基于氣相-離子遷移譜對竹燕窩菌湯風味成分的分析

楊 芳,楊 莉,張振宇,肖 嵐,秦 濤,賈洪鋒,*

(1.四川旅游學院食品學院,四川成都 610100;2.四川旅游學院烹飪學院,四川成都 610100)

竹燕窩(Bamboo bird’s nest)是一種非常珍稀的非繁殖性原生食用真菌,又名竹菌、竹菇、竹蓐[1],是在氣候適宜、水分充足、無污染的條件下生長的純天然真菌,且僅在仲秋季節生長在有蟲寄生的竹枝或土壤上。竹燕窩的主要化學成分為蛋白質、脂肪和人體必需的六種氨基酸。竹燕窩的形與味均如燕窩,口感潤滑、清香,集鮮、嫩、脆、爽于一身,營養價值甚高,因此被譽為“植物燕窩”。竹燕窩的生長對生態環境的要求極高,產量非常有限,摘采復雜,生長周期短暫,并且不能進行人工培育。目前,已有研究表明:竹燕窩或其提取物具有抗菌消炎[2]、抗癌[3]等作用,具有極高的藥用價值。國內對竹燕窩的研究主要集中在生長規律觀察[4]、顯微結構和金屬成分分析[5]及調味品方面[6];而國外尚無報道。

食品中揮發性風味成分主要包括:醇類、酯類、醛類、酮類、雜環類等物質[7],通過鼻腔上部的嗅覺上皮細胞感知,揮發性風味是刺激鼻腔內的嗅覺神經細胞而在中樞引起的一種感覺[8],是食品香氣(Aroma)的來源[9]。氣相-離子遷移譜(Gas Chromatograph-Ion Mobility Spectrometer,GC-IMS)是近年來出現的一種新型氣相分離和檢測技術[10],該項技術整合了GC-IMS在分離和檢測方面的優勢,形成具有樣品制備簡單、靈敏度高、高分辨率、操作簡便、分析高效等特點,特別適合于一些揮發性有機化合物(VOCs)的痕量檢測。GC-IMS的應用近年來發展迅速[11]。如:菌類風味檢測[12-13];通過檢測分析植物油VOCs的變化,進行植物油摻假[14]等研究;酒類VOCs的差別進行酒類產地識別[15]、酒類發酵行為[16]及發酵過程中風味變化[17]等研究;肉蛋制品新鮮度[18]等研究;調味品風味檢測分析[19];果蔬及果蔬制品在儲藏等過程中的風味檢測分析[20],等。

目前,尚無竹燕窩菌湯風味成分的研究報道,本研究可彌補這一空白。本研究在前期對微波、電壓力鍋、電磁爐3種熬制工藝優化的基礎上,分別以3種熬制的最佳工藝熬制的竹燕窩菌湯為試驗對象,采用氨基酸自動分析儀和氣相色譜-離子遷移譜(GC-IMS)聯用儀,根據相對氣味活度值(ROAV)和主成分分析法(PCA)對竹燕窩菌湯的風味進行分析,探究不同熬制方式對風味成分變化的影響規律,以期為竹燕窩資源的進一步開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冰鮮竹燕窩 采購于四川宜賓;蒸餾水 自制。

日立L-8800型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司;FlavourSpec?食品風味分析儀 (含CTC自動頂空進樣器、Laboratory Analytical Viewer(LAV)分析軟件、GC×IMS Library Search 軟件及軟件內置的NIST數據庫和IMS數據庫對物質進行定性分析),德國G.A.S公司;WYA阿貝折光儀 上海光學儀器廠有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 冰鮮竹燕窩的預處理 將冰鮮竹燕窩置于冷藏室中解凍后,挑選,清洗,瀝干,粉碎(小于0.2 cm×0.2 cm),備用。

1.2.2 竹燕窩菌湯的制備

1.2.2.1 微波熬制 料液比1∶30 g/mL,熬制時間15 min,熬制火力700 W,所得的菌湯冷卻后過濾,定容至250 mL,密封,編號為WB,待測。

1.2.2.2 電壓力鍋熬制 料液比1∶30 g/mL,熬制時間25 min,所得菌湯冷卻后過濾,定容至250 mL,密封,編號為DYL,待測。

1.2.2.3 電磁爐熬制 料液比1∶30 g/mL,熬制時間70 min,熬制火力300 W,所得菌湯冷卻后,過濾,定容至250 mL,密封,編號為DCL,待測。

