牛至細胞懸浮培養合成多酚及黑曲霉誘導子的促進作用

李燕平，劉 媛，王小強，沈倍韻，周香菊，趙文佳，陳繼光,，尹忠平,

（1.江西農業大學食品科學與工程學院，江西省天然產物與功能食品重點實驗室，江西 南昌 330045；2.南開大學 藥物化學生物學國家重點實驗室，天津 300350）

牛至（Origanum vulgare）為唇形科牛至屬多年生草本植物[1]，又名山薄荷、野荊芥、五香草，主要分布于我國的新疆、甘肅、湖北等省區以及地中海地區、北非、北美等地[2]。牛至中含有具有獨特香味、抗菌消炎活性的香荊芥酚、百里香酚等揮發性成分[3]，可廣泛用于飲料、食用香料、食品防腐劑、飼料添加劑等[4-6]。除揮發油外，牛至還富含多酚、三萜和甾醇等非揮發性活性成分，其中迷迭香酸是牛至多酚類物質的主要成分。迷迭香酸具有抗菌、抗病毒、抗氧化、調節免疫和改善記憶等多方面的生理活性[7-8]。Kikuzaki等[9]從牛至葉片中分離得到了咖啡酸、迷迭香酸和原兒茶酸等5 種多酚類物質，并證實其有很強的抗氧化活性。Farr等[10]研究發現，迷迭香提取物中所含的迷迭香酸可以顯著提高SAMP8小鼠的學習和記憶能力。Rocha等[8]通過體外和體內實驗證實，迷迭香酸具有很好的抗氧化和抗炎能力。因此，牛至中迷迭香酸等多酚類物質具有很好的開發利用前景。

以植物的根、莖、葉、花、果實等為原料提取植物次生代謝產物，雖然材料種類多、來源廣，但植物生長周期較長，依賴于自然條件，受環境和病蟲害的影響較大，同時由于原料成分復雜，純化的難度較大、成本高；而植物細胞培養生產次生代謝產物具有周期短、可控性強、受自然環境影響小、目標物易于提取和純化等諸多優點，被認為是一種有巨大潛力的天然產物生產技術[11]。但從目前的研究報道看，植物細胞懸浮培養生產次生代謝產物還存在產量較低的問題，而通過添加誘導子進行刺激可有效提高目標物的產量，是解決這一問題的較好途徑之一[12]。黑曲霉誘導子（Aspergillus nigerelicitor，ANE）是一種能刺激植物和微生物次級代謝產物合成的真菌誘導子，其通過信號轉導引起相關基因表達的變化，從而促進多酚類、萜類、生物堿類、黃酮類等特定次級代謝產物的合成[13]。Rajendran等[14]研究表明，ANE和黃曲霉誘導子均可顯著促進胡蘿卜愈傷組織中花青素的合成。熊瓊瓊等[15]在青錢柳懸浮培養細胞中添加200 μg/mL的ANE，細胞內總三萜含量提高到49.52 mg/g，為對照組的10.21 倍。Yu Longjiang等[16]發現外源ANE可以提高紅豆杉細胞培養體系中紫杉醇合成相關酶的活性，從而顯著提高紫杉醇產量。上述研究表明，ANE對植物細胞合成次生代謝產物有較好的促進作用。

本研究以實驗室前期建立的牛至細胞懸浮培養體系合成迷迭香酸等多酚類物質，初步鑒定其中的多酚化合物種類，為進一步提高多酚的含量和產量，采用ANE對懸浮培養的牛至細胞進行誘導，研究誘導對迷迭香酸等多酚合成的影響，旨在為牛至細胞培養生產多酚提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

牛至懸浮培養細胞由江西省天然產物與功能食品重點實驗室提供；黑曲霉（CGMCC3.0453）購于中國普通微生物菌種保藏管理中心。

MS（Murashige and Skoog）培養基 青島高科園海博生物技術有限公司；甲醇（色譜純） 美國Tieda試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TripleTOF5600＋超高效液相色譜-飛行時間串聯質譜（ultra-high performance liquid chromatography-time of flight-tandem mass spectrometry，UPLC-TOF-MS/MS）儀美國ABSciex公司；1260高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國Agilent科技有限公司；SW-CJ-ICU潔凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；ZHWY-3222回旋振蕩搖瓶機美國惠普公司；V-5600紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司；SY-360超聲波提取儀 上海寧商超聲儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牛至細胞懸浮培養

