響應面優化梔子果實不同部位油脂提取工藝及其脂肪酸分析

劉嘉琪,楊 濤,繆芝碩,祝廷輝,鄺 鼎,陳建榮,唐偉卓,*

(1.長沙學院 生物與環境工程學院,湖南長沙 410022;2.湖南海泰博農生物科技有限公司,湖南岳陽 414400)

梔子為茜草科植物梔子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果實,是我國傳統常用中藥材,為歷版中華人民共和國藥典所收載[1]。傳統記載,梔子具有降壓止血、瀉火除煩、清熱解毒等作用[2]。文獻報道,梔子果實中含有大量油脂類成分,不飽和脂肪酸含量可達 80%[3]。梔子油脂具有多種藥理活性,包括保肝、抗氧化、中樞神經改善等[4-7]。成熟梔子果實的果皮(Gardeniajasminoidespericarp)和果肉(Gardeniajasminoidespulp)容易分離,有關二者分別入藥使用的記載也較早。如《本經》記載“梔子仁功善清心除煩,梔子皮則兼清表熱”[8]。因此,對梔子果皮和果肉不同部位開展相關化學研究,可為梔子資源的綜合開發和利用提供參考。

響應面法(Response surface methodology,RSM)是近年來廣泛應用的一種實驗條件優化的方法,包括了實驗設計、模型建立、模型驗證等步驟。該方法通過合理的實驗設計以及多元二次回歸方程擬合分析,同時借助直觀等高線圖和三維立體圖分析各變量之間的交互作用,最終實現各因素水平的最優組合[9]。近年來,越來越多的文獻報道了采用響應面法優化提取植物類油脂[10-15]。目前,有關梔子果實全果的油脂提取工藝和脂肪酸分析研究較多,包括了亞臨界提取法[16]、超聲提取法[17]、超臨界提取法[18]等。但是,有關梔子不同部位油脂提取工藝的優選研究報道有限。作為一種新型的提取方法,超聲輔助提取技術已經廣泛應用于植物中油脂類化合物的提取[19-21]。該技術是利用超聲波的機械效應、空化效應和熱效應促進油脂類成分的溶出,從而達到快速、高效提取的目的。與傳統的油脂提取技術相比(如浸提法、壓榨法),超聲輔助提取技術具有操作簡易、提取率高、節能環保等優點[22-23]。

本文以石油醚為提取溶劑,考察采用超聲波提取梔子果皮、果肉兩個不同部位油脂的工藝。通過單因素實驗和響應面法對其工藝進行優化,利用GC-MS技術對梔子不同部位油脂進行脂肪酸含量測定,旨在為梔子油脂的綜合利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

“林海1號”梔子果實 由湖南海泰博農有限責任公司提供,經長沙學院陳建榮副教授鑒定為茜草科植物梔子的干燥成熟果實,藥材現存放于長沙學院小分子天然藥物研究室;石油醚(60～90 ℃)、甲醇 均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司;脂肪酸標準品(純度>98%) 青島科創質量檢測有限公司。

ThermoFisher Trace 1310 ISQ氣相色譜質譜聯用儀 賽默飛世爾科技公司;TMT-3 型電子天平 湖南湘儀天平儀器設備有限公司;RE-52AA型旋轉蒸發器 上海榮生化儀器有限公司;103B型高速中藥粉碎機 瑞安市永利制藥機械有限公司;HWS-28型電熱恒溫水浴鍋 上海恒科學儀器有限公司;101A-2B型電熱鼓風干燥箱 上海實驗儀器廠股份有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵 鞏義市英峪予華儀器廠;KQ-100DE臺式數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理 取“林海1號”梔子干果,除去其中碎殼及質量不佳的梔子,按皮、肉分離后粉碎過60目篩,備用。