1.2.3 三種熬制工藝對竹燕窩菌湯品質的影響

1.2.3.1 水分含量的測定 參照GB 5009.3-2016《食品中水分的測定》直接干燥法測定。

1.2.3.2 固形物溶出率的測定 參照GB/T 12143-2008《飲料通用分析方法》在20 ℃時利用阿貝折光儀測定,計算公式如下:

固形物溶出率(%)=[菌湯中可溶性固形物含量(g/mL)×250(mL)]/[新鮮竹燕窩質量(g)×(1-94.9%)]×100

式中:94.9%為冰鮮竹燕窩的水分含量。

1.2.3.3 游離氨基酸含量的測定 參照國標GB/T 5009.124-2016《食品中氨基酸的測定》進行測定。

1.2.4 氣相-離子遷移譜(GC-IMS)分析方法

1.2.4.1 自動進樣器條件 孵化溫度:60 ℃;孵化時間:30 min;進樣方式:頂空進樣;進樣體積:200 μL;進樣針溫度:65 ℃;加熱方式:振蕩加熱;振蕩速度:500 r/min;不分流;清洗時間:5 min。

1.2.4.2 氣相色譜(GC)條件 色譜柱:FS-SE-54-CB-1;石英毛細管柱(15 m×0.53 mm,0.5 μm);色譜柱溫度:50 ℃;載氣:N2(純度≥99.999%);載氣流速:初始流速0～2、2、2～10、2～20、10～20、20～100、20～30 min、100～150 mL/min;分析時間:30 min。

1.2.4.3 離子遷移譜(IMS)檢測條件 漂移管長度:98 mm;管內線性電壓:500 V/cm;漂移管溫度:45 ℃;漂移氣:N2(純度≥99.999%);漂移氣流量:150 mL/min;放射源:β射線(氚,3H);離子化模式:正離子。平行測定3次。

表1 三種竹燕窩菌湯的游離氨基酸含量

1.2.5 定性定量分析

1.2.5.1 化合物RI值計算方法 通過測試已知保留指數標品(2-丁酮、2-戊酮、2-己酮、2-庚酮、2-辛酮、2-壬酮)的保留時間,經FlavourSpec?自帶的GC×IMS Library Search軟件擬合出保留時間與保留指數RI的關系,再將GC-IMS捕捉到樣品的VOCs的保留時間轉化為保留指數RI。

1.2.5.2 相對氣味活度值(ROAV)的計算 采用相對氣味活度值(ROAV)評價各揮發性風味化合物對樣品總體風味的貢獻,ROAV計算公式如下:

其中:Ci、Ti分別為各揮發性風味化合物的相對百分含量和香氣閾值;Cmax、Tmax分別為樣品中氣味活度值最高成分的百分含量和香氣閾值。

1.2.6 主成分分析(PCA分析) 利用FlavourSpec?自帶的Laboratory Analytical Viewer(LAV)分析軟件中的PCA插件讀取各個VOCs的峰強度值,自動計算得到。

1.3 數據統計

用Excel和Origin軟件對數據進行統計和繪圖,SPSS 22.0對數據顯著性差異進行分析。

2 結果與分析

2.1 三種竹燕窩菌湯固形物溶出率

固形物溶出率對菌湯中營養物質含量的多少有決定作用。由圖1可知,三種熬制工藝的料液比均為1∶30 g/mL,所得竹燕窩菌湯中固形物溶出率最高的為電壓力鍋熬制,為47.6%,且三種熬制工藝竹燕窩菌湯的固形物溶出率有顯著性差異(P<0.05)。原因可能是電壓力鍋熬制相比于微波和電磁爐熬制,在熬制過程中,壓力增大,溫度較高,細胞膜外可溶性固形物濃度比細胞內低,從而促進了細胞膜內的可溶性固形物向膜外擴散,從而提高了竹燕窩中可溶性固形物從細胞內往菌湯中的擴散程度,而使得固形物溶出率增加。