選取生長狀態良好的牛至懸浮培養細胞，重新接種到新的MS液體培養基中培養。培養條件：MS培養基添加3.0 mg/L激動素、0.5 mg/L二氯苯氧乙酸和30 g/L蔗糖，置于含有250 mL培養液的500 mL三角瓶中進行振蕩光培養，接種量（鮮細胞質量/培養液體積）為15 g/100 mL，培養pH值為5.8±0.2，溫度（28±1）℃，轉速120 r/min，每10 d繼代一次。

1.3.2 細胞生長曲線的繪制

參照Liu Zebo等[17]方法。選取生長迅速、性狀穩定、活力高的10 d齡懸浮培養細胞，篩網過濾后，稱取6 g接種于裝有40 mL MS液體培養基的100 mL三角瓶中，其他培養條件同1.3.1節，培養16 d，每2 d收獲一次，烘干稱質量。以干質量（g）為縱坐標、收獲時間（d）為橫坐標，繪制細胞生長曲線。

1.3.3 細胞生物量的測定

將懸浮培養細胞進行真空抽濾后，置于50 ℃恒溫烘箱中烘干至質量恒定，稱量得干質量。

1.3.4 細胞活力的測定

參照劉澤波[18]方法，采用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）法。稱取洗滌后的懸浮細胞200 mg，放入試管，加入0.1% TTC溶液（用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液配制成pH 7）5 mL，置于22 ℃恒溫箱中染色26 h。取出吸去TTC液，用重蒸餾水漂洗2～3 次后，加入5 mL 95%乙醇溶液，置于60 ℃水浴中孵育30 min，待細胞完全無色后，離心，取上清液在490 nm波長處測定吸光度，吸光度越大，則細胞活力越強。

1.3.5 細胞總多酚的提取

準確稱取1 g牛至懸浮培養細胞粉末于試管中，加入20 mL 50%甲醇溶液，在50 ℃恒溫條件下超聲輔助提取50 min，提取液4 000 r/min離心10 min，收集上清液，低溫避光保存，備用。

1.3.6 總多酚含量測定

采用福林-酚比色法，參照朱仙慕等[19]的方法，以沒食子酸為標準品繪制標準曲線，所得回歸方程y=0.010 6x＋0.016 9 （y為吸光度，x為沒食子酸質量濃度（μg/mL）），檢測范圍為20～120 μg/mL，R2為0.999 2。總多酚含量以每克牛至懸浮培養細胞（干質量）樣品中沒食子酸當量（mg）表示。

1.3.7 HPLC及UPLC-TOF-MS/MS檢測條件

將1.3.5節制得的樣品溶液，經0.45 μm的有機濾膜過濾，備用。標準品均用50%甲醇溶液溶解，經0.45 μm的有機濾膜過濾，備用。

HPLC檢測條件：C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流速1 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量10 μL；流動相：乙腈（A）-0.2%醋酸溶液（B），梯度洗脫（0～40 min，5%～37.5% A、95%～62.5% B；40～45 min，37.5%～5% A、62.5%～95% B）；檢測波長327 nm。

U P L C-TO F-M S/M S 檢 測 條 件 ： U P L C 條 件 ：流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量2 μL；流動相：乙腈（A）-0.2%醋酸溶液（B），梯度洗脫（0～20 min，5%～40% A、95%～60% B；20～30 min，40%～95% A、60%～5% B；30～32 min，95% A、5% B；32～35 min，95%～5% A、5%～95% B），檢測波長327 nm。MS/MS條件：采用負離子模式；毛細管電壓3 500 V；質量掃描范圍m/z50～1 250；霧化氣壓力40 psi；干燥氣流速10 L/min；干燥氣溫度350 ℃；碰撞電壓120 V。

1.3.8 迷迭香酸含量測定

采用HPLC法進行測定，具體條件如1.3.7節所示。以迷迭香酸標準品繪制標準曲線，得回歸方程y=10 989x＋7.712 4（y為吸光度，x為迷迭香酸質量濃度（μg/mL）），檢測范圍為25～400 μg/mL，R2為0.999 4。迷迭香酸含量以每克牛至懸浮培養細胞（干質量）樣品中迷迭香酸當量（mg）表示。