1.2.2 梔子油脂的提取 參照文獻[24]報道方法,分別稱取一定量的干燥樣品粉末于三角瓶中,加入一定量的石油醚溶劑后置于超聲波清洗器中進行超聲提取。提取完成后,過濾、轉入圓底燒瓶,將溶劑旋轉蒸發完全,得梔子油脂提取物,烘干至恒重后,稱重,計算提取率,計算公式如下:

1.2.3 單因素實驗 取預處理后的實驗材料進行單因素實驗,考察各因素對油脂得率的影響情況,單因素水平實驗表如表1所示。各單因素實驗中其它固定因素水平如下。

1.2.3.1 料液比對梔子不同部位油脂得率的影響 采用1.2.2項下方法,考察料液比對梔子不同部位油脂得率的影響。提取條件為:固定超聲功率400 W,提取時間30 min,考察不同料液比(1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14 g/mL)對梔子不同部位油脂得率的影響,進而確定最佳的料液比。

1.2.3.2 超聲功率對梔子不同部位油脂得率的影響 采用1.2.2項下方法,考察超聲功率對梔子不同部位油脂提取率的影響。提取條件為:固定料液比1∶10 g/mL,提取時間30 min,考察不同超聲功率(240、280、320、360、400 W)對梔子不同部位油脂得率的影響,進而確定最佳的超聲功率。

1.2.3.3 提取時間對梔子不同部位油脂得率的影響 采用1.2.2項下方法,考察提取時間對梔子不同部位油脂提取率的影響。提取條件為:固定料液比1∶10 g/mL,超聲功率400 W,考察不同提取時間(30、45、60、75、90 min)對梔子不同部位油脂得率的影響,進而確定最佳的提取時間。

表1 單因素水平實驗表

1.2.4 梔子油脂提取響應面優選試驗 根據單因素實驗結果,基于響應面實驗設計方法中Box-Behnken Design原理,每個因素取三個水平,以油脂得率為響應值,確定超聲提取梔子不同部位油脂的實驗設計方案,具體響應面分析試驗因素水平如表2所示。

表2 響應面法因素水平設計

1.2.5 梔子油脂提取前后樣品電鏡分析 為研究超聲法對梔子油脂提取的作用機制,對梔子不同部位樣品油脂提取前后進行掃描電鏡實驗。梔子果皮、果肉提取前后樣品經干燥后,外表涂漬金粉,于500倍放大率下進行顯微拍照。

1.2.6 梔子油脂脂肪酸GC-MS分析

1.2.6.1 樣品甲酯化 稱取1.0 g油脂樣品于圓底燒瓶中,加入2 mL 5%氫氧化鉀-甲醇溶液,放置于40 ℃水浴中反應 20 min。待反應完成后,冷卻至室溫,加入2 mL 正己烷溶解,并轉移到10 mL容量瓶中定容。靜置24 h吸取上層有機相,經0.45 μm濾膜過濾,待測。

1.2.6.2 氣相色譜條件 色譜柱:TG-5MS(30 m×0.25 mm×0.25 μm);載氣為高純氦氣(99.999%),載氣流速1.2 mL·min-1。升溫程序:初始溫度設為80 ℃,保持 1 min,然后以10 ℃·min-1的速率升溫到200 ℃,繼續以5 ℃·min-1升溫到250 ℃,最后以2 ℃·min-1的速率升到270 ℃,保持3 min;進樣口溫度為290 ℃;樣品進樣量1 μL。

