基于光誘導電聚合的IgG/PEGDA 復合水凝膠微結構的圖形化加工方法

孫雨陽， 羅 均， 劉 娜， 楊 揚， 孫 翊

(上海大學機電工程與自動化學院， 上海200444)

蛋白質藥物在體內環境中可能因受到多種復雜的化學降解和物理反應而失活， 如凝聚、沉淀、水解等. 同時， 蛋白質藥物具有半衰期短， 清除率高， 分子量大， 透膜能力差， 易受到體內酶、細菌以及體液破壞的特點[1]. 水凝膠具備優良的生物相容性和生物組織相似性， 在藥物儲存、運輸方面有著廣泛應用[2]. 如含水量較高的水凝膠可以為有機小分子提供含水環境， 保留蛋白質藥物的生物活性， 使得水凝膠封裝的蛋白質比分散在溶液中的自由蛋白質更具耐變性[3]. 將蛋白質藥物包封在水凝膠中， 可以對蛋白質起到一定的保護作用[4]， 并可用于蛋白質藥物的可控釋放.

聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate， PEGDA)水凝膠具有較好的化學、機械和生物特性， 可有效屏蔽封裝藥物的生物免疫原性， 增強其對外界條件(酸、堿、酶、水和熱等)的耐受能力， 延長生物藥物在動物體內的半衰期， 是用于藥物可控釋放和組織工程研究的理想載體材料之一[5]. 實現蛋白質封裝并形成特定水凝膠微結構的加工方法對上述應用有直接影響， 具有重要研究價值[6]. 目前， 用于PEGDA 水凝膠微結構的加工方法， 如激光掃描光刻法[7-9]、投影印刷技術[10-12]等， 主要是基于紫外光誘發光敏引發劑的聚合原理. 在這些方法中， 水凝膠的形狀主要通過設計光學掩膜板或設置紫外激光掃描路徑來控制[13]. 然而， 紫外線照射和光引發劑具有生物毒性， 容易引發蛋白質的改性， 并且基于紫外固化的加工難以實現管狀和高深寬比等復雜微結構的加工[14]. 電化學聚合原理也可用于PEGDA 水凝膠的固化成形， 但是傳統電聚合方法加工的水凝膠結構厚度有限(幾百納米)， 且不能靈活控制水凝膠的幾何形狀[15].

針對蛋白質封裝復合水凝膠的應用需求， 以及當前PEGDA 水凝膠加工方法的不足， 本工作研究了一種基于光誘導電聚合原理的水凝膠圖形化加工方法， 并以免疫球蛋白(immunoglobulin G，IgG)為例，通過實驗分別實現了PEGDA 水凝膠微結構和IgG/PEGDA復合水凝膠微結構的圖形化加工. 本方法不需要采用定制的光刻掩膜板、紫外光和光敏引發劑， 而是利用電腦設計的光斑圖形通過聚光鏡投射到光誘導芯片上實現圖形化加工. 在加工過程中， 投射到光誘導芯片上的光圖形通過光電轉換原理在光誘導芯片上產生圖形化的虛擬電極. 該虛擬電極在交流電壓的作用下可誘導PEGDA分子在其表面發生聚合反應并封裝蛋白質分子形成復合凝膠微結構. 由于聚合反應只在虛擬電極表面發生， 因此水凝膠微結構的形狀與光斑圖形一致， 通過改變光斑圖形來改變虛擬電極的形狀即可改變凝膠微結構的形狀. 此外，在凝膠微結構加工過程中， 凝膠微結構的高度隨著聚合時間的增加而增加， 可以通過控制聚合時間來實現對凝膠微結構高度的控制. 因此， 通過調控光斑圖形和聚合時間， 即可實現多種幾何形狀的水凝膠微結構加工.

1 實驗方法和材料

1.1 實驗系統

圖1 為用于水凝膠微結構加工的光誘導電聚合實驗系統， 主要有3 個組成部分， 包括圖像投影模塊、觀測控制模塊和光誘導電聚合(optically-induced electropolymerization， OEP)芯片[16]. 圖像投影模塊的投影儀與裝有繪圖軟件(如微軟PowerPoint 或Adobe Flash)的計算機(電腦2)相連， 用于設計和輸出光斑圖形. 投影儀投出的光圖形通過聚光透鏡被投影到OEP芯片上(見圖1 中的插圖). OEP 芯片固定在三維移動平臺上， 主要包括上層氧化銦錫(indium tin oxide， ITO)玻璃電極、微流體小腔室、下層氫化非晶硅玻璃電極. 氫化非晶硅玻璃電極是利用等離子體增強化學氣相沉積(plasma enhanced chemical vapor deposition， PECVD)法將a-Si:H 層加工到ITO 玻璃電極上得到的[17]. 微流體小腔室是利用厚度為50 μm 的雙面膠粘合上層ITO 玻璃和下層氫化非晶硅玻璃制成的， 用于容納PEGDA 分子和蛋白質的混合溶液.觀測控制模塊由電腦1、顯微鏡和三維移動平臺構成， 用于控制微結構加工位置和實時監測、記錄水凝膠的成形過程.