圖1 三種竹燕窩菌湯中固形物的溶出率

2.2 游離氨基酸含量測定

食用菌的滋味是由各種不同呈味的游離氨基酸的平衡及相互影響共同決定的,對其風味具有重要作用。由表1可知,三種熬制工藝均得到16種游離氨基酸,包含7種人體必需氨基酸。游離氨基酸總量、必需氨基酸總量最高的樣品的熬制方式均為電壓力鍋熬制,含量分別為3.87×10-2、1.21×10-2g/kg。原因可能是電壓力鍋熬制的竹燕窩菌湯的固形物溶出率比較高,同時,電壓力鍋熬制時壓力增大,也促進了游離氨基酸往細胞膜外擴散的程度,而使得DYL中游離氨基酸含量升高的緣故。鮮味氨基酸谷氨酸為游離氨基酸中含量最高的氨基酸,說明竹燕窩菌湯鮮味明顯。同時,相對于其他食用菌湯,如羊肚菌湯[21]而言,竹燕窩菌湯的游離氨基酸含量偏低,原因可能是原料冰鮮竹燕窩含水量高達94.9%所致。

2.3 氣相-離子遷移譜(GC-IMS)對竹燕窩菌湯的揮發性風味成分分析

在進行氣相-離子遷移譜(GC-IMS)分析前,將樣品冷至室溫、密封、編號、冷藏。分析時,采用頂空進樣,最大程度地保留竹燕窩菌湯樣品所產生的揮發性有機化合物(VOCs)特征組分,避免由于外界條件如溫度等的波動導致樣品中易揮發物質的損失,以確保分析結果的穩定性和準確性。

2.3.1 竹燕窩菌湯VOCs的GC-IMS二維譜圖 圖2為竹燕窩菌湯樣品的GC-IMS二維譜圖,整個圖背景為藍色,橫坐標1.0處紅色豎線為RIP峰(反應離子峰),縱坐標為GC分離時VOCs 的保留時間(s),橫坐標為IMS分離時VOCs相對于反應離子峰的遷移時間。反應離子峰右側的每一個點代表一種VOCs,藍色為背景,顏色代表物質的濃度,白色表示濃度較低,紅色表示濃度較高,顏色越深表示濃度越大。從圖2中可以看出,不同熬制工藝的竹燕窩菌湯樣品內VOCs可通過GC-IMS很好地分離,且可直觀得出VOCs的差異。從WB到DYL到DCL,有的揮發性風味化合物濃度在增大,有的消失,有的減弱。其中:橙框區域,在微波熬制中濃度較大,電壓力鍋熬制和電磁爐熬制所含揮發性風味化合物的種類相似,但濃度上有差異;白圈區域,僅存在微波熬制的樣品中;紅框區域的化合物在電壓力鍋熬制樣品中種類最多、濃度最高。此外,根據VOCs氣相色譜保留時間和離子遷移時間對VOCs進行二維定性分析。在竹燕窩菌湯樣品中共鑒定出22種VOCs(29個峰22種化合物見表2;另外,未定性的還有30個峰尚需進一步研究)。為了更為直觀對比樣品間VOCs的差異,利用LAV軟件的Gallery Plot插件,自動生成VOCs指紋圖譜(見圖3)。

圖2 竹燕窩菌湯的GC-IMS二維譜圖

圖3 竹燕窩菌湯的GC-IMS指紋譜圖

2.3.2 竹燕窩菌湯VOCs的鑒定 從GC×IMS數據庫中共鑒定出22種VOCs,共29個信號峰。同一種化合物在漂移時間內有多于一個的信號產生(例如:單體、二聚體,甚至聚合物),這些信號或斑點歸因于VOCs通過漂移區時被分析的離子和中性分子之間形成加合物。表2列出了樣品中已定性的VOCs,序號與指紋圖譜一致,包括化合物名稱、CAS編號、分子式、保留指數(RI)、保留時間、遷移時間。由表2可知,竹燕窩菌湯中已定性的22種VOCs分別為醇類8種、醛類9種(二聚體5個)、酮類1種、酸類1種(二聚體1個)、酯類1種(二聚體1個)、雜環類2種。

