日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原組分的免疫學特異性分析

唐天才，石團員，袁東波，侯 巍，莫 茜， 尹 杰，陽愛國，郭 莉*，郝力力*

(1.西南民族大學 生命科學與技術學院，四川 成都 610041；2. 浙江省農業科學院 畜牧獸醫研究所，浙江 杭州 310021；3. 四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041)

【研究意義】血吸蟲病(Schistosomiasis)是一種危害嚴重的人畜共患寄生蟲病，全球血吸蟲病人在2億以上，受威脅的流行區人口7億多[1-2]，而日本血吸蟲(Schistosomajaponicum)是導致血吸蟲病的三種病原體之一。四川省氣候溫暖潮濕，年平均氣溫16 ℃，年平均降雨量1000 mm左右，每年無霜期一般大于300 d，非常適宜日本血吸蟲中間宿主釘螺孳生繁殖。血吸蟲病流行于全省11個市、63個縣、622個鄉、4599個村，流行村總人口1058.31萬人，有螺面積26 800 hm2。四川省經過多年綜合防治，2008年全省達到血吸蟲病傳播控制標準[3]，2015年底全省實現了血吸蟲病傳播阻斷的目標[4]，但仍然存在諸多問題和挑戰，例如：依靠治標措施達標，綜合治理覆蓋不夠，存在疫情反彈風險，部分綜合治理環境疫情回升[5-6]，人群和家畜流動性大，傳染源管理困難。由于S.japonicum易感宿主廣泛(涉及40多種哺乳動物)，傳染源和中間宿主尚不能有效根除，日本血吸蟲病仍面臨著隨環境氣候變化而死灰復燃的可能性，其診斷和防治工作仍然不能松懈，因此，快速有效診斷是血吸蟲病及時防治的前提。【前人研究進展】目前，日本血吸蟲病診斷方法可概括為病原形態學、分子生物學和免疫學三大類。其中，病原形態學診斷是最為經典，但費時、費力，漏檢率較高，不適合家畜血吸蟲病的普查，而分子生物學方法因操作復雜且需要昂貴設備僅限于實驗室使用[7-8]；免疫學診斷方法是目前家畜血吸蟲病普查最常用的方法，其診斷抗原通常為S.japonicum可溶性蟲卵抗原(soluble egg antigen, SEA)，這與蟲卵能夠誘導宿主產生高水平Th2型免疫應答和特異性抗體密切相關[9-10]。【本研究切入點】由于SEA組分復雜，在實際應用時易與其他寄生蟲抗原發生交叉反應而降低其特異性。【擬解決的關鍵問題】因此，深入分析并鑒定S.japonicumSEA組分的免疫特異性，是獲取特異性診斷抗原并對其基因進行克隆、表達的前提工作。

1 材料與方法

1.1 蟲卵和血清

已經純化、脫脂和烘干處理后的S.japonicum蟲卵(購自安徽醫科大學)，感染S.japonicum第45天的陽性病牛血清(上海市國家動物醫學研究所贈)，健康牛血清(采自馬邊縣)。

1.2 主要試劑耗材

兔抗牛IgG-hrp,Western-blot工作濃度1∶1000～1∶5000，ELISA工作濃度1∶20 000～40 000北京博奧生物技術有限公司；寬范圍蛋白質分子標準：200、105、79、51、31、15和2 KDa，鼎國生物技術有限公司；增強型ECL發光試劑盒, 南京凱基生物科技發展有限公司；WHATMAN硝酸纖維素(NC)膜，上海索萊寶生物技術有限公司；Pharmac葡聚糖凝膠G-200，上海索萊寶生物技術有限公司。

1.3 主要儀器設備

蛋白質電泳和轉印成套設備(BIO-RAD，美國)；蛋白質層析系統(GE Healthcare,美國)。

1.4 日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的制備

1.4.1 用于SDS-PAGE和Western-blot的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的制備 稱取S.japonicum蟲卵0.1 g(含蟲卵2.8×106個)至小離心管，于液氮中冷卻5 min，然后將蟲卵倒入液氮預冷過的研缽中，向研缽中緩慢加入液氮，邊加邊研磨，至蟲卵鏡檢完全破裂，將蟲卵粉末轉移至新的離心管，向離心管中加入400 μl SDS-PAGE上樣緩沖液，沸水中反復煮3次，每次10 min，期間冰浴2 min，最后，12000 r/min離心2 min，取上清備用。

1.4.2 用于葡聚糖凝膠層析的日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原的制備 稱取S.japonicum蟲卵1 g，玻璃勻漿器研磨30 min，用滅菌生理鹽水配成5 %懸液，置4 ℃浸泡3 d，期間于-20 ℃和室溫間反復凍融10次，然后超聲裂解30 min(400W)，12 000 r/min離心1 h，取上清備用。

