不同遺傳背景甜糯雙隱性玉米種質的SSR鑒定

宋俏姮，孔亮亮，劉俊峰，楊躍華，張 垚，高必軍

(四川省農業科學院水稻高粱研究所，四川 德陽 618000)

【研究意義】甜加糯型玉米是滿足不同地區和不同人群對鮮食玉米品質更高消費需求的新類型，綜合了甜玉米和糯玉米優點，入口“既甜又糯”，風味營養口感更佳，近些年已成為鮮食玉米選育的一個新方向[1-3]。在選育甜糯雙隱性玉米自交系的基礎上，通過與單或多隱性純合體雜交組配，即可獲得甜(雜結合)糯(純結合)的玉米雜交種，播種后收獲的果穗即為甜加糯型玉米[4]。因此，甜糯雙隱性玉米自交系是配制甜加糯型玉米的必備中間材料。【前人研究進展】從遺傳連鎖關系上分析，甜質基因與糯質基因可轉育到同一自交系中，獲得甜糯雙隱性純合體[5]。甜質基因在糖分累積和淀粉總量上具有隱性上位作用，甜糯雙隱性純合體的籽粒表現為甜質，外觀和口感與甜玉米類似，僅憑肉眼觀察和品嘗難以準確判斷[5-7]。常規甜、糯玉米雜交組配F1選擇分離比例為4/16的甜粒鑒定基因型，其中有1/16的甜糯雙隱性籽粒(sh2sh2wxwx)；F1選擇分離比例為3/16的糯粒繼續播種自交，其中2/3的果穗分離出3/4糯粒(Sh2-wxwx)，1/4表型為甜質的雙隱性籽粒(sh2sh2wxwx)[4，8]，但F1挑選糯粒時易出現誤選，影響創制準確性。甜、糯玉米染色體雜交手段可控性差、變異大[9]，需鑒定分離后代的基因型。SSR分子標記鑒定法利用與目標基因(waxy)緊密連鎖的遺傳標記對特定性狀(糯性)基因型進行選擇，可在后代群體中直接篩選出含有目標基因(waxy)的甜糯雙隱性純合體(sh2sh2wxwx)[10]。李新海等報道了與糯質基因(waxy)緊密連鎖的3對SSR引物(phi022、phi027、phi061)[11]。楊耀迥等基于SSR分子標記技術，篩選出的9株甜糯雙隱性玉米單株經過4代連續自交，得到穩定的甜糯雙隱性玉米自交系[12]。【本研究切入點】目前尚未見針對不同遺傳背景獲得的甜糯雙隱性玉米種質進行SSR鑒定的報道，亟需探索一種方便準確的甜糯雙隱性玉米種質鑒定體系，以簡化育種程序，降低育種成本。【擬解決的關鍵問題】本研究利用與糯質基因(waxy)緊密連鎖的3對SSR引物，將分子標記鑒定技術應用于3種不同遺傳背景獲得的甜糯雙隱性玉米材料的篩選中，旨在對比分析不同創制方法的準確性和效果，解決選育甜糯雙隱性玉米自交系的技術瓶頸，為甜糯雙隱系的選擇提供更加簡便、高效的方法，提高育種效率和育種的預見性。

1 材料與方法

1.1 材料

供試玉米材料為YH03-01×HJ03-34，對照(CK)材料為H00-1。糯玉米自交系YH03-01、H00-1和超甜玉米自交系HJ03-34均為四川省農業科學院水稻高粱研究所自育。

1.2 方法

1.2.1 材料組配 常規甜、糯玉米雜交組配。選取優良糯玉米自交系YH03-01與優質超甜玉米自交系HJ03-34雜交，雜交組合YH03-01×HJ03-34自交授粉1代，在果穗上選擇表型為甜質的籽粒，種植于四川省農業科學院水稻高粱研究所試驗地，獲得84份供試材料；同時，在果穗上選擇表型為糯質的籽粒，繼續播種自交1代，從收獲的果穗上挑取甜質籽粒種植于四川省農業科學院水稻高粱研究所試驗地，獲得186份供試材料。

