石漠化環境下2種蘚類植物葉綠素含量與SPAD值的相關性及其空間分異

李玉杰，程 才，向 剛，李曉娜*

(1.貴州師范大學 喀斯特研究院，貴州 貴陽 550001；2.貴州省喀斯特山地生態環境國家重點實驗室培育基地，貴州 貴陽 550001；3.貴州師范大學 地理與環境科學學院，貴州 貴陽 550001)

【研究意義】在喀斯特巖溶系統中，苔蘚植物是生物巖溶的重要參與者，其生理生態指標除了能反應自身代謝活性外，還與喀斯特環境有著顯著的關聯[1-3]，由于蘚類生理生態過程中釋放的酸性物質及二氧化碳均對巖石有溶蝕作用，其生物過程所富集的營養元素能給其他高等植物群落的產生提供良好的物質基礎[4]，因此苔蘚植物生理生態研究對石漠化治理具有一定的實際意義。【前人研究進展】葉綠素含量是植物生理生化及生態調查中的關鍵測量參數，能靈敏地反應出植物的生理狀態與環境的相互關系，綠色度值(Soil and Plant Analyzer DevelopmentSPAD)是用于表征植物葉綠素相對含量的重要指標，由于SPAD值能通過葉綠素測定儀快速測出，且能較好地反映植物葉綠素含量特征，常被用于農作物健康狀況評估及植物生理生態研究中，其在水稻、蔬菜瓜果等研究中SPAD值與葉綠素含量的相互關系已有詳細報道[5-8]，林草業方面的相關研究也有所及[9-11]，且均取得了較為顯著的成果，可見SPAD值對于植物生理生態監測具有重要意義。【本研究切入點】葉綠素測定儀(SPAD-502)具備探孔小、精度高等優勢，其在葉片薄而小的蘚類植物上的應用未有相關文章報道。因此選取了石漠化地區廣泛分布的2種蘚類尖葉對齒蘚(Didymodonconstrictus)和穗枝赤齒蘚(Erythrodontiumjulaceum)，運用SPAD-502進行葉片SPAD值測定。【擬解決的關鍵問題】探討蘚類植物SPAD值與對應葉綠素含量的相互關系，同時對不同石漠化程度中蘚類植物葉綠素含量的空間分異進行對比，揭示其分異規律并分析原因，為石漠化區域生態監測及生態修復提供蘚類植物層面的數據支撐。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

撒拉溪示范區位于貴州省畢節市西南部，喀斯特面積占總面積的74 %，是我國西南地區典型的喀斯特地貌主導區域，為石漠化治理的綜合示范區，區域內不同石漠化等級均有分布。區域內高原山地生態環境占主導，主要出露石灰巖及部分砂巖，地貌類型以峰叢洼地為主。示范區主要包括9個行政村，總人口數為20 215人，植被類型為亞熱帶常綠針-闊葉林以及落葉闊葉林，區內多年平均降水量為984.40 mm，年均溫為12.3 ℃。長期以來，由于人為活動原因，原生植物破壞嚴重，優勢植物種群主要為櫟類(Quercusspp.)、火棘(Pyracanthafortuneana)和杜鵑(Rhododendronspp.)等藤刺灌叢，石漠化環境問題凸顯。

1.2 方法

1.2.1 蘚類樣本采集 采樣時間為2018年8月16號(采樣前3 d無降水)，在不同石漠化等級區(無石漠化、輕度石漠化、中度石漠化和強度石漠化)隨機取撒拉溪廣泛分布的尖葉對齒蘚和穗枝赤齒蘚各10個樣，共計80個樣本。各取樣點光照度、植被蓋度和坡向見表1。

1.2.2SPAD值和葉綠素含量測定 (1)SPAD值測定。取樣時使用SPAD-502測定儀對所采苔蘚進行測量并記錄SPAD值，每個樣本測10次，測定后將樣本裝入牛皮紙袋帶回實驗室進行葉綠素含量測定。

(2)葉綠素含量測定。測定前用少量蒸餾水噴洗樣本除去表面雜質，置于通風干燥環境中24 h后以備實驗。為保證測定結果盡可能不受到樣品存放時長的影響，葉綠素的提取與測定采用邱念偉等的快速提取測定法[12]，將所測苔蘚樣本均勻剪碎，取100 mg置于10 mL的試管中，加入2 mL的DMSO浸潤，在65 ℃的避光環境中提取直至樣品變白，待樣品冷卻后加入8 mL 80 %的丙酮混合均勻，用分光光度計測量其波長為663.6和646.6 nm處的吸光度，計算葉綠素含量。

