云南小麥品種(系)抗逆性相關基因的KASP標記檢測

王志偉，喬祥梅，王志龍，楊金華，程加省，程 耿，于亞雄

(云南省農業科學院糧食作物研究所/國家小麥改良中心云南分中心，云南 昆明 650200)

【研究意義】小麥是我國的三大主要口糧作物之一，其產量高低直接關系著國家的糧食安全。干旱是限制小麥生產的最主要非生物因素之一，對產量和品質的形成有著嚴重影響[1-2]。穗發芽(Pre-harvest sprouting，PHS)是一種影響小麥生產的外界環境脅迫災害，不僅造成小麥籽粒產量和利用價值降低，而且對品質有嚴重劣化作用[3-4]，常對小麥生產造成嚴重經濟損失。選育和推廣抗逆小麥品種是保障國家糧食安全、促進小麥生產持續穩定發展的有效途徑之一。明確云南小麥抗旱和抗穗發芽等抗逆性狀相關功能基因的組成分布，對今后云南小麥抗逆育種具有重要意義。【前人研究進展】小麥的抗旱性是一個復雜的生物學性狀，是多個因素共同作用的結果，由多基因共同決定[5-6,8,11-12]。DREB(Dehydration responsive element binding)是植物應答干旱、高鹽、高溫和低溫等非生物逆境的一類重要的轉錄因子[7]。Shen等[8]研究發現，小麥轉錄因子基因TaDREB1應答低溫、干旱和ABA脅迫。Wang等[9]研究發現，DREB轉基因小麥的抗旱性明顯增強，脯氨酸含量是對照品種的2倍。Wei等[10]克隆了小麥TaDREB1基因，并將其定位于3B染色體上，位于標記Xmwg818和Xfbb117之間。果聚糖外切水解酶1-FEHw3基因在極端干旱條件下對小麥中水溶性碳水化合物的再活化起著關鍵作用，在1-FEHw3基因啟動子區域的生長素響應元件中發現SNP，推測1-FEHw3基因的Westonia等位基因型可能影響基因表達和酶活性水平，開發了該基因的CAP標記；在2年干旱條件下驗證，Westonia等位基因型與較高的千粒重相關，為抗旱有利等位基因型[11]。細胞壁轉化酶(CWI)是3種轉化酶之一，對植物生長發育至關重要。小麥細胞壁轉化酶基因TaCWI-4A位于染色體4A上，在TaCWI-4A的啟動子區域中檢測到2個SNP，TaCWI-4A基因的Hap-4A-C單倍型為抗旱有利基因型，在雨養生產地區表現為多穗粒數，而TaCWI-4A基因的Hap-4A-T單倍型為非抗旱有利基因型，在灌溉條件良好地區表現為高千粒重[12]。小麥穗發芽屬于數量性狀，受多基因控制，其抗性能力主要受種子休眠性、α-淀粉酶活性、種皮顏色和穎殼抑制物等因素影響，其中休眠性與其抗性能力呈顯著相關[13]。Vp-1基因位于小麥第3同源群染色體的長臂上[14]，是小麥種子成熟、干燥及休眠的主要轉錄調節因子，既能促進胚成熟，又可加速休眠并抑制其萌發[15]。Yang等[16]研究發現，Vp-1基因的Vp-1B等位變異與穗發芽抗性相關，在3BL上開發出Vp-1B等位變異的STS標記Vp-1B3，可對不同穗發芽抗性的小麥品種基因型進行有效區分。TaSDR-B1基因對小麥穗發芽抗性起到重要調控作用，定位于小麥2BS染色體著絲點附近，有1個SNP(A/G)存在于其起始密碼子上游位點，其A類型命名為TaSDR-B1a，G類型命名為TaSDR-B1B；進一步研究發現TaSDR-B1a基因型發芽指數(GI值)顯著低于TaSDR-B1B基因型[17]。TaPHS1基因是MFT-like基因，來源于白粒小麥Rio Blanco，位于小麥3AS 染色體上，發現在TaPHS1基因中存在2個SNP引起的突變，可通過調控小麥成熟期的籽粒休眠對小麥穗發芽抗性起正向調節作用[18]。【本研究切入點】KASP(Kompetitive allele specific PCR)技術具有穩定性高、準確性高和成本低的特點，目前已經在高通量SNP分型以及InDels檢測上被廣泛應用[19-22]。Rasheed等[20]基于已克隆基因的序列，利用KASP技術開發了小麥抗旱性和穗發芽抗性相關功能基因的KASP標記，可用于TaDreb-B1、1-fehw3、TaCwi-4A、TaPHS1、TaSdr-B1和TaVp-1B等功能基因的快速準確檢測。【擬解決的關鍵問題】利用 3個抗旱性相關基因的KASP標記TaDreb_SNP、fehw3_SNP、CWI4A_SNP和3個穗發芽抗性相關基因的KASP標記PHS_646、SDR_SNP、Vp1b1-83_IND，對42份云南育成的小麥品種(系)進行抗旱和抗穗發芽等抗逆性狀相關基因單倍型檢測鑒定，旨在了解云南小麥品種(系)中抗逆性狀相關基因的組成分布狀況，篩選出含有目標基因的優異小麥種質，為云南小麥抗逆育種提供材料和方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