圖1 光誘導電聚合實驗系統Fig.1 Experimental system for OEP

1.2 溶液配制

用于制作純PEGDA 微結構的溶液配制過程如下: 將PEGDA 原溶液(分子量為575 或10 kD)與去離子水以 1∶4 混合， 攪拌約 10 min， 直到 PEGDA 充分溶解. 制備的 PEGDA 溶液的分子濃度約為340 mol/m3， 電導率約為1.5×10-3S/m. 用于制備包裹蛋白質的PEGDA 水凝膠微結構的溶液制備過程如下: 在1 mL 質量分數為20%的PEGDA 溶液中添加10 μL 濃度為0.1 g/mL的IgG， 并利用移液槍充分吹勻.

1.3 PEGDA 分子聚合過程

當有光斑圖形投射到OEP 芯片上時， 光圖形照射區域的a-S:H 會產生電子躍遷形成電子空穴對， 大大增加圖形區域的電導率. 在本實驗系統中， 將 RGB 值為(0， 255， 0)的綠色光圖形通過投影儀投射到氫化非晶硅薄膜上， 使其電導率從10-11S/m 升至10-5～10-4S/m， 形成“虛擬”電極.

當制備水凝膠微結構時， 信號發生器輸出的交變電壓被加載到頂層和底層的ITO 基板之間， 用于激發水凝膠的電聚合過程. 水凝膠的電聚合主要受電極電位的控制， 當電極/溶液界面上的電勢足夠大時， 可以激活聚合反應的發生. 當有光圖像投射到a-Si:H 芯片上形成虛擬電極時， 虛擬電極處的電極電位遠大于無光照a-Si:H 區域的電極電位. 通過控制交流電壓的頻率和幅值， 可以使PEGDA 分子只在虛擬電極表面進行交聯， 形成與投影圖像形狀相同的水凝膠結構. 圖2 是基于COMSOL 仿真軟件分析的電壓分布， 仿真采用的交流信號為幅值20 VPP， 頻率1 kHz 的正弦電壓. 可見， 光斑圖形照射的a-Si:H 區域的電極電勢遠大于無光照區域的電極電勢.

圖2 OEP 芯片電勢分布的COMSOL 仿真分析結果Fig.2 Voltage distribution in OEP chip simulated by COMSOL

基于光誘導電聚合的PEGDA 水凝膠固化過程可以由圖3 描述[18]. 首先， 溶液中的水合氫離子H3O+運動到氫化非晶硅與溶液的界面層(Step a1)， H3O+分子在界面電場的作用下去水化形成H+(Step a2)并進一步向界面雙電層移動， 在界面電勢的作用下， H+得到電子被還原成活化氫原子(Step a3). 另一方面， 由于擴散作用， 在固液界面層也會存在大量的PEGDA 分子， 而活化的氫原子可以打開PEGDA 分子中的碳碳雙鍵(C=C)， 進而激發PEGDA 分子發生交聯反應(Step b2， 見圖3(b))， 交聯固化后的PEGDA 結構可以從基底脫附(Step b3)， 使新的聚合反應繼續發生， 形成新的PEGDA 結構， 這樣一層一層的聚合使得PEGDA 的三維結構制造得以實現. 當電極電勢過大或PEGDA 分子濃度過低， 使得產生的活化氫原子來不及被PEGDA 分子消耗時， 多余的氫原子會復合產生氫氣分子. 此時， 在PEGDA 三維結構制造過程中會有氣泡產生， 由于產生的氣泡會在一定程度破壞PEGDA 結構， 因此應該盡量避免[18].

圖3 PEGDA 分子的光誘導電聚合反應過程Fig.3 OEP process of PEGDA molecules

2 實驗與討論

2.1 PEGDA 水凝膠微管的制作

為了驗證本方法的可行性， 首先實驗加工了微圓柱的實心水凝膠微結構. 利用計算機設計4×3， 直徑為 13.5 μm 的圓形陣列圖像， 如圖 4(a)所示. 將圖形投影到 OEP 芯片上， 施加電壓峰峰值為20 V， 頻率為3～5 kHz 的正弦交流電壓. 如圖4(b)～(f)所示， 在圓形光斑所照區域，PEGDA 分子交聯固化形成水凝膠微結構; 隨著交聯時間的增加， 水凝膠微柱的長度明顯增加.但是， 由于重力的作用以及水凝膠微結構自身剛度原因， PEGDA 水凝膠微管不能筆直伸展.

