核酸檢測在豬病檢測中的常見問題與分析

孫華偉 ，郭 靜 ，張敬峰 ，李 彬 ，張小飛 ＊

（1.江蘇省農業科學院獸醫診斷檢測重點實驗室，江蘇 南京 210014；2.安徽省定遠縣畜牧獸醫局，安徽 滁州 233200）

核酸檢測依然是病原學診斷的金標準，其病原學證據是無可替代和不容置疑的。在豬病的核酸檢測中，假陰性問題及豬群出現疑似感染卻遲遲檢測不到病原體的情況普遍存在，具體分析如下：

1 新病毒的確認時間周期長

自武漢暴發新型冠狀病毒肺炎以來，病毒這個專業術語迅速普及，可以說如今已成為家喻戶曉，婦孺皆知的日常用語了。但在20世紀之前，巴斯德、科赫等人提出的細菌致病學說占據主流，人們只知道傳染病皆由細菌或其毒素引起，并不知道“病毒”的存在。一個新病毒的出現，從分離到基因全序列測定、確認需要較長的時間周期，僅僅是發現第一個病毒，就花了41年的時間。部分豬病毒病的發現歷程見圖1。

較長一段時間以來，江蘇省農科院獸醫診斷檢測中心在接診的臨床病例中發現：豬群出現疑似病毒感染，但經實驗室檢測，常規的 ASFV、PRRSV、CSFV、PRV、PCV等病毒核酸的檢測結果均為陰性，說明這些豬群可能存在新的未知病毒，只是限于目前的檢測水平，尚不能確認是何種病毒。

2 采集的待檢樣品不合格

根據國家衛健委發布的第七版新冠肺炎診療方案，從CoVID-19的樣品采集可以看出，樣品采集對檢測結果的影響很大，不少患者到第3次，甚至是第5次才出現陽性，后經比對發現，樣品采集的日期或部位對檢測結果存在很大影響。同樣的道理，對豬群進行血樣采集時，盡量采集發病后7 d內的急性期抗凝血，而不是在豬群發病后2周才進行血樣采集。采集內臟組織時，盡量采集腫大的脾臟和腫大的淋巴結。

3 核酸提取效果差

3.1 選擇正規廠家的核酸提取試劑盒

江蘇省農科院獸醫診斷檢測中心通過對多家核酸提取試劑盒進行比較發現：不同試劑盒對核酸提取的效果差異顯著。在選擇不同廠家的試劑盒時，酶的活性、變性液的質量、吸附柱的吸附效果及溶解液的溶解效率對樣品核酸物質的提取效果影響很大。因此，在選擇核酸提取試劑盒時盡量先用標準物質進行驗證，而不能貪圖便宜，選擇質量沒有保證的試劑盒。

3.2 使用核酸濃度分析儀

由于核酸在波長 260 nm處有最高吸收峰，蛋白質的吸收高峰在280 nm波長處，因此，A260/A280是核酸純度的指示值。純度好的DNA或RNA，A260 / A280的比值應該介于2.0～2.5。純凈的樣品比值大于1.8（DNA）或者2.0（RNA）。如果比值低于1.8 或者2.0，說明提取的核酸純度較低，表示可能有鹽離子或者有機試劑污染[1]，需要純化樣品。見圖2和圖3。

江蘇省農科院獸醫診斷檢測中心在使用不同廠家的試劑盒進行核酸提取后發現：不同廠家試劑盒對同一樣品進行核酸提取時，核酸提取效果差異很大，部分廠家的核酸提取試劑盒在對標準物質進行核酸提取后，核酸濃度很低。建議實驗室自行對不同的核酸提取試劑盒進行比對分析，篩選出質量穩定、適合本實驗室的核酸提取試劑盒。

4 小結

對于疫病診斷，最重要的是以最快速度做出明確診斷，這樣才能為后續的治療以及防控提供重要依據與基礎。通過實驗室檢測，密切監測病原體在豬群中的感染趨勢和帶毒量，對豬場快速、高效防控起到至關重要的作用。但實驗室檢測是一個系統工程，絕非招聘幾個檢測人員、買幾臺儀器這么簡單，因地制宜地制定樣品采集方案，操作規范，試劑盒質量可靠，監督環節不缺失等，是輸出合格檢測結果的重要保障。