多環境下大豆全生育期的QTL定位

張佳南，王艷殊，許世超，田 雨，李文霞，寧海龍

(東北農業大學 農學院，大豆生物學教育部重點實驗室，農業部東北大豆生物學與遺傳育種重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150030)

【研究意義】大豆的生育期性狀是決定生產的重要性狀之一，對產量、品質至關重要。育種實踐也表明，改變大豆生育期結構，能夠增加產量。一般來說，生育期較長的大豆品種，產量較高，所以，研究大豆生育期的遺傳規律有助于更加清楚地了解產量形成的機制。大豆生育期也是確定大豆生態適應性的重要性狀，了解其遺傳規律可以指導品種的合理選擇和不同積溫區的生態布局。為加快育種進程，分子標記技術被廣泛應用于大豆生育期QTL定位育種研究中[1-2]，利用分子標記構建的遺傳連鎖圖譜對大豆生育期相關性狀進行QTL分析，可以在分子水平上闡述控制大豆生長發育相關基因系統的表達規律，大大促進了數量性狀的遺傳研究。【前人研究進展】近年來，國內外關于大豆生育期QTL定位的報道已有很多。截至2015年，共定位482個生育期相關的QTL(http://soybase.org)。但是以往研究有3方面的不足。一是國內外定位生育期相關的QTL數量雖多，但多是運用單一環境進行研究。由于大豆生育期性狀遺傳為數量遺傳，受多基因控制，很容易受到光照長度和溫度等環境的影響，因此應通過多環境聯合分析，可定位到多環境共表達的穩定QTL和某一環境特意表達的QTL。二是大多數研究只將整個生育期分為前、中、后3個生育階段，很少將發育進程細分小階段后進行分析；三是大多數研究群體是由兩親本衍生的，兩個親本的雜交后代在進行連鎖分析時，一個位點涉及只兩個等位基因，檢測效率低。而四向重組自交系群體是由4個親本衍生的群體，多態性標記數量以及遺傳圖譜標記密度都會增加，分子標記多態性也更豐富，最主要的是基于一個基因位點同時分析4個復等位基因效應，從而提高QTL檢測效率。為滿足自花授粉作物的需要，四向重組自交系群體被提出并應用于遺傳分析[3-4]。【本研究的切入點】本研究應用前期構建的四向重組自交系群體(FW-RIL)，利用SSR分子標記構建遺傳圖譜，應用3個年份6個不同播期下的生育期結構數據進行QTL定位分析，檢測不同年份、不同播期下穩定表達的全生育期QTL，并應用四向重組自交系群體多等位基因的優勢，探尋有利于生育期性狀改良的優異等位基因，進一步了解大豆生育期性狀的遺傳控制和環境調控規律。【擬解決的關鍵問題】為大豆育種中生育期性狀的定量設計提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 四向重組自交系群體的構建

應用生育期性狀存在差異的4個大豆親本，墾豐14(生育期120 d)、墾豐15(生育期116 d)、黑農48(生育期118 d)和墾豐19(生育期112 d)于2008年配制雙交組合(墾豐14×墾豐15)×(黑農48×墾豐19)，獲得FW-F1世代，將FW-F1在哈爾濱和海南省三亞市崖州區連續自交6代，采用單粒傳法獲得FW-F2∶8四向重組自交系群體，包含160個株系，連同其4個親本組成本試驗材料。

1.2 田間試驗與性狀調查

田間試驗采用隨機區組設計，3行區。小區行長5 m，壟距65 cm，株距10 cm，3次重復，田間管理同一般大田栽培。2014年5月10日在哈爾濱香坊農場播種第1播期(14S1)，同年5月20日進行第2播期播種(14S2)；2015年5月10日在哈爾濱東北農業大學農院試驗田進行第1播期種植(15S1)，第2播期于5月20日進行播種(15S2)；2016年5月7日在哈爾濱東北農業大學農院試驗田進行第1播期種植(16S1)，5月17日播種第2播期(16S2)。

田間記錄生育期按Fehr和Carviness的大豆生育時期劃分標準記載[4]，調查各株系及親本出苗后及時記錄子葉期時間，之后進入始花期，始花期后每2～3 d到田間觀察大豆群體發育動態，并及時記錄生育期表型數據直到群體達到完全成熟階段，數據記錄完成。根據數據及生育期圖譜進行QTL定位。調查各株系及親本的出苗期(VE)、始花期(ER1)、盛花期(ER2)、始莢期(ER3)、盛莢期(ER4)、始粒期(ER5)、鼓粒期(ER6)、始熟期(ER7)和完熟期(ER8)，并計算出本實驗用于QTL定位分析的生育期各階段的數值：盛花-始莢(R23)、始莢-盛莢(R34)、盛莢-始粒(R45)、始粒-鼓粒(R56)、鼓粒-始熟(R67)、始熟-完熟(R78)、始花-完熟(R18)的天數。

