pH值偏移處理對油莎豆蛋白結構及乳化性質的影響

王 琳，周國衛，于志超，孟洛冰，王玉瑩，張安琪，王喜波，江連洲

（東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030）

油莎豆又名油莎草、老虎豆、鐵荸薺，是一種莎草屬植物[1]。油莎豆富含油脂、糖、蛋白質及維生素等，極具開發價值[2]。油莎豆尤其適合糖尿病患者和消化系統疾病患者食用，同時它還具有預防心臟疾病的作用[3]。油莎豆蛋白含有18 種氨基酸，總氨基酸含有29.88%，其中必需氨基酸占46.03%，非必需氨基酸占53.97%[4]。油莎豆蛋白可分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其中清蛋白為主要的蛋白組分（82.23%～91.93%），球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白含量較少（3%～7.5%）[5]。油莎豆蛋白雖然具有良好的營養價值，但是其溶解性及乳化性質還有待提高。

乳化性質是蛋白質的重要功能性質。從各種天然來源提取的植物蛋白質可以用作乳化劑，因為它們能夠促進形成乳液，并改善乳液的穩定性[6]。乳化性作為蛋白加工過程中重要的功能指標，是決定蛋白在生產實踐中應用的重要體現，是影響蛋白產品品質穩定性的關鍵因素。提高乳化性有利于改進食品組織結構、口感、外觀，以提高食品保存性[7]。因此乳化性是目前植物蛋白的研究熱點。pH值偏移對大豆等蛋白結構及乳化性已有部分研究，發現它不會產生毒性和安全性等問題[8]。Jiang Jiang等[8]研究發現，極端酸性pH值處理可以引起大豆蛋白的結構發生改變，從而提高其乳化性。Zhang Yanjun等[9]研究了pH值對菠蘿蜜蛋白乳化性的影響，發現菠蘿蜜蛋白的溶解度首先隨pH值的增加而降低，隨pH值進一步增加溶解度增加，在中性條件下的菠蘿蜜蛋白顯示出更高的乳化活性和乳化穩定性。Renkema等[10]研究發現，肌球蛋白、卵蛋白經pH值偏移處理后，側鏈相互作用減弱，蛋白分子的三級結構受到很大破壞。目前關于油莎豆的報道還主要集中于油莎豆的種植、油莎豆中油脂及蛋白提取的工藝優化，而關于pH值偏移處理對油莎豆蛋白結構及乳化性的影響鮮見報道。本實驗主要研究pH值偏移對油莎豆蛋白結構及其乳化性的影響，為油莎豆蛋白未來在食品中的廣泛應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

油莎豆（市售），油莎豆粉碎后，過60 目篩，用正己烷進行脫脂處理，得脫脂油莎豆粕。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS） 美國Sigma公司；低分子質量蛋白質Marker、5×蛋白上樣緩沖液 索萊寶生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-3600Plus型紫外-可見分光光度計、FTIR-8400S型傅里葉變換紅外光譜儀 日本島津公司；ULTRA-TURRAX T18 Basic型高速分散機 德國IKA公司；FD5-series型冷凍干燥機 美國西盟國際集團；F-4500熒光分光光度計 日本日立公司；Mastersizer 2000型粒度分布儀 美國布魯克海文儀器公司；Gel Doc EZ imager型凝膠成像儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 油莎豆粕基本成分分析

粗蛋白含量：按GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》方法測定；粗脂肪含量：按GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》方法測定；淀粉含量：按GB 5009.9—2016《食品中淀粉的測定》方法測定；總糖含量的測定參考苯酚-硫酸法；水分含量：按GB 5009.3—2016《食品中水分的測定》方法測定；灰分含量：按GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》方法測定；粗纖維含量：按GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》方法測定。