1.2.6.3 質譜條件 采用EI離子源;離子源溫度280 ℃;溶劑延時5 min;電子能量70 eV;掃描范圍為30～400 amu;分辨率為1000。

對上述檢測的色譜峰采用NIST05標準譜庫對分析的樣品進行峰匹配,逐一對應進行定性分析,采用面積歸一法進行定量分析。

1.3 數據處理

采用Excel 2016軟件處理對單因素實驗數據進行分析,采用Design Expert 10軟件進行響應面優化實驗設計和數據分析。

2 結果與分析

2.1 梔子不同部位油脂提取單因素實驗結果

2.1.1 料液比的優選 按照1.2.3.1項下方法進行實驗,不同料液比對梔子不同部位油脂得率結果見圖1。由圖1可知,料液比對梔子不同部位油脂得率有明顯影響。二者油脂得率隨著料液比的增加呈現先上升后下降的變化。其中,果肉油脂得率下降的趨勢更明顯,但兩者在料液比為1∶12 g/mL時油脂得率均達到最高。進一步增大料液比,得率開始下降。分析原因,這可能與料液比過大,溶劑量增加,樣品濃度更稀,局部區域的超聲波效應減小有關[24]。綜合上述結果,選擇料液比1∶10、1∶12、1∶14 g/mL進行后續響應面優化試驗。

圖1 不同料液比對梔子果皮(A)、果肉(B)油脂得率的影響

2.1.2 超聲功率的優選 按照1.2.3.2項下方法進行實驗,不同超聲功率對梔子不同部位油脂得率結果見圖2。由圖2可知,梔子不同部位油脂得率整體上隨超聲功率的增加而上升,在360 W時達到最大值,隨后開始下降。分析原因可能是超聲功率較小時,對梔子油脂顆粒破壞越小,提取效果越差。而超聲功率過大,聲壓幅值過高,易導致空化泡在聲波壓縮期內破裂不足,影響空化效果。綜合上述結果,選擇超聲功率 320、360、400 W進行后續響應面優化試驗。

圖2 不同超聲提取功率對梔子果皮(A)、果肉(B)油脂得率的影響

2.1.3 提取時間的優選 按照1.2.3.3項下方法進行實驗,不同提取時間對梔子不同部位油脂得率結果見圖3。由圖3可知,采用超聲波法提取梔子果實不同部位油脂性成分,梔子油脂的得率隨提取時間的增加而升高,而后逐漸降低,在45 min 時提取率達到最高。分析原因,可能是過長的超聲提取時間會導致梔子油脂顆粒破裂分散,降低得率[24]。綜合上述結果,選擇提取時間 30、45、60 min進行后續響應面優化試驗。

圖3 不同提取時間對梔子果皮(A)、果肉(B)油脂得率的影響

2.2 梔子不同部位油脂提取響應面試驗結果

2.2.1 響應面法分析結果 在確定料液比(A)、超聲功率(B)和提取時間(C)三個因素水平的基礎上,基于Box-Behnken Design實驗設計原理,以梔子不同部位油脂得率為響應值,進行分組實驗,記錄每組因素各水平組合的實驗結果,實驗結果見表3。

表3 響應面實驗設計與結果

利用Design Expert 8.0.6軟件對表3中的數據進行分析,計算各項回歸系數,建立數學回歸模型,最終得到梔子果皮(Y1)和果肉(Y2)不同部位油脂得率的二次多項回歸方程如下:

Y1=-8.39400+0.64475A+0.034606B+0.019150C-6.25000×10-4AB+3.33333×10-4AC-2.91667×10-5BC-0.017437A2-3.57812×10-5B2-1.43333×10-4C2