1.3.9 ANE的制備

參照熊瓊瓊[15]的方法，取振蕩培養7 d的成熟黑曲霉菌絲，置于十字研磨器中，添加適量磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）進行研磨勻漿，4 000 r/min離心10 min；取上層懸濁液，121 ℃滅菌30 min，即得ANE。ANE質量濃度以總糖含量計，以葡萄糖為標準，采用蒽酮-硫酸比色法進行測定。

1.3.10 誘導參數單因素試驗設計

ANE質量濃度：牛至懸浮培養細胞處理、培養條件同1.3.2節，培養至第10天時分別添加質量濃度為25、50、100、200 μg/mL的ANE，空白對照組加入等體積的緩沖液（pH 6.0），繼續培養2 d后收獲細胞。

ANE添加時間：牛至懸浮培養細胞處理、培養條件同1.3.2節，分別在指數生長初期（第8天）、指數生長中期（第10天）、指數生長末期（第12天）添加50 μg/mL的ANE，空白對照組在相同時間點加入等體積的緩沖液（pH 6.0），均在添加誘導子后繼續培養2 d收獲細胞。

ANE持續作用時間：牛至懸浮培養細胞處理、培養條件同1.3.2節，待其生長至第10天時加入50 μg/mL的ANE，每組均設置空白對照，空白對照組均在相同時間點加入等體積的緩沖液（pH 6.0），持續作用1、2、3 d后收獲細胞。

1.3.11 優化誘導參數的驗證實驗

牛至懸浮培養細胞處理、培養條件同1.3.2節，采用單因素試驗得出的最佳條件，測定其生物量、總多酚和迷迭香酸的含量及產量，設置空白對照組，空白對照組加入等體積的緩沖液（pH 6.0），每組均設置3 個平行。

1.4 統計分析

數據采用Origin和SPSS軟件進行統計分析，每次實驗均設置3 次重復，數據結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 牛至懸浮培養細胞的生長特性

如圖1所示，牛至懸浮培養細胞生長曲線總體呈典型的“S”型，與文獻報道的青錢柳[20]、黃梔子[17]細胞懸浮培養生長曲線基本相似。為期16 d的生長周期大致可以劃分為4個階段：遲滯期（0～8 d）、指數生長期（8～12 d）、穩定期（12～14 d）及衰退期（14～16 d）。當牛至懸浮培養細胞剛接種到新的培養環境中時，需要一定時間適應新環境，因此有一個較長的生長遲滯期，此時細胞生長緩慢；當細胞逐漸適應了新的培養環境，開始迅速增殖，進入指數生長期（8～12 d），4 d時間內細胞生物量從8.5 g/L迅速提高到19.00 g/L；第12天為細胞生物量最大時間點，此時細胞呈濃密狀態，且無褐化現象；14 d后細胞逐漸衰亡，生物量逐漸下降，出現較明顯褐化現象。

圖1 牛至懸浮培養細胞生長曲線Fig. 1 Growth curve of suspension-cultured O. vulgare cells

2.2 牛至懸浮培養細胞多酚的合成特征

圖2 牛至細胞總多酚含量和產量Fig. 2 Content and yield of polyphenols in suspension-cultured O. vulgare cells

如圖2所示，在為期16 d的生長周期中，總多酚含量大致呈“一”字型，而其產量走勢大致和生長曲線相似呈典型的“S”型，且均在第12天達到峰值，分別為9.58 mg/g、182.08 mg/L。在生長周期的前8 d，細胞總多酚含量基本維持在同一水平，但其產量逐漸增加；培養8～12 d，總多酚含量呈現小幅增加的趨勢，可能此期間是細胞多酚的合成期；培養12 d后，細胞逐漸衰亡，總多酚含量和產量也逐漸下降。綜合分析牛至細胞生長曲線和多酚的積累量可知，在整個生長周期中，總多酚含量一直維持在相對較低水平，其產量也相對較低，且其產量的提高大部分是由生物量引起的而非含量。目前的研究表明，ANE誘導是提高植物細胞次生代謝物含量的有效手段。杜坤玉[21]用黑曲霉粗提物處理虎杖愈傷組織，發現其白藜蘆醇含量顯著提高。劉澤波等[22]在青錢柳懸浮培養細胞中加入200 μg/mL ANE 10 h后，三萜含量提高到了36.46 mg/g，為對照組的3.36 倍。因此，后續進行ANE誘導研究，以進一步提高牛至細胞總多酚含量。