2.3.3 竹燕窩菌湯VOCs的GC-IMS指紋圖譜 從圖3中可以看出每種樣品的完整VOCs信息以及樣品之間VOCs的差異。每一行代表一個樣品,每個樣品平行測定3次,由該樣品的全部揮發性有機物信號峰組成,每一列為同一保留時間及漂移時間下的有機物(不同樣品中相同的物質)的信號峰。從圖3中VOCs 的離子峰排列可明顯看出,平行測定樣品含有共有VOCs,僅區別于濃度大小,樣品組內具有明顯的相似性,而樣品組間則呈現出明顯的差異。不同熬制工藝下的竹燕窩菌湯的特征風味化合物的差異,可能是由于微波、電壓力鍋、電磁爐3種熬制工藝的熱傳導方式不同,導致竹燕窩菌湯在熬制的過程中,分子碰撞的頻率和概率的不同,從而揮發性風味成分也出現了差異。

表2 竹燕窩菌湯樣品VOCs物質列表

由圖3可知,A框(1～7號化合物)和C框(19～23號化合物)區域內的VOCs在三種菌湯中均存在,濃度上有差異,包括:芳樟醇、(E)-2-辛烯醛、苯乙醇、菠蘿醛、3-甲基丁酸單體;其中苯乙醛、菠蘿醛的含量方面,WB與其余兩種樣品有顯著性差異(P<0.05);B框(8～18號化合物)主要存在于WB中,主要包括:1-辛醇、3-甲基丁酸二聚體;D框(24～34號化合物)主要存在于DCL中,主要包括:2-辛酮、壬醛、辛醛、三甲基吡嗪、庚醛;E框(35～49號化合物)主要存在于DYL和DCL中,主要包括:1-己醇、1-戊醇、己醛、戊醛、1-丁醇、丁醛、乙酸乙酯;在1-己醇、1-戊醇、戊醛單體、1-丁醇、丁醛的含量方面,WB與其余兩種樣品間存在顯著性差異(P<0.05);在己醛、戊醛二聚體、乙酸乙酯的含量方面,三種樣品間均存在顯著性差異(P<0.05);F框(50～58號化合物)主要存在于DYL中,主要包括:2-甲基丙醛、2-丙醇、2-甲基-1-丙醇,其中在2-甲基丙醛、2-丙醇的含量方面,DYL與其余兩種樣品間存在顯著性差異(P<0.05);在2-甲基-1-丙醇的含量方面,三種樣品間均存在顯著性差異(P<0.05);框外的59號化合物糠醇主要存在于WB和DYL中。由此可知,熬制工藝不同,樣品的VOCs亦有明顯差異。

2.3.4 已定性VOCs的含量和種類統計 結合表2和圖4可知,在已定性的VOCs中,醛類化合物含量最高,主要包含:己醛、壬醛、(E)-2-辛烯醛等;其次是醇類化合物,主要有:苯乙醇、1-辛醇等;WB的醛類和醇類化合物在含量上與其余兩種樣品均存在顯著性差異(P<0.05);然后是酯類、酸類和雜環類,酮類含量最低。

圖4 三種樣品中已定性VOCs的對比分析

2.3.5 竹燕窩菌湯樣品關鍵風味化合物分析 由表3可知,當ROAV≥1時,說明該風味化合物為所分析樣品的關鍵風味化合物,且ROAV值越大對樣品總體風味的貢獻也就越大[24]。由表3可知,三種樣品的關鍵風味化合物按貢獻度由大到小依次為,WB:菠蘿醛、壬醛、苯乙醇、2-甲基丙醛、己醛、庚醛、(E)-2-辛烯醛、辛醛、糠醇、乙酸乙酯、戊醛、三甲基吡嗪;DYL:2-甲基丙醛、菠蘿醛、壬醛、己醛、苯乙醇、乙酸乙酯、庚醛、(E)-2-辛烯醛、辛醛、戊醛、糠醇;DCL:壬醛、菠蘿醛、苯乙醇、己醛、2-甲基丙醛、乙酸乙酯、庚醛、辛醛、(E)-2-辛烯醛、戊醛、糠醇、三甲基吡嗪。由此可知,已定性的三種樣品的關鍵風味化合物種類相似,但貢獻度差異較大。所以,三種樣品風味差異明顯。該結果與二維圖譜、指紋圖譜分析結果一致。