Y2=-173.46375+13.12812A+0.62341B+0.12200C-8.12500×10-4AB-2.25×10-3AC-1.25×10-5BC-0.52687A2-8.42187×10-4B2-7.77778×10-4C2

方程式中:A表示料液比,B為超聲功率,C為提取時間。進一步對上述回歸擬合方程進行方差分析,得到結果如表4所示。

表4 響應面試驗方差分析

由表4可以看到,兩個回歸模型P值都小于0.05,說明模型影響均顯著。而從其失擬項來看均不顯著,說明預測值與實驗值之間有較好的相關性,提示回歸方程的預測值和實驗值誤差較小。因此,可以采用該模型進行梔子油脂超聲提取實驗的理論預測。進一步從各因素的P值分析,梔子果皮油脂提取實驗中,A2、B2對應的P值小于0.05,說明其對梔子油脂的得率影響顯著;梔子果肉油脂提取實驗中,A2、B2所對應的P值小于0.01,說明其對梔子油脂得率的影響極顯著。另外,液料比和超聲功率交互作用對梔子果皮油脂得率的影響達到了顯著水平(P<0.05)。值得注意的是,本實驗中所涉及到的3個因素對梔子果皮油脂得率影響大小順序依次為料液比(A)>提取時間(C)>超聲功率(B);而這3個因素對梔子果肉油脂得率影響大小順序依次是提取時間(C)>超聲功率(B)>料液比(A)。

2.2.2 響應面數據分析及工藝優化 利用Design-Expert 8.0.6.1軟件分別對上述回歸方程作3D曲面圖和2D等高線圖,見圖4、圖5。各圖形能夠直觀地反映出各因素之間的交互作用以及各因素和響應值之間的關系。一般的,由等高線的形狀可以判斷各因素之間的交互作用是否顯著:圓形表示不顯著,橢圓形或馬鞍形表示顯著。由圖4、5可知,梔子果皮、果肉油脂提取實驗中所呈現的各因素之間交互作用不同。梔子果肉油脂提取實驗中,料液比(A)和超聲功率(B)等高線圖呈明顯的橢圓形,表明兩因素間交互作用較顯著,而梔子果皮油脂提取實驗中,這兩個因素間交互作用不明顯;另外,在梔子果肉油脂提取實驗中,料液比(A)和提取時間(C)、超聲功率(B)和提取時間(C)的等高線圖呈圓形,表明上述兩對因素間交互作用不明顯。

圖4 各因素對梔子果皮油脂提取率交互作用的等高線和響應面圖

圖5 各因素對梔子果肉油脂提取率交互作用的響應面和等高線圖

從響應曲面圖分析來看,梔子不同部位油脂提取實驗中,油脂的得率受液料比的影響較大,超聲功率對得率的影響較小。由AC兩因素響應曲面圖可以看出,梔子油脂得率隨提取時間和料液比的變化呈先升高后降低的趨勢。由BC兩因素響應面曲面圖可得,當超聲功率一定,梔子油脂得率隨著提取時間的增大而增大,隨后有所下降。而當提取時間一定時,隨著超聲功率的增大,油脂得率增加到一定的程度后逐漸降低。為了獲得超聲提取梔子油脂的最佳工藝參數,令回歸方程Y1和Y2等于0并對方程中的自變量分別求偏導,得到梔子果皮油脂的最佳工藝條件為:料液比1∶13.41 (g/mL)、超聲功率320 W、超聲時間60 min;梔子果肉油脂的最佳提取工藝為:料液比1∶12.05 (g/mL)、超聲功率363.83 W、超聲時間58.02 min。

2.2.3 最佳工藝驗證實驗 為檢驗上述回流提取工藝條件的可靠性,在最佳工藝條件下進行3次驗證實驗,結果取平均值。考慮實際操作的方便和可行性,將最佳提取工藝參數調整為:梔子果皮:料液比1∶13 g/mL、超聲功率320 W、提取時間60 min。梔子果肉:料液比1∶12 (g/mL)、超聲功率360 W、提取時間58 min。在此要求及工藝條件下,梔子果皮和果肉油脂的得率可達到2.36%和22.60%。該結果與理論預測值接近,說明運用響應面分析法提供的模型準確可靠。

2.3 梔子不同部位油脂超聲提取電鏡結果分析

為了更好地了解超聲提取對梔子不同部位油脂的提取機制,分別對梔子果皮、果肉超聲提取前后的樣本進行了SEM實驗。從圖6可以看出,提取前后,梔子果皮和果肉細胞出現了明顯的變化。超聲提取前,梔子果皮和果肉細胞外面呈光滑狀,排列比較平整。提取后,果皮細胞和果肉細胞均呈現了不同程度的破裂,尤其是果肉細胞更為明顯。上述現象表明,超聲促使了梔子果皮和果肉細胞的快速破裂,促進油脂性成分的溢出,有利于石油醚提取。