研究所用材料為云南省內相關育種單位選育的42份云南育成小麥品種和育成高代品系，品種信息見表2。

1.2 DNA提取

每份試驗材料取8～10粒種子置于培養皿室溫下培養，萌發7 d后取幼苗葉片，采用CTAB法[23]提取基因組DNA。

1.3 KASP標記檢測

供試材料的KASP標記檢測工作委托中國農業科學院作物科學研究所何中虎研究員課題組進行。試驗所用抗旱性和穗發芽抗性相關功能基因的6組KASP標記引物來源于Rasheed等[20]設計，引物序列詳見表1。PCR反應體系為10 μl，包括4.78 μl DNA (5～50 ng/μl)，5 μl KASP MasterMix(LGC公司，英國)，0.14 μl KASP Assay Mix，0.08 μl Mg+。KASP Assay Mix是由3條引物的稀釋獲得，按FAM-引物(100 μmol/L)∶HEX-引物(100 μmol/L)∶通用引物(100 μmol/L)∶ddH2O=12∶12∶30∶46混合而成[19]。采用降落PCR進行擴增，反應程序：95 ℃熱處理15 min；95 ℃變性20 s，65～55 ℃退火和延伸25 s，10個降落循環(每循環降低1.0 ℃)；95 ℃變性10 s，57 ℃退火和延伸1 min，30個循環；4 ℃避光保存[19]。PCR反應在Bio-Rad CFX96 PCR儀上(Bio-Rad，美國)上進行。每次反應設置4個空白對照組，其DNA模板用ddH2O代替。擴增結束后進行熒光掃描，并做基因分型分析。

2 結果與分析

2.1 供試小麥品種(系)抗旱性相關基因的KASP標記檢測

TaDreb-B1基因分型結果(表2、圖1-a)發現，云麥42等有23份品種(系)為TaDreb-B1基因的TaDREB-B1a耐旱單倍型，頻率為54.76 %；云麥39等19份品種(系)為TaDreb-B1基因的TaDREB-B1B水分敏感單倍型，頻率為45.24 %。1-fehw3基因分型結果發現，云麥39等24份品種(系)為1-fehw3基因的Westoniatype抗旱單倍型，頻率為57.14 %；云麥53等17份品種(系)為1-fehw3基因的Kauztype非抗旱單倍型，頻率為40.48 %。TaCwi-4A基因分型結果發現，云麥39等35份品種(系)為TaCwi-4A基因的Hap-4A-C抗旱單倍型，頻率為83.33 %；云麥73等7份品種(系)為TaCwi-4A基因的Hap-4A-T非抗旱單倍型，頻率為16.67 %。