1.3.2 油莎豆蛋白提取工藝流程

脫脂油莎豆粕→pH 8.5堿提→離心→pH 4.5酸沉→離心→沉淀水洗3 次→復溶調pH 7→冷凍干燥→油莎豆蛋白。

工藝條件：將脫脂油莎豆粕與去離子水以體積比1∶15混合攪拌均勻，用NaOH調pH值至8.5浸提1.5 h，于8 000×g離心20 min。取上清液用HCl調pH值至4.5，再于8 000×g離心20 min。取沉淀水洗3 次，取少量水溶解沉淀并用NaOH調pH值至7.0，冷凍干燥即得油莎豆蛋白，蛋白質量分數約為72%，蛋白提取率為63.42%，通過凱氏定氮法（N×6.25）測定所得。油莎豆蛋白基本成分分析方法同1.3.1節。

1.3.3 pH值偏移處理油莎豆蛋白

配制pH值分別為3、4、5、6、7、8、9、10的磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L），將油莎豆蛋白分散于不同pH值的磷酸鹽溶液中并于磁力攪拌器上室溫攪拌，使其充分溶解，4 ℃靜置過夜。

1.3.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳分析

參考Laemmli等[11]的方法并加以改進，配制5%的上層膠和13%的下層膠備用。將蛋白樣品稀釋為5 mg/mL，并與5×SDS上樣緩沖液以4∶1進行混合，沸水處理5 min。將冷卻后的蛋白溶液吸取7 μL注入樣孔。初始電壓設定為90 V，進入下層膠時設定電壓為120 V。電泳結束后將凝膠條用考馬斯亮藍染色液（R250）染色過夜，之后用脫色液脫色3～4 次，采用Gel Doc EZ imager型凝膠成像系統分析電泳條帶。

1.3.5 傅里葉變換紅外光譜分析

將處理后的蛋白樣品進行冷凍干燥，將1 mg樣品和溴化鉀粉末混合磨粉并壓制成片，用于傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared，FTIR）[12]進行全波段掃描，設定參數為掃描次數32 次，測量范圍為4 000～400 cm－1，分辨率為4 cm－1。

1.3.6 粒徑分布的測定

將蛋白樣品用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）稀釋至1 mg/mL，粒度儀規格：顆粒折射率1.460，平衡時間120 s，分散劑折射率1.330。

1.3.7 紫外掃描

參照Morales等[13]的方法，將蛋白樣品用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L）進行稀釋，使其質量濃度為2 mg/mL，于紫外-可見分光光度計進行紫外掃描，設置波長范圍200～400 nm，掃描速率為100 nm/min。實驗值取3 次掃描的平均值。

1.3.8 內源熒光光譜

參照文獻Liu Yan等[14]的方法，并略作修改。將蛋白樣品用磷酸鹽緩沖溶液（0.01 mol/L）進行稀釋，使其質量濃度為0.2 mg/mL，于熒光分光度計進行掃描。設定狹縫寬度5.0 nm，電壓700 mV，發射波長300～400 nm，激發波長290 nm，掃描速率5 nm/s。

1.3.9 濁度測定

采用Kurganov等[15]的方法。將處理后的蛋白樣品用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）進行稀釋，使其質量濃度為2 mg/mL，用旋渦振蕩器將其混合，于紫外-可見分光光度計波長400 nm處測定其OD值，用所得OD值表示濁度。

1.3.10 溶解度測定

參考Samoto等[16]的方法。將樣品用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）稀釋后10 000×g離心20 min。取上清液適度稀釋，采用Lowry法測上清液中蛋白含量，以牛血清白蛋白為標準物制作標準曲線。

溶解度按式（1）計算：

1.3.11 表面疏水性測定

參照Haskard等[17]的方法，略作修改。將不同條件下的樣品溶液用磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L）稀釋為不同質量濃度（0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL）。然后將20 μL 1-苯胺基萘-8-磺酸（1-anilino naphthalene-8-sulfonic acid，ANS）溶液（8.0 mmol/L，pH 7.0）分別加入上述配制好的不同質量濃度溶液，用旋渦振蕩儀充分混合，將其放置在暗環境中反應15 min。設置發射波長為470 nm，激發波長為390 nm，在此條件下測定樣品的熒光強度。以蛋白濃度為橫坐標，熒光強度為縱坐標作圖，斜率表示蛋白表面疏水性。