甜、糯玉米染色體雜交。親本糯玉米自交系YH03-01和超甜玉米自交系HJ03-34由四川省農業科學院水稻高粱研究所提供，甜、糯玉米染色體雜交過程由深圳市百綠生物染色體雜交研究所完成，獲得84份供試材料。

1.2.2 DNA提取 在供試材料幼苗期(4～6葉)剪取嫩葉，以優良糯玉米自交系H00-1的葉片作為對照(CK)，放入取樣袋并編號，迅速帶回實驗室。采用改良CTAB法提取玉米葉片總DNA。將新鮮葉片在液氮中速凍，研磨成粉末，轉入2 mL離心管中。加入65 ℃預熱的500 μl CTAB抽提液，使用前在CTAB中加入0.2 % β-巰基乙醇，輕輕混勻，在65 ℃水浴中溫浴30～60 min，期間每隔10 min顛倒混勻。加入500 μl的氯仿：異戊醇(24∶1)，輕輕充分混勻，10 000 r/min離心10 min。取上清至新的1.5 mL離心管中，加入與上清等體積的異丙醇，混勻，-20 ℃靜置30 min，沉淀DNA。10 000 r/min離心10 min，棄廢液。用600 μl 70 %乙醇漂洗兩次，10 000 r/min離心2 min，室溫下干燥，根據DNA含量用超純水溶解。用1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA濃度和質量，并將DNA樣品濃度稀釋至50 ng/μl，-20 ℃保存備用。

1.2.3 SSR引物的選擇與確定 采用李新海等[11]報道的與糯玉米隱性基因(waxy)緊密連鎖的3對SSR標記引物：phi022、phi027、phi061。在MaizeGDB上搜索其引物序列，由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成。用優良糯玉米自交系YH03-01(母本)驗證是否能成功標記，標記成功的引物用于后續PCR擴增。

1.2.4 PCR擴增 PCR反應在美國Applied Biosystems公司生產的GeneAmp-9700 PCR儀上進行。PCR反應體系為20 μl：其中包括2.5 U/μlTaqDNA聚合酶0.25 μl，10×TaqBuffer 2.00 μl，25 mM MgCl22.00 μl，2.5 mM dNTP
1.50 μl，5 μM SSR引物2.00 μl，50 ng/μl DNA模板1.50 μl，ddH2O 10.75 μl。PCR反應程序為：94 ℃預變性3 min，1個循環；94 ℃變性30 s，56 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環；72 ℃終延伸5 min。

1.2.5 聚丙烯酰胺凝膠電泳 PCR擴增產物用10 %非變性聚丙烯酰胺凝膠在120 W恒功率下電泳分離1 h后，按照銀染程序進行固定、漂洗、染色、漂洗、顯影，最后拍照保存。

1.2.6 數據統計分析 擴增產物在電泳結果中與對照(優良糯玉米自交系)具有相同條帶的即為含有目標基因waxy的樣品，在田間對應編號的植株即為甜糯雙隱性sh2sh2wxwx玉米單株。不同遺傳背景的供試材料獲得甜糯雙隱性玉米單株的比例采用下列公式分別計算。甜糯雙隱性純合體比例=(同一背景獲得的甜糯雙隱性植株數/同一背景獲得的供試植株數)×100 %。

2 結果與分析

2.1 DNA濃度和質量

模板DNA的濃度和質量與PCR擴增結果密切相關。模板DNA濃度，特別是其中待擴增目的基因的原始拷貝數以及DNA的純度、長度和完整性是影響PCR擴增效率和特異擴增片段檢出率的重要因素。從圖1可知，本試驗提取的玉米葉片總DNA質量和純度較高，濃度適宜，長度完整，可用于后續PCR擴增。

2.2 SSR引物檢測

以優良糯玉米自交系YH03-01(母本)DNA為模板，對與糯玉米隱性基因(waxy)緊密連鎖的3對SSR引物phi022、phi027、phi061進行選擇與確定。從圖2可知，3對SSR引物對糯質親本的擴增條帶清晰單一，且處于同一遷移率位置，均能成功標記。