表3 竹燕窩菌湯中已定性VOCs的ROAV值列表

結合表2、表3和圖4可知,已定性的VOCs中,以醛類為主,醛類化合物含量最高,且香氣閾值低[25],為竹燕窩菌湯貢獻了主要的風味。比如:具有油脂味、焦香、堅果香的壬醛[26]為DCL的最重要的風味貢獻物質(ROAV=100);此外,該物質對WB(ROAV=60.65)和DYL(ROAV=61.54)的風味貢獻亦較大。具有肉香、醬香的菠蘿醛[27]為WB的最重要風味貢獻物質(ROAV=100),對DYL(ROAV=72.59)和DCL(ROAV=67.51)的風味貢獻亦很大。具有青香的己醛[26]、(E)-2-辛烯醛[28]對三種樣品的風味貢獻亦在ROAV>1的范圍。醇類化合物香氣閾值偏高[29],但含量較高,對竹燕窩菌湯的整體風味也有貢獻。如:具有玫瑰香、花香的苯乙醇[28]對三種樣品的風味貢獻均較大(ROAV均大于28)。具有桔子、玫瑰香氣的1-辛醇[28]對三種樣品的風味均具有修飾作用(ROAV均大于0.10)。酯類化合物普遍具有水果香氣,在3種樣品中均檢測出具有果香氣的乙酸乙酯[28],其中乙酸乙酯對DCL的風味貢獻最大(ROAV=12.63),對WB貢獻最小(ROAV=3.91)。具有酸敗味的3-甲基丁酸[30]對WB和DYL風味僅有修飾作用,對DCL風味影響較小;具有天然木本草味的2-辛酮,對3種樣品風味均僅有修飾作用(ROAV均大于0.10);含SN雜環類化合物閾值較低[31],本文檢測出的具有烤土豆味的三甲基吡嗪[30],對DCL風味貢獻最大(ROAV=1.68),對DYL風味僅有修飾作用(ROAV=0.82)。而含氧雜環糠醇具有溫和的油膩、燒焦氣味[26]對WB風味貢獻最大(ROAV=4.60)。

2.3.6 基于主成分分析(PCA)的竹燕窩菌湯VOCs特征分析 主成分分析(PCA)是一種多元統計分析方法,通過降維,將多個有一定關聯的變量進行線性變換成少數幾個互不關聯的主成分來揭示多個變量間的關系。通常,當累積貢獻率達到60%時,可選擇PCA模型作為分離模型[32]。將竹燕窩菌湯樣品所有VOCs對應的峰面積進行歸一化處理后,計算出各VOCs的峰面積對應的協方差矩陣及特征值和特征向量,再確定主成分,計算相應的貢獻率,PCA分析結果如圖5所示。由圖5可知,PC_1[61%]與PC_2[30%]之和為91%,說明對原始數據進行線性變換和降維時,核心成分有效的保留,分析結果能反映樣品的總體特征。其中PC_1[61%]可將三種熬制工藝所得竹燕窩菌湯樣品進行很好地區分;電壓力鍋熬制所得菌湯樣品的PC_1和PC_2均與微波和電磁爐熬制樣品存在明顯差異,微波和電磁爐熬制的樣品PC_2無明顯差異。該結果與二維圖譜、指紋圖譜和ROAV分析結果一致。以上說明,基于GC-IMS檢測技術,測定竹燕窩菌湯的VOCs,再將VOCs峰面積進行PCA分析,可對不同熬制工藝進行很好地區分。

圖5 竹燕窩菌湯VOCs的PCA分析

3 結論

3種不同熬制工藝制得的竹燕窩菌湯中固形物溶出率、游離氨基酸含量、鮮味氨基酸谷氨酸含量最高的均為DYL。GC-IMS二維圖譜和指紋圖譜中,3種不同熬制工藝制得的樣品揮發性風味成分的種類和含量差異較大,關鍵風味化合物對3種菌湯整體風味貢獻度差異明顯。已定性的VOCs中,以醛類、醇類化合物為主,其中醛類化合物對竹燕窩菌湯的整體風味貢獻最大。PCA分析中,3種菌湯樣品分布在不同區域,根據PC_1[61%]可將3種樣品進行很好地區分。由此可知,不同熬制工藝代表不同的熱傳導方式,傳熱方式的不同,菌湯中固形物溶出率、游離氨基酸的含量有明顯差異,所產生的揮發性風味成分亦不同。綜上,根據GC-IMS聯用技術,通過檢測揮發性風味成分,對竹燕窩菌湯的不同熬制工藝進行區分是可行的。同時,由于IMS數據庫尚在不斷完善過程中,所以,尚未能完全鑒別出竹燕窩菌湯的所有特征風味化合物,未定性的30個峰還需進一步研究。