1.3.12 乳化性及乳化穩定性測定

參照Pearce等[18]的方法。將蛋白樣品用磷酸鹽緩沖液進行稀釋，使其質量濃度為2 mg/mL，以體積比3∶1將蛋白溶液與大豆油混合，用高速分散均質器于11 000 r/min攪打1 min，于0 min和10 min分別從底部吸取溶液100 μL，將其加入到10 mL 0.1%的SDS溶液中混合均勻，用紫外-可見分光光度計于波長500 nm處分別測定吸光度，以SDS溶液作為空白。其乳化活性（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩定性（emulsification stability index，ESI）按式（2）、（3）計算：

式中：N為稀釋倍數100；T為常數2.303；L為比色池光徑1 cm；φ為油相體積分數0.25；C為乳化液形成前蛋白溶液的質量濃度，10 mg/mL；A0、A10分別為乳狀液在第0、10分鐘的吸光度。

1.4 數據統計分析

所有實驗重復3 次，使用SPSS 19統計軟件進行數據的處理與分析，使用Origin 9.0軟件作圖，Peakfit 4.12軟件計算蛋白二級結構相對含量。

2 結果與分析

2.1 油莎豆粕及油莎豆蛋白的主要成分

對油莎豆粕的基本組成成分進行測定分析，結果見表1。

表1 油莎豆粕的主要成分Table 1 Main components of C. esculentus L. dregs

表2 油莎豆蛋白的主要成分Table 2 Main components of C. esculentus L. protein

由表1可知，油莎豆粕中的粗蛋白、淀粉和總糖含量較高，具有很好的潛在利用價值。對油莎豆蛋白的基本組成成分進行測定分析。由表2可知，凱氏定氮法測得蛋白質質量分數為（72.12±0.24）%。

2.2 SDS-PAGE圖譜

圖1 油莎豆SDS-PAG圖Fig. 1 SDS-PAGE pattern of C. esculentus L. protein

由圖1 可知，油莎豆蛋白亞基分子質量分布于97.4～14.4 kDa之間，由凝膠成像儀分析可知其主要亞基分子質量分布為17～22、31～38、75 kDa。由此可知，油莎豆蛋白多肽亞基大多數分布于低分子質量（＜43 kDa）范圍中。在高分子質量（＞94.7 kDa）范圍內未見條帶分布。Codina-Torrella等[5]也得出相似結論。

2.3 FTIR分析

圖2 p值偏移處理對油莎豆蛋白FTIR光譜的影響Fig. 2 Effect of pH-shifting treatment on the FTIR spectrum of C. esculentus L. protein

Zhang Qiuting等[19]報道FTIR光譜上的酰胺I區域（1 600～1 700 cm－1）主要表示酰胺基團的C＝O彎曲振蕩。每個子峰和二級結構之間的對應關系如下：α-螺旋為1 648～1 664 cm－1，β-折疊為1 615～1 637 cm－1和1 682～1 700 cm－1，β-轉角為1 664～1 681 cm－1，無規卷曲為1 637～1 648 cm－1[20]。油莎豆蛋白的FTIR光譜如圖2所示。由表3可知，隨pH值增加，二級結構中β-折疊相對含量顯著降低，α-螺旋相對含量顯著增加，β-轉角和無規卷曲相對含量也略有增加。多肽鏈上羰基和氨基之間的氫鍵是維持α-螺旋穩定的主要作用力[21]。油莎豆蛋白等電點為4.5，在中性條件下蛋白帶負電荷，在酸性條件下α-螺旋相對含量低可能是因為蛋白分子間電荷發生中和反應，產生靜電作用，影響氫鍵的穩定性[22]。說明靜電作用和氫鍵穩定性都會影響α-螺旋含量[23]。β-折疊含量還與蛋白質的疏水相互作用有關，其含量降低表明分子內部的疏水性位點暴露，疏水性增強[24]，因此在pH 6～9的范圍內，油莎豆蛋白β-折疊相對含量降低，表面疏水性增加。隨著pH值增加，β-轉角相對含量也略有增加，也可以說明pH值增加使蛋白質結構更加舒展[25]。

