果膠、BSA及殼寡糖相互作用及對BSA負載效果的影響

范麗萍，張立彥，陳列歡

（1.嘉應學院生命科學學院，廣東 梅州 514015；2.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640；3.仲愷農業工程學院動物科技學院，廣東 廣州 510225）

由于蛋白質或肽類功能食品或藥物在胃腸道環境中耐受性差，易變性或降解[1]，且不易在腸部吸收，不能實現靶向或定點釋放，降低其功能性或治療效果。蛋白質或肽作為兩性電解質，可以通過靜電作用與易解離的高分子聚合物形成聚電解質復合物（polyelectrolyte complexes，PEC），實現包埋或負載，以改善其耐受性、穩定性及易吸收性[2]，成為近年來研究的熱點。例如，殼聚糖（chitosan，CS）可與聚陰離子聚合物形成具有pH敏感性、酶敏性的PEC[3-5]，用于蛋白質或肽類等的包埋及負載，實現其在胃腸道內的輸送及控釋。其水解產物殼寡糖（chiooligosaccharide，COS）（聚合度2～20）也具有CS類似的解離性質，但具有比CS更好的水溶性、生物降解性、低溶血活性以及低細胞毒性等特性[6]，與果膠形成的復合物pH敏感性更高，適應的pH值范圍更寬[7]，因此比CS更適合作為載體使用，受到越來越多的關注[8-9]。

目前，關于蛋白質負載的方法有溫孵式和并入式2 種[10]。在多組分體系及靜電復合作用為主的情況下，同性電荷組分間的競爭作用普遍存在，顯著影響目標物的結合效率及包埋效果[11]。目前的研究多以探討陰、陽離聚電解質相互作用及復合條件影響為主[12-16]，并未考慮多組分體系內蛋白質與同性電荷分子組分間的相互作用，以及對負載效果的影響。

基于上述，本實驗選取COS、果膠及其復合物為負載載體，牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）為負載蛋白質模型，探討不同復合方式下上述物質二元及三元復合物顯微狀態及超微結構、分子間作用及BSA復合率和負載率，考察果膠、COS、BSA分子間的相互作用及對BSA負載效果的影響，為探究果膠及COS復合物負載BSA的機制及效果奠定研究基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

COS（平均分子質量1.2 kDa，脫乙酰度90.14%）浙江金殼生物化學有限公司；果膠（P9135-100G，半乳糖醛酸含量不少于74.0%，酯化度66.7%） 美國Sigma-Aldrich公司；BSA 上海伯奧生物科技有限公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

PHS-25 pH計 上海雷磁儀器廠；BS224S分析天平 德國賽多利斯集團；TGL-16超速離心機 上海安科儀器有限公司；SHA-BA恒溫振蕩器 常州澳華儀器有限公司；LGJ-10冷凍干燥機 北京松源華興科技發展有限公司；Model752紫外-可見分光光度計 上?，F科分光儀器有限公司；CX31型光學顯微鏡 日本Olympus公司；Tensor 37傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）儀 德國Bruker公司；COXEM EM-20臺式掃描電鏡 韓國Coxem公司。

1.3 方法

1.3.1 COS、果膠及BSA二元及三元PEC的制備

1.3.1.1 果膠/BSA靜電復合溶液的制備

室溫下，向含有NaCl、質量濃度為2.5 mg/mL的果膠溶液中加入一定體積pH 3.5、25 mg/mL BSA溶液，振蕩均勻，使最終復合溶液中果膠質量濃度為2 mg/mL、NaCl濃度為30 mmol/L，BSA質量濃度為5 mg/mL，pH值為3.5。該方法簡記為“果膠＋BSA”。

1.3.1.2 COS/果膠復合溶液制備

室溫下，向含有NaCl、質量濃度2.5 mg/mL的果膠溶液中加入一定體積的pH 3.5、10 mg/mL的COS溶液，振蕩均勻，使最終復合溶液中果膠和COS的質量濃度分別為2 mg/mL和1.2 mg/mL，NaCl濃度為30 mmol/L，pH值為3.5。方法簡記為“果膠＋COS”。

