轉錄調控因子Lmo2672對LM環境適應性和應激的調控作用

李 杰，張星星，孟慶玲，喬 軍*，李 妍，王曉婷，李 靜，才學鵬

(1.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832003；2.新疆農墾科學院省部共建綿羊遺傳改良與健康養殖國家重點實驗室，新疆 石河子 832000；3.中國農業科學院蘭州獸醫研究所，甘肅 蘭州 730046)

【研究意義】單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)是一種重要的食源性病原菌之一，廣泛分布于自然界，能在外界環境中長期存活[1]。人類通過食用被感染的食物經消化道感染機體，引起感染者發生敗血癥、腦膜炎、胃腸炎、流產等嚴重疾?。幻庖吣芰Φ拖抡吒腥竞笏劳雎瘦^高[2-3]。LM能在0.4 ～ 45 ℃、pH值2.5、滲透壓高、20 % NaCl和0.025 %過氧化氫等極端環境中生長和生存[1,4-5]，是動物源性食品生產加工過程中的常見污染菌，對食品安全構成了嚴重的威脅。【前人研究進展】為了適應不同環境，LM轉錄調控因子可通過調控相關基因的表達從而改變其環境適應能力[8-9]。目前，已在LM中鑒定出多種環境調控因子，其中prfA和sigB在環境應激反應中扮演重要角色，它們通過調節抗性基因的轉錄使LM適應各種不利環境[6-9]。此外，HrcA和CtsR也參與應激反應基因的調控[10-12]；SOS作為修復受損DNA的一種機制，而RecA和LexA分別控制SOS反應的激活和抑制，也參與了對環境脅迫的適應性[16-17]，有研究發現，AraC家族是存在于革蘭氏陽性和革蘭氏陰性菌中的一種轉錄因子，對細菌一些基因的轉錄具有調控作用，參與細菌毒力的調控及抵抗不良應激環境[6,15]。該家族中的螺旋-旋轉-螺旋(HTH) DNA結合結構域可與基因的啟動子結合，激活基因轉錄從而發揮調控作用[16-17]。前期的生物信息學分析表明，lmo2672屬于AraC家族成員，然而目前LMlmo2672具體的生物學功能尚不清楚?！颈狙芯壳腥朦c】本研究利用構建的lmo2672基因缺失株，比較LM EGD-e與LM-Δlmo2672在不同應激環境中環境適應能力，通過qRT-PCR分析了應激調節因子(prfA、sigB、ctsR、hrcA、lexA、recA)和氧化應激相關基因(fri、kat、perR、sod)轉錄水平的變化，探討了lmo2672對LM氧化環境中的調控作用。【擬解決的關鍵問題】為進一步揭示AraC家族轉錄調節因子Lmo2672在LM中的作用機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

LM EGD-e菌株由德國伍茲堡大學W. Goebel惠贈；pKSV7由本實驗室保存；pMD19-T載體、T4連接酶、限制性酶切酶KpnI和PstI購自TaKaRa公司，基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒及質粒小提試劑盒購自TIANGEN生物有限公司，氯霉素、膽汁酸鹽購自Sigma公司，氯化鈉購自天津盛奧生物試劑公司，腦心浸出液(BHI)購自青島海博生物科技有限公司。

1.2 引物

根據GenBank發表的LM標準株(LM EGD-e)基因組序列(登錄號：AL591824.1)，應用Primer 5.0軟件設計LM缺失株的構建、鑒定及qRT-PCR相關引物，其中R1和R4引物的5’端分別引入酶切位點KpnI和PstI (斜體下劃線部分)，引物均由北京華大基因公司合成 (表1)。

表1 本研究中所用引物

續表1 Continued table 1

1.3 LM-Δlmo2672缺失株的構建與鑒定

采用基因組DNA提取試劑盒提取LM EGD-e菌株的基因組DNA，以DNA為模板，利用引物R1/R2、R3/R4分別擴增lmo2672基因的上、下游同源臂，將獲得的PCR產物經1 %瓊脂糖凝膠進行電泳，根據膠回收試劑盒的操作步驟進行回收，將上、下游臂的膠回收產物進行融合，獲得缺失目的基因的融合片段。將其與溫控質粒pKSV7進行16 ℃過夜連接，構建重組穿梭質粒pKSV7-Δlmo2672。將pKSV7-Δlmo2672電轉至LM感受態細胞中，在氯霉素和42 ℃雙重抗性下進行同源重組獲得缺失株，對獲得的LM-Δlmo2672缺失株用旁外側引物R5/R6檢測并測序進行鑒定。同時將LM-Δlmo2672缺失株在無氯霉素抗性，37 ℃繼續培養20代并用R5/R6進行PCR檢測其遺傳穩定性。

