不同乳酸菌對液態發酵米醋總酸及風味物質的影響

鄧永建，陸震鳴，張曉娟，柴麗娟，李 信，余永建，李華鐘，史勁松，許正宏,

（1.江南大學生物工程學院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 糧食發酵工藝與技術國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江蘇恒順醋業股份有限公司，江蘇 鎮江 212143；4.江南大學藥學院，江蘇 無錫 214122）

按照醋酸發酵方式的差異，釀造食醋可分為固態發酵食醋、液態發酵食醋、固液復合發酵食醋等，其中固態發酵食醋以東方谷物醋為主，如我國的山西老陳醋、鎮江香醋、四川麩醋等[1]，而液態發酵食醋廣泛存在于世界各地，如德國酒精醋、英國麥芽醋、意大利葡萄醋等。液態發酵法又可分為表面靜態發酵法、深層通風發酵法和滴淋發酵法等[2]，其中深層通風發酵法由于具有生產速度快、生產效率高等優點而應用廣泛[3]。

液態發酵米醋主要以大米為原料，經蒸煮、糖化、乙醇發酵獲得米酒，進而接種醋酸菌進行醋酸發酵而成[4]。與傳統多菌種固態釀醋工藝相比，液態發酵制醋的原料和釀造菌種相對單一，發酵周期較短，產酸以醋酸為主，產品酸感刺激、風味寡淡、口感單調。目前，國內外針對液態發酵食醋的研究主要集中在篩選產酸速率快、耐酸、耐乙醇的醋酸菌以及設計新型、產酸效率高的發酵罐等，但對改善液態發酵食醋口感和風味方面的研究較少。有研究[5-6]在傳統食醋醋醅中篩選了能夠耐受10%（體積分數）乙醇、3%乙酸、40 ℃溫度的醋酸菌，并將其用于西瓜醋的釀造；吳光忠等[7]采用獼猴桃和糯米為原料釀造果香型米醋，改善了米醋的風味品質；方冠宇[8]研究了不同發酵罐結構對浙江玫瑰醋品質的影響，發現用氣動攪拌發酵罐釀造的玫瑰醋與傳統玫瑰醋最接近。

我國傳統食醋釀造過程中，大量乳酸菌參與了發酵，能夠產生適量乳酸，柔和食醋酸感，同時促進食醋產品中多種風味物質的形成[9-10]。本研究嘗試在液態發酵食醋生產前期，將麩皮浸出液用乳酸菌靜置發酵，然后加入米酒并接種醋酸菌啟動醋酸發酵。通過增加底物和微生物種類，以期達到改善液態發酵米醋風味品質的目標，為優化米醋釀造工藝提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

麩皮和米酒由江蘇恒順醋業股份有限公司提供，其中米酒乙醇體積分數為10%。

氫氧化鈉、硫酸鋅、亞鐵氰化鉀（均為分析純）國藥集團化學試劑有限公司；2-辛醇、草酸、酒石酸、丙酮酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸（均為色譜純）上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

實驗菌種見表1。

表1 本研究所用菌種信息Table 1 Information about bacterial strains used in this study

1.2 儀器與設備

全溫搖瓶柜 太倉市強樂實驗設備廠；生化培養箱 上海精宏實驗設備有限公司；e2695高效液相色譜儀 美國Waters公司；7890B-5977B氣相色譜-質譜聯用儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 米醋的液態發酵

麩皮浸出液的制備：將麩皮與水按質量比1∶4混合，超聲處理20 min，用雙層紗布過濾，得到麩皮浸出液。

乳酸發酵：取50 mL麩皮浸出液，分別接種10 株不同的乳酸菌，置于37 ℃生化培養箱中靜置發酵24 h，得到乳酸發酵液。

醋酸發酵：實驗組取40 mL乳酸發酵液，對照組取40 mL麩皮浸出液，分別加入60 mL米酒，并接種醋酸菌，置于30 ℃全溫搖瓶柜中，轉速200 r/min進行醋酸發酵。

1.3.2 總酸的測定

參考GB/T 5009.41—2003《食醋衛生標準的分析方法》[11]。

1.3.3 有機酸的測定

參考GB/T 18623—2011《國家地理標志產品 鎮江香醋》[12]。

1.3.4 揮發性化合物的檢測[13]