1.3.1.3 COS＋BSA混合溶液制備

室溫下，向pH值為3.5，25 mg/mL的BSA溶液中加入一定體積的pH 3.5、10 mg/mL的COS溶液，調整溶液體積、pH值并振蕩均勻，使最終復合溶液中BSA和COS的質量濃度分別為5 mg/mL和1.2 mg/mL。方法簡記為“COS＋BSA”。

1.3.1.4 COS、果膠及BSA三元復合溶液的制備

果膠＋BSA＋COS：向含有NaCl、pH 3.5、質量濃度為2.5 mg/mL的果膠溶液中加入一定質量濃度25 mg/mL的BSA溶液，振蕩均勻后再加入一定體積pH 3.5、質量濃度為10 mg/mL的COS溶液，振蕩均勻。最終復合溶液中果膠的質量濃度為2 mg/mL，NaCl濃度為30 mmol/L，BSA質量濃度為5 mg/mL，COS質量濃度為1.2 mg/mL，pH 3.5。

COS＋BSA＋果膠：取一定體積、pH 3.5、質量濃度為10 mg/mL的COS溶液與BSA溶液（25 mg/mL，pH 3.5）均勻混合后，加入質量濃度為2.5 mg/mL的果膠溶液（pH 3.5），振蕩均勻。

COS＋果膠＋BSA：將上述COS/果膠復合溶液高速離心（8 000 r/min），沉淀經冷凍干燥后浸泡于pH 3.5、5 mg/mL的BSA溶液中，30 min后取出復合物，瀝凈溶液，再次凍干后備用。

以上復合方式下，各物質濃度條件是在前期研究中得出的較穩定復合條件，復合溶液體系中果膠、COS及BSA、NaCl的濃度均一致，僅比較不同復合順序對三物質分子間相互作用的影響，不考察Na＋、Cl－對3 種大分子物質間相互作用的影響。

1.3.2 溶液濁度的測定

將復合溶液振蕩10 s后，在600 nm波長處測定透光度T，并計算溶液濁度：

1.3.3 復合溶液狀態觀察

將試管中的復合溶液振蕩15 s混勻，拍照記錄溶液中復合物的宏觀狀態。復合溶液振蕩15 s后，滴加在載玻片上，利用光學顯微鏡觀察溶液及微粒的微觀狀態（放大40 倍），并拍照對比。

1.3.4 PEC得率的計算方法

COS/果膠溶液PEC得率計算：將COS/果膠復合溶液于磁力攪拌器上攪拌2 h，高速離心（8 000 r/min）后取沉淀，凍干。PEC得率按下式計算[17]：

負載BSA的PEC得率計算：將各復合方式所得PEC高速離心分離，收集沉淀物并冷凍干燥，得率按下式計算：

1.3.5 PEC對BSA的負載率及BSA復合率計算

將不同復合方式所得溶液進行離心（8 000 r/min）分離，采用雙縮脲法測上清液中BSA溶液的濃度。PEC對BSA的負載率及BSA復合率按下式計算[17]：

1.3.6 PEC掃描電鏡觀察

將果膠、COS、BSA及各PEC貼在樣品臺上，噴金后用掃描電鏡觀察表觀形態并拍攝照片。

1.3.7 果膠、COS、BSA及各PEC的FTIR測定

取適量果膠、COS、BSA及各PEC凍干物，粉碎后直接壓片測定其FTIR。

1.4 數據處理及分析

采用Microsoft Excel 2007軟件求取實驗數據，采用SPSS 19.0軟件的新復極差分析法Duncan比較各處理間差異的顯著性（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 果膠、COS及BSA不同復合方式所得溶液的濁度比較

COS與CS類似，在pH值低于6.2時分子中的氨基質子化形成—NH3＋，可與果膠分子上的—COO－通過靜電相互作用自組裝形成PEC[18]。而BSA在其等電點（pI 4.7）以下的溶液中帶正電荷，也可與果膠發生自組裝形成PEC[19]。

圖1 不同復合方式下溶液的濁度Fig. 1 Turbidities of complex solutions complexes obtained with different methods