2.2 供試小麥品種(系)穗發芽抗性相關基因的KASP標記檢測

TaPHS_646基因分型結果(表2、圖1-b)發現，云麥39等35份品種(系)為TaPHS_646基因的RioBlanceotype抗穗發芽單倍型，頻率為83.33 %；云麥69等4份品種(系)為TaPHS_646基因的NW97S186type感穗發芽單倍型，頻率為9.52 %。TaSdr-B1基因分型結果發現，云麥76等17份品種(系)為TaSdr-B1基因的TaSdr-B1a抗穗發芽單倍型，頻率為40.48 %；云麥39等24份品種(系)為TaSdr-B1基因的TaSdr-B1B感穗發芽單倍型，頻率為57.14 %。TaVp-1B基因分型結果發現，云麥39等29份品種(系)為TaVp-1B基因的Vp1B1c抗穗發芽單倍型，頻率為69.05 %；云麥73等7份品種(系)為TaVp-1B基因的Vp1B1a感穗發芽單倍型，頻率為16.67 %。

2.3 供試小麥品種(系)抗旱性和穗發芽抗性相關基因的分布

如表2所示，聚合3個抗旱性相關基因抗性單倍型(TaDREB-B1a/Westoniatype/Hap-4A-C)的小麥品種(系)有11份，分別是云麥42、云麥62、云麥68、云麥76、云15D4-15、云154-65、宜麥2號、保麥2號、靖麥12、靖麥14、楚麥16號，頻率為26.19 %；聚合3個穗發芽抗性相關基因抗性單倍型(RioBlanceotype/TaSdr-B1a/Vp1B1c)的小麥品種(系)有10份，分別是云麥52、云麥76、云麥77、云麥78、云16D4-13、云6-14、云124-6、彌12V4-15、易122-329、保麥2號，頻率為23.81 %；同時聚合抗旱性和穗發芽抗性相關基因6個有利單倍型(TaDREB-B1a/Westoniatype/Hap-4A-C/RioBlanceotype/TaSdr-B1a/Vp1B1c)的小麥品種(系)僅有云麥76和保麥2號2份品種，頻率為4.76 %。

表2 42份云南小麥抗旱性和穗發芽抗性的KASP標記基因分型

續表2 Continued table 2

圖1 42份云南小麥中抗旱性和穗發芽抗性相關基因的分布頻率Fig.1 Frequency of genes associated with drought tolerance and PHS resistance in 42 wheat cultivars

3 討 論

與傳統SNP檢測平臺相比，高通量的KASP檢測方法具有穩定性高、準確性高和低成本的特點[19]。Rasheed等[20]利用這一簡便高效的技術，開發了70余個高通量KASP功能標記，可對小麥產量、品質、抗性和適應性等相關基因進行有效鑒定。鄒景偉等[24]、張維軍等[25]、楊子博等[26]、張宏軍等[27]分別利用KASP功能標記對不同類型小麥品種的不同性狀相關基因進行了檢測分析，發現KASP標記輔助選擇能顯著地提高小麥育種效率。本研究利用KASP標記結合序列測定準確、快速地鑒定出云南小麥品種(系)的抗旱和抗穗發芽等抗逆性相關基因型，為云南小麥抗逆育種提供了材料和方法。

