玉米大斑病菌不同致病小種StBCK1基因生物信息學分析

2020-12-10 01:42:40周樹功張曉雅張運峰

西南農業學報 2020年8期

周樹功，張曉雅，張運峰

(1.唐山師范學院數學與信息科學系，河北唐山 063000；2.唐山師范學院生命科學系，河北唐山 063000)

【研究意義】玉米大斑病(Northern Corn Leaf Blight)是一種嚴重威脅玉米生產的真菌性病害，在全球溫濕地區的玉米產地均有發生，在我國華北、東北地區的春玉米產區和南方海拔較高、氣溫較低的山區較易流行，發生嚴重的年份感病品種減產50 %左右[1]，已經成為玉米生產中的重要限制因素[2]。BCK1同源基因在致病真菌中具有細胞完整性、分生孢子發育及色素形成方面具有作用[3]，從分子水平確定基因的功能位點，不僅有利于闡明Slt2-homolog途徑作用機制，還對尋找防治玉米大斑病菌的新作用靶點奠定基礎。【前人研究進展】許多植物病原真菌的生長發育都受到胞外信號轉導途徑的調控，如MAPK、cAMP及Ga2+途徑等，尤其是MAPK 途徑對植物病原真菌生長發育和致病性調節作用的研究較多[3]。通過進一步研究發現，在玉米大斑病菌中存在4種MAPK信號通路，分別是Fus3/Kss1-homolog、Slt2-homolog、Hog1-homolog、Ime2-homolog，4種途徑有著不同的功能：Fus3/Kss1-homolog途徑首先是活化的StSte11激活StSte7，活化的StSte7激活StKss1，被激活的StKss1再激活其他下游靶蛋白參與調控附著胞后期發育及病菌的侵入過程；Slt2-homolog途徑首先活化的StBCK1激活StMkk1，StMkk1激活StSlt2調控附著胞的侵入及致病性、分生孢子的形成的過程；Hog1-homolog途徑主要參與調控病菌的脅迫反應及致病性[4]；Ime2-homolog為一條新發現的MAPK 級聯途徑[5]。StBCK1作為Slt2-homolog途徑的關鍵因子具有重要作用，參與細胞壁的完整性、分生孢子形成與侵染等。【本研究切入點】雖然StBCK1在玉米大斑病的發育中起到重要作用，但StBCK1功能的關鍵位點尚不清楚菌。本研究擬通過研究不同生理小種的StBCK1基因和蛋白的差異位點，闡明StBCK1基因差異，初步確定StBCK1蛋白的功能位點。【擬解決的關鍵問題】本研究將確定StBCK1基因功能結構域在不同小種間的保守性，尋找該基因的差異位點，闡明位點差異對蛋白功能的潛在影響。

1 材料與方法

1.1 菌種

玉米大斑病菌01-23(1號，Ht2 Ht3 Htn /Ht1)，11-52A(1N號，Ht2 Ht3 /Ht1 Htn)，11-07D(13號，Ht2 Htn/Ht1 Ht3)，11-29E(0號，Ht1 Ht2 Ht3 Htn/0)菌株由河北農業大學真菌毒素試驗室饋贈。

1.2 試劑

真菌基因組提取試劑盒，TA克隆試劑盒，rTaq酶及StBCK1引物由生工(上海)生物技術公司合成。70 % 乙醇、CTAB、氯仿、異戊醇、β-巰基乙醇、無水乙醇均為國產分析純。

1.3 方法

1.3.1 菌絲體培養和收集將保藏菌株接種于PDA固體培養基上，28 ℃培養，培養5 d。將在培養基上生長5 d左右的菌絲接入裝有液體培養基的三角燒瓶中，100 r/min,28 ℃恒溫培養5～6 d。

1.3.2 基因組DNA的提取和檢測利用CTAB法提取玉米大斑病菌的基因組。瓊脂糖凝膠檢測玉米大斑病菌基因組DNA。取2 μl DNA樣品檢測DNA質量。

1.3.3StBCK1基因結構域PCR和克隆 PCR體系(50 μl)：10×PCR buffer 5 μl，dNTP 3 μl，StBCK1-L(5’-TACCCCAGGACCATCTACCCAG-3’)3 μl，StBCK1-R(5’- GCAATAGACAGAGACCAGAAC AGTG-3’)3 μl，0.5 μl rTaq聚合酶，加ddH2O至50 μl。反應過程：95 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，55 ℃ 90 s，72 ℃ 90 s,40。利用1.0 %TAE瓊脂糖凝膠、3～5 V/cm電泳檢測。

1.3.4StBCK1基因結構域克隆和測序電泳結束后利用北京艾德萊生物科技有限公司瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒純化、回收正確的PCR擴增產物。StBCK1基因片段的TA克隆鏈接參照《TA克隆試劑盒說明書》進行。經過Amp抗生素篩選、PCR鑒定和質粒提取，獲得PUC18-StBCK1克隆載體；克隆載體送華大基因測序。

1.3.5 生物信息學分析 ①以Et28a菌株的StBCK1的蛋白質ID號在UniProKB中搜索查找到該蛋白的InterPro信息，利用GraphView到InterPro里找到蛋白質激酶結構域的位置；②利用DNAMAN軟件將測序小種的DNA序列與Et28a菌株的StBCK1結構域序列比對，確定NY001和被測小種5個菌株的功能結構域；③利用DNAMAN軟件進行6個功能序列對比，確定SNP位點；④利用MEGA軟件對6個小種基因的蛋白質序列進行比對，分析蛋白質的突變位點情況；⑤將蛋白質序列在DNAMAN中進行等電點分析及二級結構預測。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的檢測和StBCK1基因的擴增