1.5 SDS-PAGE和Western-blot分離日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原

分別制備12 %的分離膠和5 %的濃縮膠，膠厚度為1.5 mm,上樣量為20 μl,分別用分離膠80 ν和濃縮膠100 ν恒壓分離樣品。

半干式轉移電泳將凝膠上的蛋白質條帶轉到NC膜上(該轉移緩沖液包含47.88 mmol/L的Tris、38.63 mmol/L的甘氨酸、1.28 mmol/L十二烷基硫酸鈉和20 %的甲醇)；NC膜在去離子水中漂洗后，將其放入5 %脫脂奶粉TBST中4 ℃過夜封閉，然后與用1∶100倍稀釋的S.japonicum陽性病牛血清于37 ℃孵育60 min，TBST洗膜3次后再與1∶2000稀釋的兔抗牛IgG-hrp于37 ℃作用60 min, TBST洗膜3次，最后用ECL化學發光顯影和定影。

1.6 葡聚糖凝膠G-200柱層析分離日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原

稱取3 g葡聚糖凝膠G-200至燒杯中，加入去離子水300 mL，室溫過夜溶脹，次日更換去離子水，沸水浴1 h，冷卻后裝柱，然后用檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.9)平衡過夜，向已平衡的柱內加入日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原，每次2 mL，約為柱體積的5 %，檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.9)洗脫抗原，流速為0.25 mL/min，分別收集Ⅰ峰、峰間和Ⅱ峰抗原組分，-20 ℃保存備用。

1.7 Dot-ELISA鑒定日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原組分

各層析抗原組分分別點膜，1 μg/點，室溫放置1 h，然后將膜置于1 % BSA-PBST中4 ℃過夜封閉，PBST洗膜3次，每次5 min，與1∶100倍稀釋的S.japonicum陽性病牛血清室溫振蕩作用1 h，PBST洗膜3次，每次5 min，與1∶20 000倍稀釋的羊抗牛IgG-hrp室溫振蕩作用1 h，PBST洗膜3次，每次5 min，ECL化學發光顯色。

2 結果與分析

2.1 SDS-PAGE與Western-blot結果

SDS-PAGE分析結果顯示，SEA所包含主要蛋白條帶有10條，分子量大小依次約為100、80、60、55、45、28、27、17、15和13 KDa(圖1)；Western-blot對其鑒定結果顯示，SEA與日本血吸蟲陽性血清出現了3條特異性反應條帶，其中，在28和17 KDa位置條帶較為明顯，在50 KDa位置的反應條帶較弱(圖2)。

M：蛋白標志物；SEA：日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原 M：Protein molecular weight；SEA：Soluble egg antigen圖1 日本血吸蟲蟲卵可溶性抗原SDS-PAGE電泳圖 Fig.1 SDS-PAGE analysis of soluble egg antigens of S.japonium

+：陽性血清；-：陽性血清 +：Potive sera；-：Negative sera圖2 日本血吸蟲可溶性抗原免疫印跡鑒定Fig.2 Western blot analysis of soluble egg antigens of S.japonium

圖3 日本血吸蟲可溶性蟲卵抗原葡聚糖凝膠G-200柱層析分離Fig.3 Chromatographic separation of soluble egg antigens of S.japonium with sephadex G-200

2.2 葡聚糖凝層析及Dot-ELISA鑒定結果

葡聚糖凝膠G-200柱層析對SEA分離結果顯示，SEA在分離過程中出現了2個非常明顯的蛋白質高峰值，分別名Ⅰ峰(時間為4～10 min)和Ⅱ峰(時間為20～30 min，圖3)，根據Ⅰ峰和Ⅱ峰出現時間的早晚判斷，Ⅰ峰為SEA大分子量蛋白組分，Ⅱ峰為SEA小分子量蛋白組分，對所分離到的SEAⅠ峰、峰間和Ⅱ峰蛋白組分Dot-ELISA鑒定結果顯示，Ⅰ峰、峰間和Ⅱ峰蛋白與日本血吸蟲陽性血清均出現了較強的反應，反應斑點明顯，但Ⅰ峰和峰間蛋白與陰性對照血清間也存在不同程度的反應，而Ⅱ峰蛋白未與陰性對照血清出現可見反應(圖4)，表明，Ⅱ峰蛋白是能夠用于血吸蟲病診斷的特異性抗原。

圖中斑點1、2和3所用抗原分別為Ⅰ峰、峰間和Ⅱ峰抗原，Sj+1、Sj+2和Sj+3表示一抗反應血清為日本血吸蟲陽性血清，Normal 1、Normal 2和Normal 3表示一抗反應血清為陰性對照血清 Dot 1, 2 and 3: Antigens corresponding with I peak, between I and II peak and II peak;Sj+1,Sj+2 and Sj+3: Primary antibodies from positive sera; Normal 1,Normal 2 and Normal 3: Primary antibodies from negtive sera圖4 日本血吸蟲蟲卵可溶性葡聚糖凝膠G-200柱層析抗原Dot-ELISA鑒定Fig.4 Dot-ELISA identification of S.japonium soluble egg antigens separated by gel filtration on Sephadex G-200