2.3 牛至懸浮培養細胞多酚類物質的鑒定

2.3.1 HPLC分析

圖3 牛至細胞提取物的PLC圖Fig. 3 HPLC chromatograms of the extract from O. vulgare cells

由圖3可知，在本實驗所采用的檢測方法和條件下，樣品溶液中的各色譜峰得到了較好分離，表明其中的化合物分離度較好，可以采用此條件進行后續的檢測和分析；細胞提取物檢測色譜圖中主要有7 個色譜峰，為了確定這7 個色譜峰所代表的物質，結合UPLC-TOF-MS/MS進行進一步檢測和分析。

2.3.2 UPLC-TOF-MS/MS分析

在HPLC檢測的基礎上，進一步采用UPLC-TOF-MS/MS對牛至懸浮細胞提取物中的多酚類物質進行鑒定，UPLC圖和總離子流圖如圖4所示，各物質二級質譜圖見圖5。在UPLC-TOF-MS/MS檢測圖譜中，保留時間為1.25 min處有一個較高的峰，通過對比其與樣品制備所用溶劑的一級、二級質譜信息，推斷為溶劑峰而非次級代謝產物峰。

圖4 UPLC（a）和總離子流圖（b）Fig. 4 UPLC chromatogram (a) and total ion current chromatogram (b)

圖5 UPLC-TOF-MS/MS測定牛至細胞多酚類物質Fig. 5 Detection of polyphenols from suspension-cultured O. vulgare cells by UPLC-TOF-MS/MS

1號峰的保留時間為2.81 min，其分子離子峰[M－H]－為m/z315.073 3，與原兒茶酸和己糖形成的糖苷類化合物的分子質量相吻合。在其二級質譜中，出現了m/z152.013 6、153.020 5、108.025 4和109.032 5的特征碎片離子（圖5a），與Karar等[23]所鑒定的原兒茶酸-O-己糖苷的質譜檢測數據基本相符。因此，初步推斷1號峰為原兒茶酸-O-己糖苷。

2號峰的保留時間為3.98 min，其分子離子峰[M－H]－為m/z299.114 6，二級質譜中有59.021 6、119.054 5、71.019 2和137.067 0等特征碎片離子（圖5b），參照文獻[24]推斷2號峰為紅景天苷。細胞多酚提取物加入紅景天苷標準品后進行HPLC檢測，結果表明紅景天苷標準品與2號峰出峰時間一致，加標后的峰面積相應增大，峰形左右對稱。因此，推斷2號峰為紅景天苷。

3號峰的保留時間為4.78 min，其質譜信息與Karar等[23]等通過UPLC-ESI-Q-TOF-MS/MS法鑒定山楂中所含的水楊酸-O-葡糖苷的質譜信息基本一致，其[M－H]－為m/z299.078 5，二級質譜中有m/z93.038 9和137.026 5這兩個主要碎片離子峰（圖5c）。因此，推斷3號峰為水楊酸-O-葡糖苷。

4、5、6號峰的保留時間分別為10.074、11.598 min和12.438 min，其分子離子峰m/z分別為521.129 7、359.082 0和373.093 4，二級質譜中均有m/z161.02、135.04、179.03、197.04這些特征碎片離子峰。研究表明，迷迭香酸分子離子峰為[M－H]－為m/z359.08，二級質譜主要碎片離子峰為m/z161.02、135.04、179.04、197.04[25]。因此，推斷這3 個化合物為迷迭香酸及其衍生物。5號峰的二級碎片主要有161.025 7、133.031 4、135.045 9、179.035 7和197.046 0（圖5e），其質譜信息與Parejo等[25]所鑒定的迷迭香酸檢測數據基本一致，推斷5號峰為迷迭香酸。通過加入迷迭香酸標準品進行HPLC檢測，確證5號峰為迷迭香酸。4號峰和6號峰的二級碎片還分別有323.077 2、359.082 0、521.129 7（圖5d）和175.041 0（圖5f），通過與Yang Yimin[26]和Abedini[27]等報道的質譜信息進行比對，推斷4號峰為迷迭香酸-3-O-葡糖苷，6號峰為迷迭香酸甲酯。