1.3 SSR標記分析

參照Gregan[5]等發表的大豆公共遺傳圖譜挑選引物，本研究初步挑選了638對SSR引物在4個親本之間進行多態性篩選，其中有275對引物在4個親本之間表現出多態性。根據Soybase(http://soybase.org)網站提供的大豆SSR序列合成引物并對4個親本及FW-RIL群體進行PCR擴增。

PCR擴增體系：3 μl總DNA(50 ng/μl)+3 μl引物(100 nmol/μl)(包括上游引物和下游引物)+0.3 μl dNTP(10 nmol/μl)+2 μl10×緩沖液+0.2 μlTap酶(5 U/μl)，用超純水定容至20 μl。

PCR擴增條件：94 ℃預變性10 min，進入循環：94 ℃變性30 s；50 ℃復性30 s；72 ℃延伸30 s；循環38次后在72 ℃延伸5 min，于4 ℃保存。

電泳方法：每個PCR反應體系加上8 μl Loading Buffer，置PCR儀中變性10 min，然后放入冰上冷卻。PCR產物在6 %的聚丙烯酰胺凝膠上分離，在1500W恒功率下電泳約1.5 h。

銀染方法：在20 mL酒精(95 %)+10 mL冰乙酸+3 mL AgNO3+1500 mL蒸餾水中染色10 min，清水漂洗30 s后放入30 g NaOH+6 mL甲醛中顯色+1500 mL蒸餾水顯色5～10 min。

1.4 連鎖圖譜的構建

遺傳圖譜由東北農業大學教授寧海龍等[6]以4個親本雜交衍生的160個FW-RIL群體(F8代)為材料，構建了一個基于四向群體的大豆遺傳圖譜。圖譜包含275個SSR遺傳標記，20個連鎖群，在大豆基因組上總遺傳距離3636.26 cM，平均圖距15.47 cM。每個連鎖群包含遺傳標記6～0個，圖距在49.36～319.02 cM。

1.5 數據分析方法

對不同環境條件下全生育期表型數據進行描述性分析，并使用SAS9.1軟件進行方差分析對不同環境下的表型觀測值進行聯合方差分析，估算相應的方差分量，通過環境方差、基因型方差、基因與環境互作以及誤差方差和總體方差進行遺傳率的估計，遺傳率估計的計算方法如下：

用QTL(GAPL V1.2)軟件進行QTL定位，采用完備區間作圖法、簡單區間作圖法和排列法進行加性效應分析，對每個性狀分別進行1000次排列測驗(permutation test)，以確定每個性狀的LOD臨界值閾值(顯著水平0.05)。

2 結果與分析

2.1 表型數據分析

FW-RIL群體各生育期性狀的平均值、標準差、變幅、偏度及峰度列于(表1)。FW-RIL群體的各個生育期階段存在較大的變異，不同年份和播期下各階段差異同樣顯著、偏度及峰度均小于1，表明各階段生育期性狀的表型值基本符合正態分布，表示存在多數微效基因，因此，可用于多年多環境下生育期性狀QTL的定位。

2.2 FW-RIL生育期階段的方差分析和遺傳率估計

方差分析結果表明(表2)FW-RIL群體的生育期性狀在播期、家系以及播期與基因互作間存在極顯著差異，表明生育期性狀受播期影響、且與播期顯著互作。各階段生育期性狀在不同年份下遺傳率變現不同，表明可能存在年份與基因互作。

表1 不同年份下FW-RIL生育期各階段的描述性分析

2.3 同一年份不同播期下生育期QTL定位

在本研究中，同一年份不同播期下重復檢測到的生育期位點有18個(表3)，分布在A1、C2、D2、F、K、O、G、B1、D1b、I、M、N，連鎖群上。LOD值變化范圍2.51～46.30。PVE變化范圍0.43 %～11.33 %，多數為微效基因，來自親本KF14正向加性效應等位基因型分別有3個，負向加性效應等位基因型分別有15個；來自親本KF15正向加性效應等位基因型分別有6個，負向加性效應等位基因型分別有12個；來自親本HN48正向加性效應等位基因型分別有6個，負向加性效應等位基因型分別有12個；來自親本KF19正向加性效應等位基因型分別有7，負向加性效應等位基因型分別有11個。