樣品預處理：取1 mL米醋加入20 mL頂空萃取瓶中，加5 mL水、2.5 g氯化鈉、10 μL 2-辛醇內標（25 mg/L），放入1 顆磁力攪拌子，置于恒溫加熱磁力攪拌器中，50 ℃水浴預熱5 min，隨后將老化過后的萃取頭插入萃取瓶，50 ℃頂空萃取40 min。

氣相色譜條件： 色譜柱：DB-WAX（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，柱流量1 mL/min，不分流；進樣口溫度250 ℃；升溫程序：起始40 ℃，保持5 min，以5 ℃/min升至120 ℃，然后以10 ℃/min升至240 ℃，保持5 min，后運行溫度240 ℃，后運行5 min。

質譜條件：傳輸線溫度280 ℃，連接桿溫度150 ℃；離子源為電子電離源，電子能量70 eV，離子源溫度230 ℃，質量掃描范圍m/z33～450；ACQ方式Scan。

定性方法：將測得的質譜圖與NIST17.L譜庫進行檢索比對，確認各個色譜峰對應的化學成分。

定量方法：采用半定量的方法，以測得的2-辛醇內標峰面積與被測物峰面積比值計算米醋中各種揮發性風味物質含量。

1.3.5 米醋的感官評價[14-16]

由10 名（5 男，5 女）經過培訓的專業人員組成感官評價小組，按照表2的評價標準（100 分制）對所得的11 個米醋樣品進行感官評價，以平均得分為最終結果。

表2 米醋感官評價標準Table 2 Criteria for sensory evaluation of rice vinegar

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2010進行數據處理，采用MetaboAnalyst（https://www.metaboanalyst.ca/）在線工具進行聚類分析。

2 結果與分析

2.1 不同乳酸菌發酵麩皮浸出液的總酸及有機酸組成

麩皮是固態發酵食醋釀造的重要輔料之一，富含多種營養物質，包括小分子糖類、氨基酸、維生素和礦物質等[17-18]。表3為麩皮浸出液經不同乳酸菌發酵24 h后發酵液的總酸和有機酸組成。麩皮浸出液的總酸為1.62 g/L（以乳酸計），以酒石酸為主要有機酸；經不同乳酸菌發酵后，總酸為7.2～14.5 g/L（以乳酸計）；有機酸組成發生了明顯改變，乳酸、乙酸、檸檬酸和琥珀酸含量顯著上升，而草酸和丙酮酸含量變化不明顯。短乳桿菌L-02的產酸能力最弱，而副干酪乳桿菌L-06的產酸能力最強。

表3 乳酸菌發酵24 h后總酸及有機酸組成Table 3 Total acidity and organic acid composition of lactic acid bacteria-fermented bran leachate at 24 h

2.2 醋酸發酵過程的總酸變化

圖1 醋酸發酵過程總酸變化Fig. 1 Changes in total acidity during acetic acid fermentation

從圖1可知，所有實驗組醋酸發酵起始時總酸質量濃度（以乙酸計）為5.0 g/L左右，隨著醋酸發酵的進行，總酸逐漸升高，到第6～8天時達50.0 g/L左右。與對照組相比，羅伊氏乳桿菌L-05和橋乳桿菌L-09強化組的產酸速率相似，但嗜酸乳桿菌L-10、發酵乳桿菌L-03和植物乳桿菌L-04強化組的產酸速率較慢，這可能與嗜酸乳桿菌等乳酸菌能產生細菌素、類細菌素和過氧化氫等抑菌物質有關[19-21]。

2.3 液態發酵米醋的有機酸組成

表4 液態發酵米醋的有機酸組成Table 4 Organic acid composition of rice vinegar

如表4所示，各組液態發酵米醋的有機酸組成均以乙酸為主。接種乳酸菌發酵的麩皮浸出液后，液態發酵米醋含有乳酸，另有少量琥珀酸、酒石酸和檸檬酸，基本不含草酸和丙酮酸。

2.4 液態發酵米醋的揮發性風味物質組成分析

圖2 米醋代表性樣品揮發性風味物質總離子流圖Fig. 2 Total iron current chromatograms of volatile compounds in representative samples of rice vinegar