保留時間為6.8 min的色譜峰，其分子離子峰為m/z221.047 8，二級質譜特征碎片峰的m/z77.045 9、133.068 5、55.027 9、159.047 0、131.052 4，尚未發現類似的質譜檢測數據報道，因此目前還無法做出判斷，有待于進一步鑒定。

2.4 ANE質量濃度對細胞生長和多酚積累的影響

2.4.1 ANE質量濃度對細胞生長的影響

由圖6可知，在設定的質量濃度范圍內添加ANE，細胞生物量無顯著性差異，細胞活力基本保持在同一水平，說明添加25～200 μg/mL ANE對細胞的生長不會產生顯著影響。當ANE質量濃度低于200 μg/mL時，所收獲細胞的外觀形態和顏色與對照組相比基本沒有差異，均呈淡黃白色；當ANE質量濃度為200 μg/mL 時，細胞發生了輕微的褐化，細胞顏色加深，呈淡黃褐色（圖7a）。較高質量濃度的ANE處理會導致細胞發生一定程度的褐化，這與李萍等[28]的研究報道相似。為了觀察ANE誘導作用下懸浮培養細胞在微觀形態上的變化，在倒置顯微鏡下觀察了不同ANE質量濃度處理下的細胞形態（圖7b），發現在設定范圍內，ANE誘導對細胞的微觀形態基本沒有影響，細胞均為圓形或橢圓形，大多數細胞聚集成10 個細胞左右的細胞團。Yin Zhongping等[20]在研究青錢柳細胞生長的研究中表明，單細胞和過大的細胞聚集體均不利于細胞生長，最適合青錢柳細胞生長的細胞聚集體大小為10～80 個細胞。

圖6 不同質量濃度AN作用下的細胞生物量及細胞活力Fig. 6 Biomass and viability of the harvested cells under the elicitation of ANE at different concentrations

圖7 AN作用下細胞外觀（a）和顯微鏡下的細胞形態（b）Fig. 7 ANE-elicited cells (a) and its morphology observed under inverted microscope (b)

2.4.2 ANE質量濃度對細胞多酚積累的影響

由圖8可知，隨著ANE質量濃度的增加，細胞總多酚和迷迭香酸（細胞中的代表性多酚化合物）的含量和產量均呈現出先升后降的趨勢，大致呈倒“V”字形，均在50 μg/mL時達到最高峰值；細胞總多酚的峰值含量和產量分別為26.21 mg/g、485.00 mg/L，分別增加了1.67 倍和1.83 倍；迷迭香酸的峰值含量和產量分別為18.55 mg/g、336.77 mg/L，分別增加了2.24 倍和2.37 倍。在懸浮培養的牛至細胞中，迷迭香酸是多酚中的主要成分，其占總多酚比例在58.35%～76.76%之間，ANE對細胞多酚合成的促進作用主要體現在促進迷迭香酸的合成上。綜合分析細胞生物量、總多酚含量和產量的變化規律可知，ANE誘導牛至懸浮培養細胞合成多酚的作用效果是通過提高細胞內迷迭香酸等多酚物質的含量實現的，而非細胞生物量。劉冉[29]在以茉莉酸甲酯誘導紅松細胞多酚合成的研究中發現，1.00～2.50 μmol/L茉莉酸甲酯處理組與對照組相比，原花青素積累量沒有顯著差異；當濃度為5.00、10.00 μmol/L時，原花青素含量顯著高于對照組；而高濃度（20.00～40.00 μmol/L）處理則顯著降低了原花青素的積累量，其誘導實驗結果與本研究基本一致。

圖8 不同質量濃度AN作用下牛至細胞迷迭香酸、總多酚的含量和產量Fig. 8 Contents and yields of rosmarinic acid and polyphenol in O. vulgare cells under the elicitation of ANE at different concentrations