圖1 部分DNA瓊脂糖凝膠電泳結果Fig.1 Detection results of partial DNA agarose gel electrophoresis

2.3 SSR標記結果分析

以優良糯玉米自交系H00-1為對照(CK)，利用phi022、phi027、phi061對3種不同遺傳背景獲得的354份材料進行SSR甜糯雙隱基因型鑒定。PCR擴增結果顯示：①引物phi027在354份供試材料與對照CK間無明顯多態性。②引物phi022對常規甜、糯雜交F1在甜質背景下選育的84份材料和F1在糯質背景下選育的186份材料擴增出來的帶型完整清晰，重復性好，可明顯標記基因型(圖3)；用于甜、糯染色體雜交手段獲得的84份材料，擴增條帶則較為模糊。③引物phi061對甜、糯染色體雜交手段獲得的84份材料進行PCR擴增，圖譜條帶穩定清晰，可直接判斷目標基因是否存在；而用于常規甜、糯雜交F1在甜質背景下選育的84份材料和F1在糯質背景下選育的186份材料，擴增條帶模糊不清，或者材料與對照CK間無多態性。

由于SSR標記的共顯性特征，可分辨純合基因型個體或雜合基因型個體，根據PCR擴增結果：①利用引物phi022，常規甜、糯雜交F1在甜質背景下選育的84份材料中與對照CK處于同一位點的樣品有16個，在田間對應編號的植株即為甜糯雙隱性純合基因型sh2sh2wxwx玉米單株，甜糯雙隱基因型純合體的比例為19.05 %，甜質純合基因型sh2sh2WxWx玉米材料19份，甜質雜合基因型sh2sh2Wxwx玉米材料為49份。②利用引物phi022，F1在糯質背景下選育的186份材料的擴增產物在電泳結果中與對照CK均具有相同的圖譜條帶，即此遺傳背景下甜糯雙隱性純合體的比例為100.00 %。③利用引物phi061，鑒定出甜、糯染色體雜交手段獲得的84份材料中有39份甜糯雙隱基因型玉米純合體，38份甜質純合基因型sh2sh2WxWx材料，7份甜質雜合基因型sh2sh2Wxwx材料，甜糯雙隱基因型純合體的比例為46.43 %。SSR鑒定選擇出的甜糯雙隱性玉米種質連續套袋自交，可進一步純化繁殖成甜糯雙隱性玉米自交系，有效簡化育種程序、降低育種成本。

3 結論與討論

甜糯雙隱性玉米籽粒表型為甜質，默認其含有甜質基因，本研究基于SSR分子標記鑒定技術，利用與糯玉米隱性基因waxy緊密連鎖的SSR標記引物phi022、phi027、phi061，篩選出含有糯質基因的個體，即為甜糯雙隱性玉米種質。楊耀迥等[12]利用這3對SSR引物對S1甜質家系篩選甜糯雙隱性玉米種質時發現，引物phi022擴增效果較好，并成功鑒定出9株甜糯雙隱性玉米單株，而phi027和phi061擴增條帶模糊甚至殘缺不全。宮捷等[13]使用同樣的3對SSR引物在3份糯玉米自交系L33、L35和L38和1份甜玉米骨干系M01之間進行多態性檢測時發現，引物phi022和phi027在親本間無差異，而引物phi061條帶清晰完整且有明顯多態性，可用來鑒定sh2sh2wxwx甜糯雙隱性純合體。本研究中3對SSR引物對糯質親本的擴增條帶清晰單一，且處于同一遷移率位置，引物phi022可成功標記常規甜、糯雜交F1在甜質背景下選育的84份材料和F1在糯質背景下選育的186份材料的基因型，但用于染色體雜交手段獲得材料的標記時則較模糊；引物phi061對甜、糯染色體雜交手段獲得的84份材料可明顯判斷目標基因是否存在，用于常規甜、糯雜交獲得的材料時條帶模糊不全，或材料與對照CK間無多態性；引物phi027在354份供試材料與對照CK間無多態性。結合影響分子標記鑒定效果的因素分析，材料的遺傳背景，性狀的遺傳率，標記定位精度以及與目標基因連鎖程度，標記的特異性和在材料間的多態性，PCR反應條件，均可影響檢測的準確性和效率以及性狀對MAS的響應[14]。