采用氣相色譜-質譜聯用儀對11 個米醋樣品的揮發性風味物質進行檢測，圖2為其中3 個代表性米醋樣品的總離子流圖，可以看出在該檢測條件下樣品中的揮發性風味物質的分離度良好。

食醋中揮發性風味物質的種數和含量可以影響風味的復雜性[22-23]。與對照組相比，短乳桿菌L-02、發酵乳桿菌L-03、植物乳桿菌L-04和羅伊氏乳桿菌L-05強化組中酯類、醇類、酮類和含氮類揮發性風味物質種類明顯更多，而其他乳酸菌強化組的揮發性酸類風味物種數則比對照組少（圖3A）。

與對照組相比，除嗜酸乳桿菌L-10強化組外，其他乳酸菌強化組的揮發性風味物質總含量更高，這主要是由于酯類、醇類、醛類和酮類的含量升高導致，嗜酸乳桿菌L-10強化組的醇類物質含量升高，但酮類物質含量明顯下降（圖3B）。

圖3 液態發酵米醋中揮發性風味物質種類（A）和含量（B）分布Fig. 3 Types (A) and contents (B) of volatile compounds in rice vinegar

如圖4所示，從11 個食醋樣品中共檢測到了81 種揮發性風味物質，包括酯類、醇類、酸類、醛類、酮類、酚類、醚類、烷類、含氮類和雜環類10大類，主要為酯類物質（27 種）和醇類物質（17 種）。 酯類物質中乙酸異戊酯、乙酸異丁酯、乙酸苯乙酯和丁二酸二乙酯含量最高，它們能賦予食醋水果香氣[24-25]；醇類物質中苯乙醇、異戊醇和2,3-丁二醇含量最高，苯乙醇具有玫瑰花香和蜜香，異戊醇具有醇味和澀味，2,3-丁二醇具有焦香和奶油香氣[26]；乙酸是食醋中最重要的物質，也是最主要的揮發性酸類物質；苯甲醛是最主要的醛類物質，其具有杏仁香氣[27]；3-羥基-2丁酮和2,3-丁二酮是兩種最主要的酮類物質，都具有奶油香氣[28-32]。

根據聚類分析結果（圖5），11 個米醋樣品可以被分為3 個大類，其中直接以麩皮浸出液與米酒混合接種醋酸菌進行醋酸發酵釀造的食醋被單獨聚為一類，短乳桿菌L-02、發酵乳桿菌L-03和羅伊氏乳桿菌L-05強化組被聚為一類，其他乳酸菌強化組被聚為一類。

圖4 米醋揮發性化合物組成Fig. 4 Composition of volatile compounds of rice vinegar

圖5 米醋揮發性風味物質含量聚類分析Fig. 5 Cluster analysis of concentrations of volatile flavor compounds of rice vinegar

2.5 米醋感官評價結果

圖6 米醋感官評分結果Fig. 6 Results of sensory evaluation of rice vinegar

如圖6所示，所有米醋的色澤和體態得分均在20 分以上，視覺觀察差異不大；但滋味和風味的得分有較大差異，羅伊氏乳桿菌L-05強化組得分最高，短乳桿菌L-02強化組得分次之，而未強化組乳酸桿菌的對照組BL的得分最少。這表明，乳酸菌強化能改善米醋的風味品質，其中強化羅伊氏乳桿菌L-05的效果最佳。

3 結 論

本研究將不同乳酸菌發酵麩皮浸出液后，將其與米酒混合并接種醋酸菌進行發酵釀造米醋。結果表明，不同乳酸菌發酵均能夠增加米醋中乳酸含量，其中羅伊氏乳桿菌L-05和橋乳桿菌L-09強化組產酸速率比對照快；短乳桿菌L-02、發酵乳桿菌L-03和羅伊氏乳桿菌L-05強化能增加米醋的揮發性風味物質種類和含量。本研究為乳酸菌強化改善液態發酵米醋的風味提供了理論支持。