圖4 水凝膠微柱陣列的加工過程Fig.4 Manufacturing process of micro-pillar hydrogels arrays

2.2 IgG/PEGDA 復合水凝膠結構

將IgG/PEGDA 混合溶液通入芯片， 用于加工復合水凝膠微結構. 為了驗證光誘導電聚合方法能夠加工傳統加工方法難以加工的圓柱結構， 本實驗利用計算機設計了一組4×4， 外徑為 54 μm， 內徑為 27 μm 的圓環陣列， 用于復合水凝膠微結構加工， 如圖 5(a)所示. 加工過程同樣采用電壓峰峰值為20 V， 頻率為3～5 kHz 的正弦交流電壓， 并用觀測控制模塊對水凝膠微結構加工過程進行監測和記錄. 圖5(b)～(f)分別為交聯聚合發生10， 30， 50， 70 及90 s 后的水凝膠結構， 可以觀察到隨著交聯時間的增加， 微結構的高度也在增加， 并且可以觀察到水凝膠的結構確實與投射光圖像的形狀一致， 為空心圓管結構.

為了證明IgG 確實被封裝在PEGDA 水凝膠中， 構成了IgG/PEGDA 復合水凝膠， 在水凝膠微結構制作完成后， 先后用酒精與去離子水清洗制作的微結構， 并放置在熒光顯微鏡下觀察. 如圖6 所示， 水凝膠微管發出綠色熒光， 表明IgG 確實被封裝在PEGDA 水凝膠網絡結構中， 形成復合水凝膠. 圖6 內部小圖為復合水凝膠微管的掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope， SEM)圖， 可見粗糙的管狀結構.

圖5 水凝膠微管陣列的加工過程Fig.5 Manufacturing process of micro-tubular hydrogels arrays

圖6 IgG/PEGDA 復合水凝膠微管結構的熒光圖及SEM 圖Fig.6 Fluorescence and SEM image of IgG/PEGDA hydrogel microtubules

為了測試OEP 方法加工復合水凝膠微結構的最小尺寸， 實驗繪制了3 種不同直徑(16.2，13.5， 5.4 μm)的圓形圖像， 分別用于加工復合水凝膠微結構. 實驗采用同一芯片， 聚合時間均為1 min. 實驗加工的凝膠微結構用酒精和去離子水進行清洗后， 放置在熒光顯微鏡下觀察.圖7(a)～(c)分別為3 種水凝膠微結構的光學圖像， 由于去離子水的沖洗作用使得加工的凝膠微結構失去了原有的陣列排布. 圖7(d)～(f)分別為3 種水凝膠微結構的熒光圖， 結果顯示IgG分子被充分地封裝在了交聯的水凝膠微結構中. 圖7(g)～(i)為3 種水凝膠微結構的SEM 圖，3 種結構的直徑分別為 14～16， 11～12， 3～4 μm， 可見加工圖形的直徑略小于施加的光斑圖形的直徑. 比較圖7(g)～(i)可以看出， 利用不同尺寸的光斑圖像， 在相同的聚合時間內凝膠微結構的高度不同， 其中光斑直徑較小時凝膠微結構的長度更長. 這是因為當光斑直徑較小時， 單位時間參與交聯固化的PEGDA 分子較少， 短時間從溶液擴散到電極表面的PEGDA 分子就足以滿足聚合反應， 凝膠結構生長速度較快; 而隨著光斑直徑的增加， 單位時間參與交聯固化的PEGDA 分子增多， 所需要的PEGDA 分子擴散時間也會增加， 凝膠結構的生長速度變慢.總體而言， 凝膠微結構的高度隨著交聯時間的增加而增加， 但其增加速度受到電極表面電勢和PEGDA 分子濃度的影響. 由于聚光鏡和投影儀配置的局限， 本實驗系統可設計的最小有效光斑尺寸為5.4 μm， 所以加工凝膠微結構的最小尺寸為3～4 μm.

圖7 3 種不同尺寸凝膠微結構的光學圖像、熒光圖像和SEM 圖Fig.7 Optical images， fluorescence images and SEM images of 3 different sizes of hydrogel microstructures

3 結束語

本工作提出了一種基于光誘導電聚合原理的IgG/PEGDA 復合水凝膠加工方法. 利用COMSOL 仿真軟件對光誘導電聚合過程的電壓分布進行了仿真研究. 同時， 通過實驗實現了IgG/PEGDA 復合水凝膠的微管和微柱結構加工. 與傳統的PEGDA 水凝膠加工方法相比， 本方法不需要紫外光、光引發劑以及物理光刻掩膜， 而是直接利用光誘導電聚合原理， 通過控制光斑圖形和聚合時間實現多種形狀的水凝膠微結構加工. 盡管只實驗驗證了封裝IgG 的復合水凝膠加工過程， 但本方法同樣適用于其他可電聚合的水凝膠分子和蛋白質封裝.