2.4 不同年份下生育期QTL定位

在本研究中，不同年份下重復檢測的生育期位點有14個QTL(圖1)，分布在AJ、N、C1、D1b、D2、K、L、O、A2連鎖群上。LOD值變化范圍2.60～10.84。PVE變化范圍0.47 %～4.56 %，多數為微效基因，來自親本KF14正向加性效應等位基因型分別有3個，負向加性效應等位基因型分別有11個；來自親本KF15正向加性效應等位基因型分別有5個，負向加性效應等位基因型分別有9個；來自親本HN48正向加性效應等位基因型分別有3個，負向加性效應等位基因型分別有11個；來自親本KF19正向加性效應等位基因型分別有9，負向加性效應等位基因型分別有4個。

表3 相同年份不同播期下FW-RIL生育期各階段QTL的重復定位

續表3 Continued table 3

3 討 論

3.1 光周期頓感QTLs

本研究有18個在相同年份不同播期下重復檢測位點(即光周期頓感QTLs)，比較公共圖譜發現有15個與前人發現QTL基因組相互重疊，其中4個QTL定位區間與已定位的光周期頓感QTLs區間相互重疊。qER1-C2-1在公共圖譜的基因組位置為106.478(BARCSOYSSR_06_1462)～112.189 cM(Satt557)，所在基因組區域與已經定位的6個成熟期、14個始花期、1個出苗期、1個營養期和1個生殖期和2個光周期頓感QTL[10-11,13-14,17,21,27-28,30,32,37]相互重疊；qER1-F-2在公共圖譜的基因組位置為50.242(Satt595)～124.877 cM(AW756935)，所在基因組區域與已經定位的1個成熟期、1個出苗期、2個生殖期和1個光周期頓感QTL[13,29,36]相互重疊；qER1-K-1在公共圖譜的基因組位置為23.428(BARCSOYSSR_09_0183)～32.955 cM(Satt055)，所在基因組區域與已經定位的2個成熟期、1個始花期1個光周期頓感QTL[17,25,29]相互重疊；qR34-K-2在公共圖譜的基因組位置為4.853(Sat_087)～43.042 cM(Sct_196)，所在基因組區域與已經定3個成熟期、2個始花期和1個光周期頓感QTL[17,25,29,35]相互重疊。這些位點在相同年份不同播期下重復表達，且定位區間與已定位的光周期頓感QTL區間相互重合，說明受播期環境影響較小,即為光周期頓感QTLs。

qER1-O-1在公共圖譜的基因組位置為5.44(Satt358)～8.748 cM(Sat_132)，所在基因組區域與已經定位的1個成熟期階段QTL[35]相互重疊；qR34-B1-1在公共圖譜的基因組位置為49.731(Sat_247)～53.412cM(Sat_128)，所在基因組區域與已經定位的1個成熟期QTL[7]相互重疊；qER6-G-1、qR13-G-1、qER3-G-1標記區間相同，在公共圖譜的基因組位置為76.77(Satt288)～94.403 cM(Sct_199)，所在基因組區域與已經定位的8個成熟期和1個生殖期QTL[7-9,15]相互重疊；qR34-I-1在公共圖譜的基因組位置為84.481(Sat_324)～112.7 cM(Satt440)，所在基因組區域與已經定位的1個成熟期和個1出苗期QTL[48]相互重疊。qR78-B1-1在公共圖譜的基因組位置為84.189(Satt583)～100.877 cM(Sat_123)，所在基因組區域與已經定位的1個成熟期和1個生殖器QTL[10,35]相互重疊；qR78-N-1在公共圖譜的基因組位置為92.558(Satt257)～102.055 cM(Satt022)，所在基因組區域與已經定位的2個成熟期QTL相互重疊[15]；qR78-M-1在公共圖譜的基因組位置為53.538(Satt245)～75.571 cM(Satt677)，所在基因組區域與已經定位的2個成熟期、1個始花期、1個營養期和1個生殖期QTL[9-10,13,19]相互重疊。qER1-K-2在公共圖譜的基因組位置為43.955(Satt247)～46.796 cM(Satt727)，所在基因組區域與已經定位的1個成熟期和1個營養期QTL相互重疊[10,24]；qR34-D1b-4在公共圖譜的基因組位置為73.346(Satt290)～75.939 cM(Satt579)，所在基因組區域與已經定位的1個成熟期QTL[11,25]相互重疊。這些QTL雖然沒有與已發現的光周期頓感QTL區間相互重疊，但與生育期QTL區間相互重疊，為光周期頓感QTL的發現提供理論依據與材料。