表3 p值偏移處理對油莎豆蛋白二級結構的影響Table 3 ffect of p-shifting treatment on the secondary structures of C. esculentusL. protein

表3 p值偏移處理對油莎豆蛋白二級結構的影響Table 3 ffect of p-shifting treatment on the secondary structures of C. esculentusL. protein

注：結果以 ±s表示（n=3）；同列不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。

pH 相對含量/%α-螺旋 β-折疊 β-轉角 無規卷曲3 28.11±0.32a 41.36±0.16f 10.50±0.21a 20.03±0.20a 4 30.48±0.24b 38.82±0.32e 10.52±0.56a 20.18±0.13b 5 31.10±0.26c 38.02±0.23d 10.49±0.22a 20.38±0.17bc 6 32.26±0.19e 36.48±0.29c 10.84±0.25b 20.42±0.24c 7 33.61±0.33f 34.85±0.60b 11.04±0.16b 20.50±0.15a 8 34.15±0.19g 34.59±0.24b 10.94±0.23b 20.52±0.24b 9 34.21±0.21g 33.70±0.17a 11.52±0.19c 20.57±0.23c 10 31.69±0.23d 36.86±0.22c 11.18±0.17b 20.27±0.26c

2.4 粒徑分布結果

圖3 p值偏移處理對油莎豆蛋白粒徑分布及平均粒徑的影響Fig. 3 Effects of pH-shifting treatment on the particle size distribution and average particle size of C. esculentus L. protein

粒徑是可以間接反映蛋白質結構變化的指標，粒度分布可以充分反映樣品溶液中粒子的大小和均勻性。由圖3可知，隨pH值增加，蛋白粒度分布逐漸從雙峰分布轉變為單峰分布，表明蛋白質更均勻地分散在溶液體系中[26]。隨pH值增加，蛋白的平均粒徑在等電點（pH 4.5）附近急劇增大，pH值偏離等電點后，平均粒徑逐漸減小。這可能是因為在等電點附近蛋白靜電荷為0，分子間作用力減弱，蛋白顆粒間相互碰撞、聚集沉淀，形成聚集體，蛋白分子粒度尺寸因此變大[27]。隨pH值增加，平均粒徑變小，這可能說明蛋白分子解聚展開，結構變得更加舒展，蛋白溶液體系隨pH值增加變得越來越穩定。pH 9以后平均粒徑略有上升可能是因為pH值過高導致蛋白變性過度，蛋白分子相互交聯產生新的聚集體。

2.5 溶解度分析

圖4 p值偏移處理對油莎豆蛋白溶解度的影響Fig. 4 Effect of pH-shifting treatment on the solubility of C. esculentus L. protein

由圖4可知，隨pH值增加蛋白質溶解度先降低后增加，并在等電點（pH 4.5）附近達到最小值。這可能是因為蛋白和水之間相互作用的減少增強了蛋白分子間的相互作用，導致蛋白質聚集和沉淀，溶解度降低[28]。溶解度隨pH值升高而增加是由于蛋白質結構變得更加舒展，蛋白質內部的疏水基團與極性基團暴露出來，附近的結合水增多，促進了蛋白的水化作用，提高了蛋白質的溶解度[29]。同時，油莎豆蛋白顆粒減小，增加了蛋白質顆粒的比表面積，也是溶解度增加的原因之一，該結論與2.2節粒徑測量結果一致。此外，有研究表明，pH值偏移處理會導致蛋白質結構展開，同時亞基之間二硫鍵斷裂，有助于溶解度的增加[30]。在pH 9之后溶解度變化趨于平緩，這可能是因為在強堿環境中蛋白嚴重變性，蛋白質分子重新聚集沉淀。蛋白質溶解度與蛋白質的許多功能特性密切相關，包括其乳化性、凝膠形成能力和形成特性[31]。