提取玉米大斑病菌的基因組DNA，通過瓊脂糖檢測顯示條帶均一且細直亮沒有彌散的情況(圖1)，說明DNA未出現斷裂、裂解；以及用微量分光光度計檢測其濃度和純度，檢測結果顯示濃度均達到了200 ng/μl以上，純度顯示無蛋白質和RNA污染，說明提取的玉米大斑病菌的基因組DNA符合下游PCR擴增的實驗條件。

2.2 StBCK1蛋白質激酶結構域序列位置

通過NCBI數據檢索獲得StBCK1蛋白質激酶結構特征，發現StBCK1蛋白質激酶結構域在DNA序列的4155～5016位，肽鏈的1385～1672位(圖2)。

2.3 StBCK1基因功能結構域序列的SNP分析

通過比較玉米大斑病菌不同小種的StBCK1基因的功能結構域序列發現，11-29E與其它小種相比，第2位堿基由G突變為T，發生了顛換； 01-23、NY001和其他4種菌株相比，第243位堿基由C突變為T，發生了轉換； 11-29E與其它小種相比，第860位堿基由A突變為T，發生了顛換(圖3)。

圖1 基因組DNA的瓊脂糖凝膠檢測Fig.1 Detection of genomic DNA by agarose gel

圖2 StBCK1蛋白激酶結構域的位置Fig.2 The location of the StBCK1 protein kinase domain

2.4 功能結構域氨基酸序列變化

在氨基酸序列的第1位氨基酸的比對(圖4)發現11-29E與其他致病小種相比，氨基酸由絲氨酸變為異亮氨酸為錯義突變，該變化會影響α螺旋的形成，使其含量減少，可能導致MAPK信號通路相關蛋白接受信號后同源二聚化的形成。第89位氨基酸的比對中01-23、NY001和其他4種菌株相比，氨基酸由亮氨酸變為苯丙氨酸為錯義突變，該變化會利于形成β折疊，而β折疊可以起到穩定MAPKKK的三維構象的作用，進而對酶活性產生影響。11-29E菌株的第287位氨基酸與其它致病小種不同，氨基酸由天冬酰胺突變為異亮氨酸為錯義突變，這個突變會影響氨基酸的疏水性質。

圖3 DNA序列比對結果Fig.3 The alignment results of DNA sequence

圖4 蛋白質序列比對Fig.4 The alignment results of protein sequence

圖5 StBCK1基因的氨基酸序列磷酸化位點預測Fig.5 Predicted phosphorylation sites of deduced amino acid sequence of StBCK1 from Setospaeria turcica

2.5 StBCK1基因編碼氨基酸序列的磷酸化位點分析

磷酸化和去磷酸化是細胞內信號傳導的重要激活途徑。用 NetPhos2.0 Server在線程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對StBCK1基因所編碼氨基酸序列中的 Ser、Thr 和 Tys 3 種氨基酸殘基可能成為的磷酸化位點作出預測，由磷酸化位點分析可知，可能成為該蛋白激酶磷酸化位點的為5 個 Ser分別位于序列51/116/120/163/221號位；2 個 Thr分別位于序列的8/125號位；1 個 Tyr位于序列的286號位(圖5)。

3 討論

單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)為第三代分子標記技術，是近幾年最有發展潛力的分子標記技術，具有多態性位點數量多、穩定性好等優點[6]，廣泛用于腫瘤的發生[7-9]、植物性狀的形成[10]等領域的研究。

在植物病菌真菌基因組中SNP的發生頻率較高，平均每500～1000 bp個堿基中就有一個多態性位點[11]，通過對01-23、11-29E等4 個致病小種的SNP發生頻率為0.35 %。DNA堿基的多態性變化改變了各小種StBCK1蛋白質氨基酸組成，尤其功能結構域氨基酸的變化可對蛋白的活性造成顯著的影響，在第287位氨基酸由冬酰胺突變為異亮氨酸可以使氨基酸的疏水性質發生改變，而疏水作用是蛋白質折疊的主要驅動力，在保持蛋白質三級結構上起作用，可能參與活性中心的形成。推測該位點的多態性會對各小種StBCK1蛋白產生功能差異。與蛋白序列對結果結合分析，由于第1位序列中氨基酸由絲氨酸變為異亮氨酸，氨基酸的疏水性質也發生了改變，所以可能導致與它臨近的第8位的Thr磷酸化位點受其影響，進入導致蛋白質內部位點不容易被磷酸化；287位氨基酸由天冬酰胺突變為異亮氨酸，氨基酸的輸水性質和電荷量也發生了改變，可能使與其臨近的第286位Tyr不易被磷酸化，導致蛋白質活性降低，從而使玉米大斑病菌的致病性減弱。細胞壁的完整性對玉米大斑病菌感染寄主有重要作用，導致分生孢子數目不足，附著胞不能形成侵染絲，使其致病性降低[12]，通過明確StBCK1在不同小種中的差異，推測這些位點變化是導致玉米大班病菌致病性差異重要因素。