2.5 ANE添加時間對細胞生長和多酚積累的影響

2.5.1 不同時間點添加ANE對細胞生長的影響

圖9 不同時間點添加AN作用下細胞生物量（A）和細胞活力（B）Fig. 9 Biomass (A) and viability (B) of cells under the elicitation of ANE added at different times

在指數生長初期添加ANE對牛至懸浮細胞的生長有輕微的抑制作用，此時細胞生物量下降為對照組的94%；在指數生長中期和末期添加誘導子對細胞的生長基本沒有影響，ANE誘導組的細胞生物量大致與對照組細胞生物量持平（圖9A）。細胞活力檢測結果（圖9B）表明，隨著時間的推移，細胞活力呈逐漸下降的趨勢；在不同的時間點添加誘導子，ANE組細胞活力與對照組細胞活力基本一致，說明添加50 μg/mL ANE不會抑制細胞活力。此外，在指數生長期添加誘導子對細胞的外觀形態沒有影響，培養瓶中均有細胞掛壁，細胞培養物呈現濃稠膏狀，真空抽濾后的細胞顆粒均一、呈細砂狀（圖10）。

圖10 第10天添加50 誘導作用2 d后的細胞Fig. 10 Cells elicited for 2 days by ANE added on the 10th day

2.5.2 不同時間點添加ANE對細胞多酚積累的影響

圖11 不同時間點添加AN作用下迷迭香酸、總多酚的含量（a）和產量（b）Fig. 11 Contents (a) and yields (b) of rosmarinic acid and total polyphenols in O. vulgare cells under the elicitation of ANE with different addtion times

有研究表明，在遲滯期添加誘導子會抑制次生代謝產物的合成，而在穩定期添加誘導子對細胞幾乎沒有刺激效果，因為此時培養基中營養成分基本被消耗完，細胞已經停止生長；只有指數生長期最適于誘導，此時細胞生長旺盛、活力最強，對營養物質的消耗最快，次生代謝產物合成相關酶的表達量最高，添加誘導子往往能達到最佳刺激效果。何夢玲等[30]分別在廣藿香懸浮細胞生長的第0、7、9、13天時加入1 mg/L水楊酸進行誘導，發現在第9天（指數生長初期）添加誘導效果最好。王瑩[31]對培養至第9～11天的紅豆杉細胞進行誘導，發現在指數期添加誘導子能迅速、顯著提高次生代謝產物合成的相關信號強度，細胞對刺激最敏感，且不同時期誘導產生效應的機制也不同。結合2.1節和2.2節研究結果可知，牛至細胞指數生長期是多酚的合成期，因此本研究選擇細胞指數生長初、中、末期3 個不同時間點添加ANE以促進牛至細胞多酚的合成，圖11表明，在指數生長期的不同時間點添加50 μg/mL ANE進行誘導時，對細胞合成多酚的刺激效果差別很大。在細胞指數生長初期和中期添加誘導子，細胞總多酚的積累量顯著提高，含量分別提高了1.43 倍和1.76 倍，其中迷迭香酸含量分別提高了1.51 倍和2.27 倍，而在指數生長末期添加誘導子基本上沒有促進作用，ANE誘導組細胞總多酚含量與對照組大致相同。

綜合分析誘導子對牛至細胞的生長和總多酚積累的影響可知，在指數生長中期（第10天）添加ANE，對多酚合成的誘導效果最好，此時總多酚產量達到485.00 mg/L，提高了1.80 倍，其中迷迭香酸產量占70.12%，達到340.08 mg/L，是對照組的3.27 倍。因此，細胞指數生長中期為添加ANE的最佳時間點。

2.6 ANE持續作用時間對細胞生長和多酚積累的影響

圖12 不同AN作用時間下細胞生物量、細胞活力（a）和添加AN作用2 d后的細胞液外觀（b）Fig. 12 Biomass and viability of cells under the elicitation of ANE for different durations (a) and cells elicited by ANE for 2 days (b)