2.6 紫外掃描光譜分析

蛋白質產生紫外光譜主要是由于蛋白中的發色基團對紫外光的吸收作用。根據紫外吸收光譜的不同，可以推斷出蛋白質三級結構的改變[32]。由圖5可知，隨pH值增加，紫外吸收強度先降低后增加，且在等電點（pH 4.5）附近達到最小值。這可能是因為在等電點附近蛋白質發生聚集，溶解度達到最小值，影響了發色基團的暴露，從而導致紫外吸收強度降低。但隨pH值增加，蛋白構象發生改變，結構更加舒展，發色基團與芳雜環疏水基團更多地暴露，從而引起紫外吸收的增加。蛋白紫外吸收強度的變化說明pH值偏移處理可以誘導蛋白體系構象發生變化，從而引起蛋白質分子微環境的改變。

圖5 p值偏移處理對油莎豆蛋白紫外光譜的影響Fig. 5 Effect of pH-shifting treatment on the UV absorption spectrum of C. esculentus L. protein

2.7 熒光光譜分析

圖6 p值偏移處理對油莎豆蛋白熒光光譜的影響Fig. 6 Effect of pH-shifting treatment on the fluorescence spectrum of C. esculentus L. protein

內源熒光光譜是檢測蛋白構象變化的一種方法，它通過分析光譜變化反映出側鏈的變化[31]。間接說明了大豆蛋白三級結構的改變。蛋白的內源熒光主要來自于色氨酸（Trp），分子中苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）到Trp殘基之間發生了能量轉移，導致Phe和Tyr的作用很小，因此油莎豆蛋白的熒光峰實際上是色氨酸殘基的熒光峰[33]。由圖6可知，不同pH值處理的蛋白熒光光譜形狀沒有發生改變，但熒光強度發生了明顯變化。熒光強度隨pH值增加先降低后增加，在等電點附近熒光強度最低。這可能是因為在等電點附近，蛋白分子發生聚合沉淀，使暴露在蛋白分子表面的Trp殘基被包裹在蛋白分子內部，導致蛋白熒光強度降低[34]。隨pH值增加，蛋白質的氫鍵、疏水相互作用、靜電相互作用等作用力發生改變，蛋白結構變得更加舒展，蛋白內部的Trp殘基暴露出來，熒光強度增加。

2.8 濁度分析

為進一步說明pH值偏移引起的蛋白分子聚集以及粒徑大小的關系，對油莎豆蛋白的濁度進行測定[34]。由圖7可知，隨pH值增加，蛋白質濁度先增加后降低，并在等電點（pH 4.5）附近達到最大值。這可能是因為在等電點附近，蛋白凈電荷為零，分子間作用力減弱，蛋白顆粒間相互碰撞、聚集沉淀，顆粒較大，導致濁度增加[35]。Renkema等[10]研究發現，在酸性條件下，蛋白質內部疏水基團暴露，并通過疏水相互作用等作用力形成聚集體。堿性條件有利于蛋白質溶解，所以隨pH值繼續增加，蛋白質溶解度增加，蛋白分子解聚，結構被打開，顆粒變小，濁度降低。

圖7 p值偏移處理對油莎豆蛋白濁度的影響Fig. 7 Effect of pH-shifting treatment on the turbidity of C. esculentus L. protein

2.9 表面疏水性分析

圖8 p值偏移處理對油莎豆蛋白表面疏水性的影響Fig. 8 Effect of pH-shifting treatment on the surface hydrophobicity of C. esculentus L. protein