1.4 lmo2672基因缺失對LM在不同應激環境中適應能力的影響

分別挑取LM EGD-e和LM-Δlmo2672單菌落過夜培養，調整菌液OD600約為0.4，分別接種于新鮮BHI培養基放置于不同溫度(37、42 ℃)，或者分別在37 ℃接種于含5 % NaCl、0.3 %膽酸鹽、5 mM H2O2、1 % Triton X-100的BHI培養基中培養。每株菌設置3個平行，每2 h測定其OD600 nm以代表菌株生長情況，繪制生長曲線比較LM EGD-e和LM-Δlmo2672生長曲線。

1.5 RNA的提取及cDNA的合成

將待測菌株在37 ℃，180 r/min過夜振蕩培養，離心收集菌體，用含5 mM H2O2BHI調整菌液OD600至0.6，并放置37 ℃暴露于H2O2環境中30 min；離心收集菌體，用液氮研磨至粉狀；根據Trizol法的操作分別提取LM EGD-e和LM-Δlmo2672細菌總RNA；使用Nanodrop 2000測量RNA濃度，并通過260/280和230/260 nm的比值以評估RNA是否被蛋白質和有機物污染。同時利用兩步法反轉錄試劑盒說明書將RNA進行逆轉錄，得到終體積為20 μl的cDNA；并用Nanodrop 2000分光光度計測定cDNA濃度。

1.6 相關基因轉錄水平的qRT-PCR分析

以統一濃度的cDNA為模板，以管家基因rpoB作為內參，在LightCycler 480儀器上進行qRT-PCR，反應采用SYBR Green Ⅰ Master mix和1.0 μM濃度的引物進行。測定6個環境應激調控相關基因(prfA、sigB、ctsR、hrcA、lexA、recA)和4個氧化應激相關基因(perR、kat、sod、fri)的轉錄水平，結果根據2-ΔΔCT的方法計算各個基因的相對轉錄水平。本試驗進行3次獨立重復，結果以“平均值±標準誤”表示。

1.7 數據統計分析

所有試驗均重復3次，采用GraphPad Prism 5.0進行組間差異顯著性分析，數據采用平均值±標準誤。P<0.05被認為差異顯著，P<0.01被認為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 LM-Δlmo2672的構建、鑒定及遺傳穩定性分析

利用R5/R6引物篩選擴增出1502 bp條帶的重組菌株(圖1)；同時進行測序，測序結果進一步證明成功構建LM-Δlmo2672缺失株。在37 ℃、無氯霉素抗性的培養基中繼續傳20代，R5/R6引物檢測均可擴增出1502 bp單一片段(圖2)，表明LM-Δlmo2672具有良好的遺傳穩定性。

2.2 lmo2672基因缺失對LM環境適應能力的影響

在37和42 ℃條件下，在37 ℃更適應LM菌生長，且2株菌的生長趨勢相同，在細菌對數生長期中， LM-Δlmo2672的生長顯著慢于LM EGD-e(P< 0.05，圖3-A、圖3-B)；在含5 % NaCl培養基中，0～6 h LM EGD-e和LM-Δlmo2672幾乎不生長，在6 h之后LM-Δlmo2672生長速度顯著低于LM EGD-e(P<0.05，圖3-C)。在1 % Triton X-100 BHI中, 與LM EGD-e相比，LM-Δlmo2672在6～12 h內生長差異顯著(P<0.05，圖3-D)；在含0.3 %的膽酸鹽培養基中培養8 h以后，2株菌生長情況差異顯著(P<0.01，圖3-E)；在含5 mM H2O2BHI培養基中LM-Δlmo2672不生長，極顯著低于親本株LM EGD-e(P<0.01，圖3-F)，表明lmo2672缺失降低了LM的環境適應能力。

M：DNA Marker DL-2000；1：LM EGD-e；2～3：LM-Δlmo2672重組菌；4：陰性對照;5.LM EGD-e圖1 LM-Δlmo2672重組菌的鑒定Fig.1 Identification of recombinant LM-Δlmo2672