抗旱性和穗發芽抗性改良是小麥抗逆育種的重要育種目標，但小麥抗旱性、穗發芽抗性均屬于多基因控制的數量性狀，其抗性機理十分復雜[28]。云南小麥2/3以上種植于貧瘠山區旱地，受典型立體氣候影響，生長階段頻發冬春季節性干旱，麥收季節受雨季影響易受穗發芽損害，因此抗旱、抗穗發芽等抗逆性狀一直是云南小麥育種的關鍵選育目標，而明確云南育成小麥品種(系)中抗旱、抗穗發芽相關基因的組成分布，有助于今后云南小麥抗逆育種工作的開展。利用TaDreb_SNP標記、fehw3_SNP標記、CWI4A_SNP標記對42份供試品種(系)抗旱性相關基因型進行檢測，篩選出含TaDreb-B1基因TaDREB-B1a耐旱單倍型的品種(系)23份、1-fehw3基因Westoniatype抗旱單倍型的品種(系)24份、TaCwi-4A基因Hap-4A-C抗旱單倍型的品種(系)35份，頻率分別為54.76 %、57.14 %、83.33 %，研究結果表明云南小麥的總體抗旱性水平較高。

小麥穗發芽抗性相關基因多于種皮色澤、種子休眠、內源激素調控、α-淀粉酶活性等特性有關，僅有少數相關基因位點的遺傳效應較大[24-25，29]。利用PHS_646標記、SDR_SNP標記、Vp1b1-83_IND標記對42份供試品種(系)抗穗發芽相關基因型進行檢測，篩選出含TaVp-1B基因的Vp1B1c抗穗發芽單倍型的品種(系)29份，頻率為69.05 %，接近于中國推廣小麥品種抗穗發芽的平均頻率71.7 %[29]，但低于四川小麥品種抗穗發芽的平均頻率83.8 %[30]；篩選出含TaPHS_646基因RioBlanceotype抗穗發芽單倍型的品種(系)35份，頻率為83.33 %，與鄒景偉等[24]研究結果一致；篩選出含TaSdr-B1基因的TaSdr-B1a抗穗發芽單倍型的品種(系)17份，頻率為40.48 %。研究結果顯示云南小麥的總體穗發芽抗性水平較高。

從多基因聚合角度分析，11份品種(系)為3個抗旱基因TaDREB-B1a/Westoniatype/Hap-4A-C抗旱性單倍型組合，頻率為26.19 %；10份品種(系)為3個抗穗發芽基因RioBlanceotype/TaSdr-B1a/Vp1B1c穗發芽抗性單倍型組合，頻率為23.81 %；僅有云麥76和保麥2號聚合抗旱性和穗發芽抗性相關基因，為TaDREB-B1a/Westoniatype/Hap-4A-C/RioBlanceotype/TaSdr-B1a/Vp1B1c抗性單倍型組合，頻率為4.76 %。上述品種可直接在今后抗旱性和抗穗發芽的聚合育種中作親本利用，是云南小麥抗逆育種和品質改良的捷徑。對比品種的實際抗旱性、穗發芽抗性與基因檢測結果，發現部分品種存在不吻合的情況，如云麥54、云麥69和云麥72是云南省審定的典型旱地小麥品種，但檢測為TaDREB-B1b/Kauztype非抗旱單倍型；檢測為NW97S186type感穗發芽單倍型的鳳麥32和鳳麥36屬于穗發芽抗性品種，檢測為RioBlanceotype/Vp1B1c抗穗發芽單倍型的鳳麥34屬于感穗發芽品種，且穗發芽率大于98 %[31]。上述結果充分說明抗旱性和穗發芽抗性等抗逆性狀均是由多基因位點控制的數量性狀，品種實際抗逆性水平是多個基因調控的綜合作用結果，品種抗逆性需兼顧表型和基因性進行綜合評價，同時需大力發掘更多相關基因位點的功能，才能實現更好地在抗逆分子標記輔助育種中加以應用。

4 結 論

42份供試云南小麥品種(系)在抗旱性和穗發芽抗性等抗逆性狀相關基因組成上具有豐富的多態性，在云南小麥抗逆育種中加大TaDreb-B1、1-feh-w3、TaCwi-4A、TaPHS1、TaSdr-B1、TaVp-1B等基因有利單倍型的聚合利用，可有效的綜合提高云南小麥抗逆性。