圖中斑點1、2和3所用抗原分別為Ⅱ峰、Ⅱ峰上清和Ⅱ峰沉淀抗原，Sj+1和Sj+2Sj+3表示一抗反應血清為日本血吸蟲陽性血清，Normal 1和Normal 2表示一抗反應血清為陰性對照血清 Dot 1, 2 and 3: Antigen precipitation corresponding with II peak, II peak supernatant and II peak precipitation;Sj+1, Sj+2 and Sj+3: Primary antibodies from positive sera; Normal 1, Normal 2 and Normal 3: Primary antibodies from negtive sera圖5 日本血吸蟲蟲卵葡聚糖凝膠G-200柱層析Ⅱ峰沉淀抗原Dot-ELISA鑒定Fig.5 Dot-ELISA for determination of protein precipitation from II peak separated by gel filtration on Sephadex G-200

SEA特異性抗原組分為小分子量蛋白，主要成分為28、17和50 KDa蛋白，通過葡聚糖凝膠層析的方法能夠將包含SEA小分子量的Ⅱ峰蛋白分離出來；Dot-ELISA鑒定結果顯示，小分子量蛋白組分峰離心沉淀蛋白組分是非特異性蛋白組分，而Ⅱ峰蛋白中上清蛋白是能夠用于日本血吸蟲病診斷的特異性天然蛋白(圖5)。

3 討 論

目前，在日本血吸蟲病血清學診斷中所用到的抗原包括成蟲抗原、蟲卵抗原和重組抗原等[11-12]，其中，日本血吸蟲SEA抗原不僅特異性和敏感性相對較高，而且是日本血吸蟲蟲卵治病的主要因素，因此已成為日本血吸蟲病診斷中最為常用的抗原之一[11]。然而，SEA是日本血吸蟲蟲卵的蛋白粗提物，所含蛋白質種類繁多[13-14]，且不同提取方法所制備的SEA成分存在差異，這些都會影響到SEA在血清學診斷中的特異性、敏感性和穩定性。因此，本研究通過SDS-PAGE、Western-blot、凝膠層析和Dot-ELISA方法對SEA蛋白組特異性組分進行了分離和分析，其中SDS-PAGE電泳顯示主要有10條蛋白帶，并且其蛋白組分均為100 KDa以下的小分子量蛋白，這與周曉紅等人(2000)[15]報道結果相一致，而不同于朱蔭昌等人(1996)[16]的報道。再經Western-blot分析，顯示SEA與日本血吸蟲陽性血清只出現了3條特異性反應條帶，值得注意的是一些SDS-PAGE蛋白帶陽性的帶用Western-blot分析后呈陰性(如分子質量為100、80、60、45、27和15 KDa蛋白帶)，而這些抗原是否都是日本血吸蟲蟲卵的特異性抗原，還需進一步驗證。

葡聚糖凝膠層析是對具有不同大小蛋白進行快速大量分離的一種方法，且不影響所分離蛋白質的活性。Dot-ELISA是以硝酸纖維素膜(NC膜)為固相載體，是對傳統ELISA的改進，在傳統ELISA準確、快速、特異的優點基礎上，更有包被好的診斷膜片在常溫保存、攜帶和運輸方便較為便捷，適合基層使用等優點，已被較為廣泛的應用于日本血吸蟲的研究。蔡世飛[17]運用Dot-ELISA檢測慢性日本血吸蟲病患者血清IgG；王敏[18]將Dot-ELISA用于急性日本血吸蟲病患者的診斷價值的研究；沈定文[19]運用Dot-ELISA快速診斷日本血吸蟲病。

本研究利用葡聚糖凝膠G-200柱層析和Dot-ELISA對SEA進行了分析，結果表明小分子量的Ⅱ峰蛋白是能夠用于血吸蟲病診斷的特異性抗原，而李旭瓊等人(1984)早期報道[20]Ⅰ峰蛋白特異性較強，這可能與SEA制備時的方法、步驟不同，以及Ⅰ峰和Ⅱ峰蛋白分離時所采用的葡聚糖凝膠分子大小差異密切相關。另外，所分離到的小分子量蛋白存在一定的渾濁度，通過高速離心對其進行了分離，并對其離心后的蛋白組分進行了深入鑒定，Dot-ELISA鑒定結果顯示，小分子量蛋白組分峰離心沉淀蛋白組分是非特異性蛋白組分(圖5)，因此，在制備小分子量蛋白抗原時可通過離心的方法將非特異性蛋白組分去掉，從而獲得特異性蛋白組分。

4 結 論

本研究通過SDS-PAGE、Western-blot、凝膠層析和Dot-ELISA方法分析出SEA小分子量蛋白中的上清蛋白是能夠用于日本血吸蟲病診斷的特異性天然蛋白，這為牛日本血吸蟲病高特異性和敏感性檢測方法的建立奠定了基礎。