Chla(mg/L)=12.27A663.6-2.52A646.6

Chlb(mg/L)=20.10A646.6-4.92A663.6

Chl=Chla+Chlb

葉綠素含量(mg/g)=(色素濃度×提取液的體積)/樣品重

式中，Chla、Chlb和Chl分別為葉綠素a含量、葉綠素b含量和葉綠素總含量，A663.6和A646.6分別為葉綠素提取液在663.6和646.6 nm處的吸光度值。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel和SPSS對數據進行統計分析，用Origin和Canoco 進行作圖。

2 結果與分析

2.1 SPAD值與葉綠素含量

從表2看出，尖葉對齒蘚SPAD最小值和最大值分別為7.2和35.6，對應的葉綠素總量(Chl)值和最大值分別0.158和0.816 mg/g。穗枝赤齒蘚SPAD最小值和最大值分別為12.6和40.9，對應葉綠素總量最小值和最大值分別為0.418和 0.972 mg/g。雖然穗枝赤齒蘚SPAD最小值并未對應葉綠素總含量最小值，但總體看來，隨著SPAD值的增加，葉綠素總含量基本呈上升趨勢。

表1 不同石漠化等級樣點的特征

表2 2種蘚類80個樣品的SPAD值和葉綠素含量

續表2 Continued table 2

2.2 SPAD值與葉綠素含量的相關性

運用對數、指數及乘冪函數對2種蘚類植物SPAD值與各葉綠素含量進行相關統計分析結果(表3)表明，SPAD值與葉綠素a、葉綠素b含量的擬合程度具有差異性，同等函數下葉綠素b與SPAD值的相關性均低于葉綠素a，原因主要是葉綠素測定儀(SPAD-502)的發射波長為660 nm，而葉綠素a和葉綠素b的吸收波長分別為663.6和646.6 nm，SPAD-502的波長更為接近葉綠素a的吸收波長，所以導致了SPAD值測量結果對葉綠素b含量有更大的偏差。由于SPAD測定儀器操作與設計的局限性，植株接受測量部位的性狀特征如伸展度、厚度等因素有可能影響SPAD值測量結果。

由圖2可知，隨著石漠化程度的加重，2種蘚類葉綠素總含量與SPAD值間的相關性均逐漸減小。以尖葉對齒蘚為例，其葉綠素總含量與SPAD值線性擬合方程R2從0.90降至0.61；葉綠素a則從0.86降至0.72；葉綠素b降幅更明顯，從0.81降至0.24，降幅最明顯的均為輕度石漠化至中度石漠化階段，中度石漠化至強度石漠化雖有所降低，但降幅有所緩解。石漠化的加劇使得環境條件越來越惡劣，缺少植被保護的情況下陽光可直接作用于苔蘚層，使得蘚類植物葉片因蒸發失水而處于干卷萎黃的失活狀態，葉片的卷曲團縮的情況下測量的精度會受到一定影響，尤其是對含量最少的葉綠素b影響最大(含量越少，對精度要求就越高)，從而致使測量結果受到干擾而影響了擬合特性，但就SPAD值與葉綠素總含量的擬合性來說，SPAD-502葉綠素測定儀所測結果仍然能很好地表征葉綠素總含量及其變化。

圖1 2種蘚類植物的SPAD值與葉綠素各成分含量的相關性Fig.1 Correlation between SPAD values and chlorophyll contents (chlorophyll, chlorophyll a and chlorophyll b) of two mosses

表3 4種函數下2種蘚的SPAD值與葉綠素各成分含量的擬合方程

2.3 石漠化環境中葉綠素含量的空間分異

2.3.1 葉綠素各成分含量的空間分異 從圖3看出，從無石漠化到強度石漠化過程中，尖葉對齒蘚和穗枝赤齒蘚SPAD值與葉綠素a、葉綠素b及葉綠素總含量均都呈明顯下降趨勢，即石漠化程度越高則葉綠素含量越低，SPAD值也越低。其中SPAD值與葉綠素總含量趨勢十分接近，較好地反映葉綠素含量的空間變化趨勢，這也從另一個角度驗證SPAD值用于表征2種蘚類葉綠素總含量及動態變化的可行性。

圖2 不同石漠化程度下2種蘚的SPAD值與葉綠素含量的相關性Fig.2 Correlation between SPAD values and chlorophyll contents of two mosses under rocky desertification with different degrees

圖3 不同石漠化2種蘚的SPAD值及葉綠素含量Fig.3 SPAD values and chlorophyll contents of two mosses under rocky desertification with different degrees