由圖1可以看出，復合方式對溶液濁度及狀態有較大影響，各溶液狀態及濁度差別很大。果膠與BSA復合后溶液呈乳白色膠體狀態（果膠＋BSA），濁度最高。而COS與BSA所形成的溶液澄清透明（COS＋BSA），濁度在10以下，這是因為pH 3.5條件下兩者都帶正電而未發生復合反應。果膠與BSA復合后再添加COS（果膠＋BSA＋COS），所形成的復合溶液呈淡黃色（受COS顏色影響），溶液濁度與果膠＋BSA差異不顯著（P＞0.05），溶液靜置后PEC會沉淀析出。COS與BSA混合后再與果膠復合（COS＋BSA＋果膠），所形成的復合溶液濁度顯著低于果膠＋BSA（P＜0.05），與果膠＋BSA＋COS的濁度值差別不大（P＞0.05），但溶液狀態差異較大。在本研究條件下，果膠與COS復合后形成納米級極微小顆粒，溶液呈半透明膠體狀態。

2.2 不同復合溶液及微粒顯微狀態比較

由圖2可知，果膠與BSA形成的PEC呈尺寸較小的不規則顆粒，伴有少量大塊團聚物，尺寸在微米級（COS＋BSA為澄清溶液，顯微鏡下無法觀察其微觀狀態，因此未列出）。果膠與BSA復合再加入COS后，PEC聚集成顏色較深、結構較致密、尺寸更大的不規則微米級顆粒。分析原因，在pH 3.5、NaCl濃度為30 mmol/L時，BSA帶正電荷，果膠分子帶部分負電荷且分子鏈剛性較小，易卷曲、折疊[20]，可包裹橢圓形BSA形成較小的顆粒。果膠在與BSA形成PEC后再加入COS時，COS中的—會與顆粒表面果膠分子中游離—COO－結合，并使PEC顆粒團聚，形成較大的三元PEC。同時，鏈狀COS也有可能與表面的BSA競爭果膠分子上的作用位點，使果膠分子拉長，三元PEC顆粒變大。COS＋BSA＋果膠形成的PEC顆粒不均勻，有較大團塊出現，且結構較致密，與圖1中顯示的溶液宏觀狀態相對應。COS與果膠復合溶液中觀察不到明顯的PEC，此時PEC微粒太小，而有些則可能是水溶性的[21]。

圖2 不同復合方式下所得復合體系的微觀狀態Fig. 2 Microscopic morphology of complexes obtained with different methods

2.3 復合方式對BSA負載效果的影響

圖3 不同復合方式下BSA的負載率、復合率和PC得率Fig. 3 Loading and complexation rates of BSA and yield of BSA-loading PEC obtained with different methods

由圖3可知，果膠＋BSA復合時BSA負載率最高，為44.96%，其他3 種復合方式下負載率均較低且無顯著性差異（P＞0.05）。不同復合方式下BSA參與復合的復合率差異顯著（P＜0.05），高低順序為果膠＋BSA＞果膠＋BSA＋COS＞COS＋BSA＋果膠＞果膠＋COS＋BSA。COS＋BSA＋果膠和COS＋果膠＋BSA方式PEC得率最高且無顯著性差異（P＞0.05），果膠＋BSA＋COS時得率明顯降低（P＜0.05）。

果膠＋BSA方式下，BSA負載率和復合率最高，表明果膠分子與BSA結合非常充分，但再添加COS之后（果膠＋BSA＋COS），BSA負載率和復合率、PEC得率都明顯降低，說明PEC上部分BSA被COS替代，COS會與BSA競爭結合PEC表面的果膠分子。

COS＋BSA＋果膠方式下BSA復合率和負載率較前2 種方式都有所下降，由此可推測小分子且電荷密度較高的COS更易占據果膠分子上的負電荷基團位點，優先結合果膠。此方式下PEC得率較高的原因可能是因為COS為直鏈分子，與果膠形成的PEC為網狀或鏈狀，分子較展開[7]，暴露的游離—COO－較果膠＋BSA中PEC多（BSA為橢圓狀分子，與果膠形成的PEC顆粒較小[22]（圖2），果膠分子卷曲包裹，游離的—COO－易被包埋），更易于再進一步結合COS或BSA而使PEC得率提高。