圖3 引物phi022部分擴增產物圖譜Fig.3 Electrophoresis of partial amplified products with primer phi022

常規甜、糯玉米雜交組配是創制雙隱性材料最常用的方法之一[5]，甜、糯玉米雜交后獲得普通玉米(Sh2sh2Wxwx)種子，后代植株選株自交或彼此交，依據遺傳自由組合定律，F1果穗上有9/16普通玉米籽粒(Sh2-Wx-)、3/16糯質籽粒(Sh2-wxwx)、4/16甜質籽粒[8]。其中4/16的甜粒中有1/16的甜糯雙隱性玉米籽粒(sh2sh2wxwx)，3/16超甜玉米籽粒(sh2sh2Wx-)，甜糯雙隱性籽粒占甜粒數的25 %。本研究F1在甜質背景下選育的84份材料中鑒定出16份甜糯雙隱性材料，比例為19.05 %，與理論值近似，差值部分推測為甜糯雙隱性材料種子活力差、出苗率低，出苗數低于播種數造成。蘇彩霞等[4]研究發現常規甜、糯玉米雜交F1果穗上3/16的糯粒播種自交1代后，1/3的果穗表現全糯(Sh2Sh2wxwx)，2/3的果穗分離出3/4糯質籽粒(Sh2-wxwx)，1/4表型為甜質的雙隱性籽粒(sh2sh2wxwx)，甜糯雙隱性籽粒占甜粒比例為100 %。本研究F1在糯質背景下選育的186份材料中標記出186份甜糯雙隱性材料，即此遺傳背景下甜糯雙隱性純合體的比例為100 %，與理論值吻合。目前尚未見通過甜、糯玉米染色體雜交手段獲得雙隱性材料的相關報道，筆者委托深圳市百綠生物染色體雜交研究所以糯玉米作供體制成染色體片段導入甜玉米(受體)細胞，被導入的染色體片段和受體細胞內原有的染色體發生融合雜交，再通過組織培養和篩選獲得一批材料，為驗證此創制方法的可行性，對獲得的84份材料進行了SSR鑒定，其中甜糯雙隱性玉米純合體有39份，比例為46.43 %。本研究結果表明不同遺傳背景獲得雙隱性材料各有優缺點，常規甜、糯雜交F1果穗上選擇甜粒所需代次少，分離比例較高，但外觀難以與甜粒區分，須鑒定基因型，增加工作環節；F1果穗上選擇糯粒，該背景獲得雙隱性籽粒所需代次較多，分離比例低，但可省略鑒定環節。甜、糯染色體雜交技術可控性差，分離比例變異大，還需進一步觀察該技術的成熟度。

目前對于甜糯雙隱性玉米材料的研究仍處于探索階段，快速準確的判斷甜糯雙隱性玉米是開展后續工作的前提。在鑒定過程中，育種者普遍采用糯玉米作為測驗種判斷甜糯雙隱性玉米種質[15]，但測交鑒定法依賴于植株的表型選擇，容易受外界環境影響，工序繁瑣，耗費時間長，工作量大，效率低。SSR分子標記技術可通過與目標基因緊密連鎖或共分離的功能標記直接鎖定目標基因，簡便快速、遺傳穩定，已廣泛應用于作物的遺傳改良和聚合育種[16-17]。分子標記鑒定法對基因型直接進行選擇，不受環境、發育時期和基因表達等因素限制，與傳統測交鑒定相比具有顯著優勢，極大的提高了選擇效率，但SSR分子標記鑒定法不能脫離常規育種手段單獨使用。因此構建飽和的分子標記遺傳圖譜，提高定位精度，尋找到背景選擇適宜的標記，利用目標基因兩側連鎖的分子標記同時進行選擇[18]，并根據育種需要結合傳統鑒定方法和創新不同的鑒定手段，可顯著提高甜糯雙隱性玉米自交系的選擇效率和準確性。