從圖4看出，葉綠素含量與SPAD值呈顯著正相關，葉綠素含量與蔭蔽狀況也呈正相關，此外光照度和植被蓋度均與葉綠素含量呈顯著的負相關，坡向與葉綠素含量有一定負相關性，但不明顯。排序結果表明，在諸多石漠化環境因子中，植被蓋度和光照度因子對2種蘚類植物葉綠素含量的影響最顯著。植被蓋度的降低是喀斯特地區石漠化產生的最直觀因素，植被的減少將使喀斯特區域失去最主要的生態“保護傘”，缺少“保護傘”的情況下區域曝光度增加、水土流失嚴重，高溫干旱且貧瘠的石漠化環境接踵而至。

Vc為植被覆蓋度，Chl為葉綠素總含量，shade為遮陰狀況；asp為坡向，lux為光照度，圓圈為單個樣本，箭頭為各指標數值，箭頭間的夾角表示各指標的相關性，夾角越接近90°則相關性越差 Vc, Chl, shade, asp and lux mean vegetation coverage, total chlorophyll content, shade situation, aspect and illuminance respectively. Circle and arrow mean single sample and the value of each index. The included angle between arrows indicates the correlation between different indexes. The closer the angle to 90° is, the worse the correlation is 圖4 樣點環境因子及蘚的SPAD值與葉綠素總量各因子的PCA排序Fig.4 PCA ranking of sample environment factor, and SPAD value and factor of total chlorophyll content of two mosses

2.3.2 葉綠素a/b值的空間分異 葉綠素b能有效的捕捉并利用藍紫光進行光合作用，因此，苔蘚作為陰生植物，其葉綠素a與葉綠素b的比值通常比陽生植物的低，在1.5～3。通常來說，弱光環境下植物葉片葉綠素a/b值較低而強光照環境下則會增升高，這通常被認為是植物體適應不同光環境的體現[13]。從圖5可知，在喀斯特環境下，石漠化程度的加劇對尖葉對齒蘚和穗枝赤齒蘚葉綠素a和葉綠素b的比值影響顯著，2種蘚類葉綠素a/b均值最大值均出現于強度石漠化區域，尖葉對齒蘚葉綠素a/b的平均值體現為從無石漠化到中度石漠化小幅遞減，到強度石漠化突然升至最大值，穗枝赤齒蘚則隨著石漠化過程的加劇葉綠素a/b的平均值不斷增高。

圖5 不同程度石漠化環境兩種蘚的葉綠素a/b值Fig.5 Chlorophyll a/b values of two mosses under rocky desertification with different degrees

3 討 論

由于蘚類植物葉片較小且不同種之間存在差異，植株體疏密程度不一等原因導致SPAD值測定困難，SPAD-502型號葉綠素測定儀探孔微小、測量精度高等特性為蘚類植物SPAD值測量提供了支撐，從測量結果看來，SPAD值與尖葉對齒蘚和穗枝赤齒蘚葉綠素各成分含量的關系在4種函數方程下擬合度均較好，雖然擬合結果對石漠化程度有一定分異性，但總體也能良好的體現出葉綠素含量的變化趨勢，因此，使用SPAD-502對該兩種蘚類進行葉綠素相對含量測量是完全可行的。隨著蘚類生態生理研究的不斷深入，野外測量葉綠素含量等工作需尋求更有效便捷的方式，SPAD值測定具備不損傷植物體以及快速、精確等優勢，不僅可以對單個樣本進行快速估測，而且在連續的動態監測中更有不可忽視的優越性。

隨石漠化程度加劇蘚類植物單位重量葉綠素含量呈下降趨勢，葉綠素a/b值趨于增高，這是蘚類植物對于石漠化干旱及高曝光環境適應的體現。石漠化高溫干旱環境下維管植物不宜生存[14]，在這種極端的環境條件中苔蘚植物生態位寬度得以增加，這一定程度上得益于蘚類植物在形態結構上的適應特征[15-16]，但蘚類植物生理調節特征也至關重要，在干旱的石漠化地區，蘚類植物可通過滲透調節作用來提高抗氧化酶系統的能力[17]，同時也具備在極端環境下維持光和色素含量、調控色素比率以保證光合機構完整性的能力，這些特殊的生理調節與適應能力讓蘚類植物在極端環境下也能生長發育。