2.3 環境應激調控基因及氧化應激相關基因轉錄水平的測定

在H2O2環境中暴露30 min后進行轉錄水平分析，結果發現，與LM EGD-e相比，LM-Δlmo2672中recA和fri基因的轉錄水平顯著升高(P<0.05)，表明在氧化環境中lmo2672缺失能誘導recA和fri基因的轉錄水平；除recA和fri基因外，其余基因的表達量均出現不同程度的降低，其中prfA，lexA，fri，perR，kat，sod差異顯著(P<0.05，圖4)，表明lmo2672對LM環境應激和氧化應激相關基因的轉錄水平有影響。

M：DNA Marker DL-2000；1～3：LM-Δlmo2672重組菌；4：陰性對照；5：LM EGD-e圖2 LM-Δlmo2672重組菌遺傳穩定性的檢測Fig.2 Analysis of genetic stability of LM-Δlmo2672

3 討 論

LM具有極強的環境適應能力，能夠在食品加工、貯藏、運輸等應激環境條件生存[18-19]。為了適應不同的應激環境，LM依靠眾多的調控因子進行轉錄調控。在大腸桿菌中研究發現，AraC家族蛋白在細菌應激反應中發揮了調控作用。AraC家族轉錄調控因子Rob通過上調micF使大腸桿菌對膽汁酸產生耐受[20-21]；Pletzer等人發現AraC家族轉錄調控因子OpiA過表達時對大腸桿菌在pH和高滲透壓環境的耐受性顯著增加[17]。然而，目前LMAraC家族成員Lmo2672的生物學作用至今尚不清楚。本研究利用同源重組技術構建LM-Δlmo2672缺失株，測定在不同應激環境中LM EGD-e和LM-Δlmo2672的生長情況。結果發現LM-Δlmo2672在37 ℃、42 ℃、5 % NaCl、0.3 %膽酸鹽、5 mM H2O2及1 % Triton X-100的培養基中生長顯著低于LM EGD-e，提示AraC家族Lmo2672在LM環境適應和應激過程中發揮了調控作用。

A～F：分別為42 ℃，37 ℃，5% NaCl，1 % TrionX-100，0.3 %膽酸鹽，5 mM H2O2環境中的生長情況圖3 不同應激環境對LM EGD-e和LM-Δlmo2672生長曲線的影響Fig.3 Growth curves of LM EGD-e and the LM-Δlmo2672 deletion mutant strains at different environmental stresses

圖4 氧化應激環境下LM EGD-e和LM-Δlmo2672壓力調控相關基因及氧化應激相關基因轉錄水平分析Fig.4 Relative transcriptional levels of the genes related to stress regulator and oxidative stress response in the LM EGD-e and LM-Δlmo2672 under the oxidative stress

在外界環境中，LM常暴露于氧化應激中，為了防止氧化應激引起的損傷，細菌自身的防御系統可通過啟動相關的抗氧化機制來抵御ROS[22-23]。清除活性氧組分的超氧化物歧化酶(sod)將高活性的超氧化物轉化為過氧化氫，過氧化氫又被過氧化氫酶(kat)轉化為水和氧[24]；fri編碼類鐵蛋白Dps，據報道Dps在保護細胞抵御ROS時有雙重作用，它可以直接與DNA結合調控應激相關基因的表達，以保護細菌免受H2O2的傷害[25]。研究表明，在不同的環境應激(例如熱應激、冷應激、膽酸鹽應激)中均可誘導fri基因的表達[26-28]。本研究發現，在氧化應激作用下，fri基因的轉錄水平發生明顯改變，表明該基因參與了抵御氧脅迫的作用。有研究表明，外源性ROS造成的DNA損傷會誘導recA基因的表達啟動SOS反應機制以適應氧脅迫環境[26-28]。本研究中發現，lmo2672基因缺失后，recA基因轉錄水平顯著增強，推測可能是通過recA基因的高表達來啟動SOS反應，從而維持其生存，提示lmo2672可通過調控recA基因的表達以抵抗環境應激。

4 結 論

總之，本研究通過構建LM AraC家族lmo2672基因缺失株，證實了LM-Δlmo2672缺失株通過調控環境應激相關基因的表達，顯著降低抵抗環境應激的能力，尤其在氧化應激環境中，LM-Δlmo2672缺失株fri及recA基因被誘導高表達，表明lmo2672基因在適應氧化應激環境中發揮了重要的調控作用，為進一步探究LMlmo2672調控應激環境的分子機制奠定基礎。