果膠/COS的PEC凍干后結構致密、不易解離，BSA主要吸附在果膠/COS的PEC結構上[16]，導致BSA復合率和負載率都不高，但得率較高。

2.4 不同復合方式所得PEC的超微結構觀察

圖4 果膠、COS、BSA及不同復合方式所得PC掃描電鏡圖Fig. 4 SEM photographs of pectin, chiooligosaccharide, BSA and BSA-loading complexes obtained with different methods

由圖4可以看出，果膠為膠態顆粒，COS為球狀顆粒，而BSA則為片狀物。果膠＋BSA形成PEC主要呈現內嵌圓形、橢圓形或不規則弧形等小孔隙的膠體樣結構，孔隙分布較均勻，孔徑約在3～20 μm之間，表明形成的PEC較均勻。5 000 倍觀察圖可見網狀結構中孔隙壁較厚，表面較光滑但有凹陷，推理認為在本研究條件下果膠較柔軟、易包裹BSA分子[20]，使得孔壁較光滑。

PEC＋BSA形成二元PEC再與COS復合（果膠＋BSA＋COS），所得三元PEC中可見明顯的蜂窩孔狀結構，孔隙呈較規則的圓形或橢圓形，但孔隙分布及孔徑都較不均勻，繼續放大可見部分孔隙壁層較薄，表面光滑均勻。結合圖3的結果，這可能是因為COS與顆粒表面果膠分子上游離—COO－復合，或與已復合的BSA競爭結合位點，形成網狀結構[7]，導致微粒表層及內部PEC結構不均勻，這也是微粒核-殼結構的體現。

COS＋BSA＋PEC復合時，所形成的三元PEC呈膠體樣網狀結構，孔隙不規則且較少，孔壁表面粗糙、有褶皺。從圖中可以看出PEC超微結構更接近果膠＋BSA＋COS溶液中PEC的網狀結構，只是壁層較厚，可推測果膠分子趨向于先與COS結合并形成網狀結構，而后再與BSA復合，使壁膜增厚。由此佐證圖3的推測：COS、BSA與果膠分子競爭性結合，果膠分子更傾向于結合電荷密度更高的直鏈分子COS。沈亞麗[23]認為帶相反電荷分子之間的靜電吸引作用與兩者分子所帶電荷密度呈線性正相關關系，可以為上述推測提供支持。

以凍干的COS/果膠溶液PEC吸附BSA（果膠＋COS＋BSA），PEC表現為均勻規則的密集網狀結構，內有細小且均勻的不規則孔隙，孔壁較厚且光滑。對比發現，COS與果膠溶液PEC（果膠＋COS）凍干后結構致密（圖4H），BSA加入后三元PEC卻呈網狀結構，其原因值得探討。

2.5 不同復合方式所得復合物的FTIR分析

圖5 果膠、COS、BSA及不同復合方式所得圖Fig. 5 FTIR spectra of pectin, chiooligosaccharide, BSA and complexes obtained with different methods

由圖5可知，COS的吸收特征峰與CS基本相同，分子上的O—H伸縮振動吸收峰和N—H伸縮振動吸收峰在3 750～3 050 cm－1處重疊成的一個寬峰，在1 632 cm－1處為未?；?-氨基葡萄糖胺中的N—H的伸縮振動峰（酰胺I帶），1 520 cm－1處為N—H的彎曲振動峰（酰胺II帶）[24]；果膠分子上的羧酸O—H締合伸縮振動在3 700～3 100 cm－1區出現強峰，在1 748 cm－1處和1 647 cm－1處分別為酯羰基C＝O及羧基—COO－的伸縮振動峰[23,25]；BSA的特征峰為3 287 cm－1氨基峰、1 645 cm－1（C＝O鍵伸縮（酰胺I帶））、1 535 cm－1（C—N鍵伸縮及N—H鍵合（酰胺II帶）和1 394 cm－1（N—H振動（酰胺III帶）的乙酰氨基峰[26]。3 種物質以不同方式復合后，所得復合物的紅外光譜圖不甚相同。