植物體中葉綠素的合成與分解是一個動態平衡的過程，葉綠素含量受光照及溫度等因素影響，其中光照對葉綠素合成和分解起主要作用，光作為激發因子對葉綠素合成有至關重要的影響，在植物葉綠素合成的過程中，谷氨酰-t RNA(Glut RNA)接受光照刺激后開始一系列的葉綠素合成過程，直至葉綠素b形成后總共需要16個步驟[18]，但在整個過程中不需要過強的光照度。此外，受光時植物葉片中Mg2+螯合酶活性會大大增強[19]，有利于葉綠素的進一步合成。已有研究證實，弱光環境對植物葉綠素合成有促進作用[20-22]，這是由于弱光或者遮光條件下植物葉片中集光色素蛋白含量增加而使得結合態葉綠素增多，葉綠素含量因此增加，這有利于植物在弱光環境下能高效地進行光捕捉。石漠化地區溫度的變化很大程度上取決于光照強度及光照時長，溫度通過影響酶活性從而影響植物光合色素的分解與合成，高溫或者低溫均可能導致植物酶活性降低從而影響葉綠素合成與分解過程，但通常來說，隨石漠化程度的增加，植被覆蓋率降低，夏季地表曝光度不斷增加將會導致溫度升高，高溫脅迫下，植物葉綠素含量將會下降[23-24]。坡向在一定程度上可改變區域環境的光照條件及降水條件等[25]，但通常與宏觀的大尺度地貌相關聯，撒拉溪多以低矮的峰叢洼地為主，因此坡向因子對區域環境光照及溫濕度條件影響有限。在喀斯特石漠化環境中，植被蓋度對蘚類植物葉綠素含量的影響體現在其對光照環境及溫度環境的影響上，無石漠化到強度石漠化過程中，植被蓋度不斷降低，同時段地表單位面積光強度隨之增加，蘚類植物在光照不斷變強的情況下葉綠素合成將會受到阻礙。陽光的暴曬致使地層溫度升高、植物蒸騰作用增強，高溫干旱將直接導致植株體失去活性，此時大量葉綠素將會以游離的形態出現于細胞中，這種游離態的葉綠素會對葉細胞造成光氧化損傷，從而迫使植物體必須快速降解游離葉綠素以保證植株體的正常代謝功能[26]。

由于缺少植被覆蓋，石漠化地表層具有高曝光性，且隨石漠化的加劇光照越來越強烈，植物葉片對高強度光照的適應策略除了降低單位質量葉綠素含量以外，還包括增加葉綠素a/b值。葉綠素a與葉綠素b合成和分解的速度影響了葉綠素a/b值的大小，一般來說，在強度石漠化環境下，強光照條件導致葉綠素以降解和光氧化的形勢分解減少，而葉綠素b分解速率要高于葉綠素a，但在弱光或者遮光環境中葉綠素a會以水解形勢部分轉化為葉綠素b[27]，這就導致了無石漠化環境中兩種蘚類植物葉綠素a/b值低于強度石漠化環境，但石漠化過程中尖葉對齒蘚葉綠素a/b值并未呈現出穗枝赤齒蘚那樣的遞增趨勢，而是體現為在無石漠化環境、輕度石漠化環境及中度石漠化環境中略微減小，爾后強度石漠化環境中突然增大至最大值，這可能體現了尖葉對齒蘚在輕中度石漠化環境中具備更好的適應能力，如尖葉對齒蘚葉片細胞具有“疣”， 這種葉細胞上的疣狀突起能有效反射太陽輻射，有助于植物體保持低溫低蒸發狀態，此外尖葉對齒蘚葉片具有中肋結構，較無中肋結構的穗枝赤齒蘚更具水分傳導能力，從而使得葉片能有效維持一定的含水量，這些特殊的生理適應結構有效地抑制了葉綠素的氧化分解，讓葉綠素a/b比值趨于穩定[28]。

4 結 論

2種蘚類植物SPAD值與葉綠素各成分含量在4種函數(線性、對數、指數、乘冪)擬合下均顯著相關，葉綠素a較葉綠素b有更好的相關性，石漠化程度加劇而導致的2種蘚類植物干卷萎縮會對SPAD值測量精度產生影響，但總體上SPAD值仍然能理想地表征2種蘚類植物的葉綠素總含量。隨石漠化程度的增加，2種蘚類植物會通過降低葉綠素含量以及增加葉綠素a/b值來適應石漠化地區惡劣的生態環境。蘚類植物在適應石漠化環境的同時也對石漠化環境產生影響，其植物體具備強大的吸水固土能力，能有效減少石漠化地區的水土流失[29]，改善區域微環境的溫濕度[30]及加速巖溶地區成土過程[31]以及抑制喀斯特礦區重金屬污染的擴散[32]等作用，為石漠化地區植被群落的正向演替提供了良好的基礎，因此，蘚類植物作為先鋒植物應用于石漠化生態修復初級階段具備較大潛力，石漠化地區蘚類植物生理生態監測工作也需要得到更多的重視。