圖6 梔子不同部位油脂超聲提取前后電鏡結果分析圖

2.4 梔子果皮和果肉油脂性成分的GC-MS分析結果

結合上述梔子不同部位油脂的提取實驗結果,對制備的梔子不同部位油脂樣本進行GC-MS實驗,采用峰面積歸一化法對其含量進行分析。

梔子不同部位油脂樣品測定的總離子流色譜圖如圖7,各部位油脂的脂肪酸組成及相對含量分析見表5。

表5 梔子不同部位油脂脂肪酸組成及相對含量分析

圖7 梔子果皮(A)和梔子果肉(B)油脂GC-MS總離子流色譜圖

由表5可知,梔子果肉油脂中共檢測到13種不同脂肪酸成分,主要含有亞油酸、油酸和棕櫚酸3種脂肪酸。其中,不飽和脂肪酸的相對含量達到75.97%,以油酸為主(21.90%)和亞油酸為主(52.70%)。另外,梔子果肉油脂中飽和脂肪酸相對含量為24.03%,主要以棕櫚酸為主(17.90%);從梔子果皮油脂中共檢測到19種脂肪酸成分,其主要脂肪酸類型和梔子果肉油脂類似,主要含有油酸、亞油酸和棕櫚酸。其中不飽和脂肪酸相對含量為69.22%,比果肉部位偏低,以亞油酸(44.80%)和油酸(13.55%)為主。但是,梔子果皮油脂中飽和脂肪酸相對含量為30.82%,要高于梔子果肉部位,主要以棕櫚酸為主(21.80%)。另外,值得注意的是,梔子果皮部位油脂中檢測出一定量的α-亞麻酸(9.58%),而梔子果肉部位油脂中α-亞麻酸的含量僅有0.95%。上述結果從脂肪酸組成角度揭示了梔子果皮和梔子果肉不同部位油脂性成分存在一定的差異性。

3 結論

本文以石油醚為提取溶劑,利用Box-Behnken響應面法優選超聲提取梔子不同部位油脂的最佳工藝條件。結果得出,梔子果皮油脂的最佳提取工藝為:料液比1∶13 (g/mL)、超聲功率320 W、提取時間60 min;梔子果肉油脂的最佳提取工藝為:料液比1∶12 (g/mL)、超聲功率360 W、提取時間58 min。在上述條件下,梔子果皮和果肉油脂的得率可達到2.36%和22.60%。另外,對梔子果皮和果肉油脂GC-MS分析結果顯示,二者的脂肪酸數量和含量存在一定的差異。梔子果肉油脂中共檢測到13種脂肪酸成分,而梔子果皮油脂中共檢測到19種脂肪酸成分。從主要成分含量上分析,梔子果肉油脂中不飽和脂肪酸的相對含量達到75.97%,以油酸為主(21.90%)和亞油酸為主(52.70%)。梔子果皮油脂中不飽和脂肪酸的相對含量較梔子果肉部位偏低(69.22%),以油酸為主(13.55%)和亞油酸為主(44.80%)。但是,梔子果皮油脂中飽和脂肪酸的含量要高于梔子果肉部位。另外,還發現梔子果皮油脂中存在一定量的α-亞麻酸成分,而梔子果肉油脂中含量偏低。上述結果為梔子不同部位油脂的綜合利用和開發提供一定的參考。值得思考的是,梔子不同部位油脂性成分的差異與梔子傳統分部位入藥的聯系究竟如何？梔子不同部位中非油脂性成分是否也存在較大差異？上述兩大類成分的區別與梔子不同部位的藥理活性的關聯如何？這些問題有待后續進一步研究。