果膠與BSA復合時（PEC＋BSA），果膠分子C—H伸縮振動峰及酯羰基C＝O分別紅移到2 912 cm－1和1 737 cm－1，且峰高度顯著減弱，表明這些基團被包裹，果膠分子卷曲。另外，果膠1 647 cm－1處的羧基和BSA 1 535 cm－1處的酰胺II帶合并為1 522 cm－1較小的吸收峰，BSA的酰胺III帶也發生了紅移（1 387 cm－1），說明果膠分子上的—COO－與BSA分子上的—NH3＋之間通過靜電作用結合[27]，但BSA的二級結構基本沒變（酰胺I帶由1 645 cm－1紅移至1 651 cm－1，仍為無規卷曲結構）[28-29]。

PEC＋BSA＋COS三元PEC的—OH伸縮振動峰較PEC＋BSA二元PEC進一步藍移到3 469 cm－1處且峰強度變大，C—H伸縮振動峰則紅移到2 943 cm－1處且峰強度增大，這是COS加入的體現。與PEC＋BSA相比，PEC酰胺I帶吸收峰位置及強度基本未變，反映此復合方式時COS結合量較少。PEC的酰胺II帶藍移到1 543 cm－1，其他各特征峰的波數變化不大，而強度略有增加（例如酰胺I帶及II帶），表明COS也主要以靜電作用結合在PEC＋BSA的PEC上。

對于COS＋BSA＋果膠方式形成的PEC，C—H伸縮振動峰較果膠＋BSA＋COS中的PEC稍微紅移（2 935 cm－1）且峰強度變大，推測此時PEC微粒表面的果膠和/或COS的量較多且更伸展，易被檢測到。PEC酰胺II帶特征峰紅移至1 531 cm－1處，其他各特征峰的強度明顯變大（尤其是酰胺I帶及II帶吸收峰），表明各分子之間的作用力沒有改變。對比各物質紅外光譜圖發現COS＋BSA＋果膠三元PEC的結構更接近多糖分子或有COS加入時的PEC，可進一步證明2.3節關于COS、BSA及果膠競爭結合的推測。另外，復合物酰胺I帶向高波數移動（1 654 cm－1），表明BSA分子二級結構由無規卷曲結構向α-螺旋轉變[29]，這可能是由于此方式下COS加入使得果膠結構變化，BSA為了更好地與果膠結合而發生結構改變。

COS與果膠復合時（COS＋果膠），所形成的PEC的—OH伸縮振動峰紅移到3 352 cm－1處，但強度顯著減弱，表明此時兩分子之間存在較強的氫鍵[25]，這與有BSA參與的PEC結構顯著不同，推測是由于BSA為橢圓形分子，與果膠結合后使果膠分子卷曲，分子上易與COS形成氫鍵的基團被包埋；另外，COS＋果膠二元PEC酰胺II帶吸收峰強度非常小，表明此時COS分子上的游離氨基—NH2充分復合，含量減少，信號降低[30]。在COS/果膠復合物上吸附BSA（COS＋果膠＋BSA），三元PEC的—OH伸縮振動峰顯著藍移，推測BSA加入破壞了果膠及COS之間的氫鍵；果膠及COS其余各特征峰基本消失，表明此時PEC表面主要吸附覆蓋了BSA，紅外光譜表現BSA的基本特征；PEC酰胺II帶吸收峰幾乎消失，說明此時PEC中的游離氨基被完全復合；PEC的酰胺I帶吸收峰由BSA的1 645 cm－1紅移到1 628 cm－1，推測BSA結構由無規卷曲結構轉變為β-折疊[26]，可能是BSA為了適應COS/果膠復合物構造而發生了結構改變。

3 結 論

不同復合方式下，果膠、COS及BSA復合順序不同，所形成的二元及三元PEC結構、狀態及對BSA的結合效果顯著不同，其紅外光譜差異也較大。

在果膠質量濃度為2 mg/mL、NaCl濃度為30 mmol/L，BSA質量濃度為5 mg/mL，pH值為3.5條件下，三者之間主要通過靜電作用進行結合，其中COS會與BSA競爭結合果膠分子上的負電位點，降低PEC對BSA的復合及負載。

在三元物質復合過程中，為了與果膠有效結合，BSA的二級結構會發生改變，其加入會破壞果膠與COS之間形成的氫鍵。