圖1 不同年份下生育期QTL定位圖Fig.1 QTL location of growth period in different years

3.2 不同年份重復定位QTLs分析

在不同(2年或2年以上)年份重復定位QTL(表)有14個，比較公共圖譜發現有11個與前人發現QTL基因組相互重疊，qR34-C1-1在公共圖譜的基因組位置為82.506(Sat_042)～84.809 cM(Satt195)，所在基因組區域與已經定位的2個成熟期QTL[33]相互重疊；qR34-D1b-1在公共圖譜的基因組位置為35.745(Sat_373)～40.041cM(Satt701)，所在基因組區域與已經定位的1個成熟期QTL[35]相互重疊；qR34-D1b-2在公共圖譜的基因組位置為73.346(Satt290)～87.204 cM(Satt546)，所在基因組區域與已經定位的1個成熟期和3個始花期QTL[11,22,25]相互重疊；qR34-D1b-3在公共圖譜的基因組位置為87.204(Satt546)～98.745cM(Satt703)，所在基因組區域與已經定位的1個始花期QTL[34]相互重疊；qER5-J-1和qER6-J-1在公共圖譜的基因組位置相同為73.346(Satt290)～87.204 cM(Satt546)，所在基因組區域與已經定位的1個生殖期、1個成熟期和3個始花期QTL[14,39]相互重疊；qR34-K-1在公共圖譜的基因組位置相同為42.392(Satt349)～45.053 cM(BARCSOYSSR_09_0849)，所在基因組區域與已經定位的1個始花期、1個成熟期和1個營養期QTL[10,24,35]相互重疊；qR34-L-1在公共圖譜的基因組位置相同為30.891(Sat_187)～115.072 cM(Sat_245)，所在基因組區域與已經定位的9個始花期個、12個成熟期、7個生殖期和1個出苗期QTL[9,12-13,16-19,21-23,25-27,31,34,37]相互重疊；qR34-L-2在公共圖譜的基因組位置相同為61.349(Satt076)～102.055 cM(Sat_245)，所在基因組區域與已經定位的8個始花期個、9個成熟期、6個生殖期和1個出苗期QTL[12-13,18-19,26-27,31,37]相互重疊；qR56-N-1在公共圖譜的基因組位置相同為37.976(Satt584)～115.072 cM(Satt022)，所在基因組區域與已經定位的3個成熟期QTL[15,24]相互重疊；qR34-O-1在公共圖譜的基因組位置相同為5.396(BARCSOYSSR_10_0066)～9.526 cM(Satt487)，所在基因組區域與已經定位的1個成熟期QTL[35]相互重疊。表明這些QTLs在不同的年份、地區均可穩定表達，受環境的影響相對較小。

3.3 一因多效位點QTL分析

以往研究中一些研究者在定位開花期和成熟期基因時發現，很多群體中與開花期相連鎖的標記位點同時與成熟期基因連鎖說明控制開花期和成熟期的遺傳機制相互聯系。本試驗細致的對生育期每個進程QTL進行定位，討論不同生育階段遺傳機制關聯性。在于前人研究一致的位點中，qR78-B1-1所在基因組包含qR34-B1-1；qER3-G-1、qER6-G-1、qR13-G-1位于同一連鎖群，且標記區間相同；qER5-J-1、qER6-J-1位于同一連鎖群，且標記區間相同；qR34-K-2與qER1-K-1、qR34-K-1與qER1-K-2所在基因組區域相互重疊。qR56-N-1、qR78-N-1所在基因組區域相互重疊；qR34-O-1、qER1-O-1所在基因組區域相互重疊。這些QTLs位于同一連鎖群，且基因組區域緊密聯系，說明這些QTLs可能為同一基因或基因緊密連鎖，其中R34與ER1生育期階段共有3對QTLs緊密聯系，進一步佐證了前人關于大豆開花期與成熟區的遺傳機制相互聯系的觀點，同時為揭示大豆各生育期階段的遺傳關系提供重要的參考。

本試驗重復檢測位點中qR45-A2-1、qR34-D2-1qER6-N-1、qR34-O-1，qER1-D2-2、qR34-I-1、qR78-B1-1，未與前人一致，這些位點在不同環境下被重復定位，在不同的生育期階段發揮作用，說明這些位點的遺傳具有穩定性，可以連續表達，它們的作用具有連續性，有些位點在全生育期階段沒有被檢測到，這可能是后期不同位點之間的相互作用或基因效應的消減作用等掩蓋了該位點的表達效應。

4 結 論

本研究重復定位到32個與生育期各階段相關的QTL，其中18個同一年份不同播期下被重復定位，14個在不同年份下被重復定位。32個在多環境下被重復定位的位點中26個位點與前人研究一致，6個生育階段QTL位點為新發現位點。