表面疏水性是用于評估暴露于蛋白質表面的疏水基團數量的一種方法，通常用于反映蛋白質結構的變化，也與蛋白功能性質有關[36]。由圖8可知，隨pH值增加，蛋白質表面疏水性先降低后增加，并在等電點（pH 4.5）附近達到最低值，在pH 9之后又有小幅度降低。這可能是因為在等電點附近，蛋白質發生聚集，疏水基團被埋藏在蛋白內部，蛋白質表面疏水性降低。蛋白質表面疏水性隨pH值增大而升高是由于蛋白分子解折疊展開，埋藏在蛋白分子內部的疏水基團暴露，ANS熒光探針結合位點增多[37]。pH值增加，表面疏水性增加，熒光強度就越大，這與2.5節熒光光譜分析一致。研究表明，當pH值超過一定范圍后，蛋白質的二硫鍵被破壞，亞基解離，使蛋白質內部的疏水基團暴露，增加其表面疏水性[38]。pH 9之后表面疏水性降低，這可能是因為pH值過高導致蛋白質過度變性，蛋白分子重新聚集，疏水基團被重新包裹在蛋白分子內部[39]。

2.10 EAI及ESI分析

圖9 p值偏移處理對油莎豆蛋白乳化性的影響Fig. 9 Effect of pH-shifting treatment on the emulsifying properties of C. esculentus L. protein

由圖9可知，隨pH值增加，油莎豆蛋白的EAI先降低后增加，并在等電點附近達到最小值。這可能是因為在等電點附近，蛋白質溶解度降低，蛋白分子發生聚集，疏水基團被包裹在分子內部，影響乳化的進行，從而導致蛋白質EAI的降低。楊令葉[40]研究表明，花椒籽仁蛋白pH值在等電點附近時溶解度降低，參與乳化作用的蛋白減少，從而導致EAI降低；Puppo等[41]研究發現，蛋白質的乳化性與疏水性和疏水基團的分布有關。堿性環境中隨pH值增加，蛋白質EAI也逐漸增加，這可能是因為pH值升高，顆粒尺寸變小，蛋白結構展開，原本包裹在蛋白分子內部的疏水基團暴露出來，增強其表面活性[42]，導致蛋白EAI升高。

ESI趨勢與EAI相似，在等電點處達到最小值。這可能是因為在等電點附近，油水界面吸附蛋白質減少，界面穩定性受到破壞，蛋白質分子易發生聚集，導致蛋白質ESI降低[43]。pH值偏離等電點后，隨pH值增加ESI逐漸升高，這可能因為隨著pH值增加，蛋白溶解度提高，更多蛋白分子吸附到油水界面，堆積在油滴周圍，防止界面穩定性的破壞，從而蛋白質ESI升高。

3 結 論

隨pH值升高，油莎豆蛋白的二級結構中β-折疊相對含量降低，α-螺旋、β-轉角和無規卷曲相對含量增加。α-螺旋相對含量低可能是因為酸性環境中，蛋白分子間部分電荷發生中和反應，產生靜電作用，影響氫鍵的穩定性。β-折疊相對含量降低可以表明蛋白疏水性增強。蛋白平均粒徑在堿性條件下隨pH值升高而減小，蛋白粒度分布逐漸從雙峰分布轉變為單峰分布，表明蛋白質可以更均勻地分散在溶液體系中。通過熒光光譜與紫外光譜分析可知pH值偏移處理使蛋白分子構象發生了改變，在堿性條件下蛋白分子內部多肽鏈部分展開，疏水基團暴露，蛋白結構變得更加舒展。隨pH值增加，蛋白濁度降低，說明蛋白粒子更加分散。蛋白EAI及ESI隨pH值增加先降低后增加，表面疏水性也有相同趨勢，說明pH值升高，蛋白結構展開，包裹在蛋白分子內部的疏水基團暴露出來，表面活性增強，導致EAI升高，同時蛋白溶解度提高，更多蛋白分子吸附到油水界面，堆積在油滴周圍，防止界面穩定性的破壞，蛋白質ESI升高。