誘導子作用1～3 d，誘導組的細胞生物量和細胞活力與對照組沒有顯著差異（圖12a），添加50 μg/mL ANE對細胞生長沒有顯著影響。此外，誘導子作用時間的長短對細胞培養物的外觀形態沒有顯著影響（圖12b），但ANE作用時間對細胞合成多酚的影響較為顯著（表1）。隨著作用時間的延長，細胞總多酚含量和產量呈先上升后下降的趨勢。當作用時間為2 d時，ANE對細胞合成多酚的促進效果最好，此時總多酚含量提高了1.62 倍，產量為480.38 mg/L；其中迷迭香酸含量提高了2.28 倍，產量達到353.25 mg/L。因此，ANE誘導的最佳作用時間為2 d。Zhao Jian等[32]研究也表明，如果誘導子處理時間太短，誘導效果不明顯，但時間過長則可能會抑制次生代謝產物合成并造成細胞死亡。

表1 AN不同作用時間下迷迭香酸、總多酚的含量和產量Table 1 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in O. vulgare cells under the elicitation of AN for different durations

表1 AN不同作用時間下迷迭香酸、總多酚的含量和產量Table 1 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in O. vulgare cells under the elicitation of AN for different durations

時間/d 指標 迷迭香酸 總多酚對照組 ANE組 對照組 ANE組作用1 含量/（mg/g） 5.82±0.12 13.19±0.95 10.03±0.26 20.82±1.19產量/（mg/L） 98.94±2.29 224.23±8.91 170.51±3.59 353.94±10.54 2 含量/（mg/g） 5.74±0.21 18.84±1.24 9.79±1.07 25.62±1.07產量/（mg/L） 107.63±2.24 353.25±10.28 183.56±2.55 480.38±10.39 3 含量/（mg/g） 5.78±0.11 16.02±1.23 11.21±1.04 23.85±1.04產量/（mg/L） 112.71±2.38 312.39±9.74 218.60±2.57 465.08±10.88

2.7 ANE優化誘導條件的驗證

對優化的ANE誘導條件進行驗證，結果表明，優化誘導條件下（即在第10天添加50 μg/mL ANE，持續作用2 d后收獲細胞），ANE誘導組細胞的迷迭香酸含量和產量分別為對照組的3.25 倍和3.33 倍，總多酚含量和產量分別為對照組的2.83 倍和2.90 倍（表2），與前述實驗結果基本一致，表明ANE誘導確實能有效地促進細胞合成多酚。孫思琳等[33]研究了硫化氫對白樺懸浮細胞多酚積累的影響，結果表明經硫化氫處理后，細胞多酚含量為2.70 mg/g，是對照組的1.37 倍；劉冉等[34]分別以60、80 μmol/L茉莉酸甲酯和水楊酸誘導紅松細胞，松多酚的含量分別增加了7.23 mg/g和14.68 mg/g；與上述研究結果相比，牛至細胞經ANE誘導后多酚含量和產量都處于更高水平，說明ANE對牛至細胞合成多酚具有更加顯著的誘導效果，因此具有較好的應用前景。

表2 優化后的AN誘導作用條件下牛至懸浮細胞迷迭香酸和總多酚的含量及產量Table 2 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in AN-treated O. vulgare cells under optimized conditions

表2 優化后的AN誘導作用條件下牛至懸浮細胞迷迭香酸和總多酚的含量及產量Table 2 Contents and yields of rosmarinic acid and total polyphenols in AN-treated O. vulgare cells under optimized conditions

總多酚產量/（mg/L）ANE組 0.76±0.02 19.02±0.28 27.16±0.78 361.38±8.77 516.04±10.23對照組 0.74±0.03 5.86±0.12 9.61±0.19 108.41±9.11 177.79±2.97組別 生物量/（g/40 mL）迷迭香酸含量/（mg/g）總多酚含量/（mg/g）迷迭香酸產量/（mg/L）

3 結 論

以牛至細胞懸浮培養合成多酚，通過UPLC-TOFMS/MS鑒定了該細胞中原兒茶酸-O-己糖苷、紅景天苷、水楊酸-O-葡糖苷、迷迭香酸-3-O-葡糖苷、迷迭香酸和迷迭香酸甲酯6 種多酚類物質；50 μg/mL ANE可顯著促進牛至細胞多酚的合成，誘導后總多酚的含量和產量分別增加了1.83 倍和1.90 倍，其中迷迭香酸含量和產量分別增加了2.25 倍和2.33 倍。