具有極高危害性。陳霞等[31]還指出柱狀黃桿菌易致病溫度溫度為25～30 ℃，幾乎完全覆蓋試驗過程中塘泥溫度區間，這提示紫色土池塘養殖過程中應加強柱狀黃桿菌潛在致病管理。陰溝腸桿菌和阪崎腸桿菌是腸桿菌屬中常見的魚類致病菌，研究指出[32-33]該 2 種微生物也是人畜的致病原，可導致多種嚴重疾病，故而需對其進行嚴格管理，避免感染人畜。氣單胞菌屬隸屬于弧菌科，含多種可感染水產品的病原微生物，其中嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌等危害尤為顯著，可單獨或混合造成草魚腸炎、鰱打印病、鰱白皮病、草魚爛鰓、鰱出血感染及甲魚敗血癥等疾病，在預防和治療過程中應注意精確診斷，聯合使用預防治療藥物[34]。銅綠假單胞菌和惡臭假單胞菌是假單胞菌屬在環境中常見的致病微生物，常造成赤皮病和爛鰓病，而沈錦玉等[35]研究指出惡臭假單胞菌還可造成網箱養殖大黃魚脾、腎臟出現大量白色結節而大面積死亡。以上對塘泥中功能微生物的分析表明，塘泥微生物既是塘泥生態修復功能菌庫，也是養殖水產品病原庫。試驗中春季塘泥益生菌豐度最低且有害菌豐度最高，所以在利用紫色土建造池塘進行養殖時應做好春季疾病預防工作。