狗骨藥材薄層鑒別方法的研究

孫婷婷 張 航

（長春市食品藥品檢驗中心，吉林長春 130012）

狗骨為犬科動物的干燥骨骼。將狗處死后，剝去皮肉，取骨，剔凈殘余的筋、肉，陰干。狗骨中富含的蛋白質在一定條件下充分水解成多種氨基酸，根據不同氨基酸的極性大小，用合適的展開劑在薄層色譜板上進行分離，并噴以顯色劑加熱使斑點清晰明顯，易于觀察。薄層色譜法可以很好地分離氨基酸，使之呈現一定的特征色譜圖[1-2]。因狗骨藥材質量標準缺失，暫時沒有完善的國家標準能夠對其進行有效的質量控制，嚴重制約該品種的深入開發，完善該藥材的質量標準，控制藥材質量為狗骨藥材的開發和廣泛應用提供質量保證。本文參照中國藥典薄層色譜法對其進行鑒別研究。實驗結果表明所建立方法易于操作，結果準確，重現性良好，可作為狗骨藥材鑒別的質控方 法。

1 材料與方法

1.1 研究對象

狗骨藥材部分為自行購買，購自延吉、吉林，部分為藥廠提供。豬骨、牛骨購自長春。

通過考察提取溶劑，超聲時間，溶劑體積，供試品取樣量來確定供試品的制備方法。采用11 種常見氨基酸，蘇氨酸、精氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、谷氨酸對照品和自制的對照藥材作為對照組，進行顯色斑點的比較，來確定合適的對照品和對照藥材。通過考察展開劑點樣量來確定薄層板的色譜條件。最后考察狗骨與易混淆品豬骨、牛骨的區別，驗證此方法的專屬性，并考察溫濕度和不同廠家薄層板的影響，驗證此方法的耐用性。

1.2 方法

取本品粉末1 g，加70%乙醇5 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取狗骨對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。再取纈氨酸對照品，加70%乙醇制成每1 mL 含0.25 mg 的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法（《中國藥典》2015 年版四部通則0502）試驗，分別吸取供試品溶液和對照藥材溶液各5μL，對照品溶液4μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（3 ∶1 ∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以茚三酮試液，在105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜和對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的斑 點。

供試品制備的考察方法：按上述方法，稱取供試品，分別考察提取溶劑為70%乙醇5 mL，超聲15 min，甲醇5 mL，超聲15 min，6 mol/L 鹽酸10 mL，加熱回流1 h 時供試品的水解程度；分別考察超聲10 min、15 min、20 min 時供試品的水解情況；分別考察溶劑體積為3 mL，5 mL，8 mL時供試品的水解程度；分別考察供試品取樣量為0.5 g，1 g，1.5 g 時斑點的大小及分離情況。

對照品與對照藥材的考察：按上述方法，稱取供試品，與10 種常見氨基酸，蘇氨酸、精氨酸、亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、脯氨酸、酪氨酸、谷氨酸對照品和自制的對照藥材，點于同一硅膠G 板上，觀察薄層色譜分離情況[3-4]。

薄層方法的考察：按上述方法，分別選擇硅膠G 薄層板與硅膠H 薄層板按上述方法進行考察，均來自青島海洋化工廠分廠；參考有關文獻，選擇了三種展開劑采用上述方法進行考察，分別為正丙醇-氨水（2 ∶1）；異戊醇-冰醋酸-水（18 ∶5 ∶3）；正丁醇-冰醋酸-水（3 ∶1 ∶1）；考察不同點樣量下分離的效果，分別量取不同的點樣量，對照品點樣量分別為2μL、5μL、10μL，對照藥材點樣量分別為2μL、5μL、10μL，供試品點樣量分別為2μL、5μL、10μL，觀察薄層色譜分離情況。

專屬性考察（豬、牛骨）：分別取樣品和易混淆品豬骨、牛骨，另取對照藥材，按上述方法操作，通過觀察色譜斑點的區別來考察方法的專屬性。

耐用性考察：采用上述方法，對三家不同廠家的硅膠預制薄層板（青島海洋化工廠分廠，批號：20150909；煙臺市化學工業研究所，批號：20160920；青島海浪硅膠干燥劑有限公司，批號：20130308）的展開效果進行考察。對不同展開溫度（9℃、18℃、30℃）和相對濕度（18%、38%、75%）進行考察，以確定方法的耐用性。

2 結果

結果表明，提取溶劑為70%乙醇，超聲提取15 min，提取溶劑體積為5 mL，供試品稱樣量為1 g 時，提取效果較好，斑點清晰，故選擇提取溶劑為70%乙醇[5-6]，選擇超聲時間為15 min，選擇溶劑體積為5 mL，選擇稱樣量為1 g。供試品在與纈氨酸對應的位置顯顏色相同的斑點，且分離效果較好，斑點清晰，其余氨基酸斑點有重疊或不清晰，故選擇纈氨酸作為對照品。并加入對照藥材作為對照[7]。采用硅膠G 薄層板分離效果更好，斑點更清晰，故選擇硅膠G 薄層板。展開劑為正丁醇-冰醋酸-水（3 ∶1 ∶1） 時，展開效果最好，斑點清晰，故選擇展開劑為正丁醇-冰醋酸-水（3 ∶1 ∶1）。對照品點樣量、對照藥材點樣量、供試品點樣量分別為5μL 時，展開效果最好，斑點清晰，故選擇對照品點樣量、對照藥材點樣量、供試品點樣量分別為5μL。專屬性考察色譜中斑點清晰且區別明顯，分離效果較好，該方法專屬性強，可用于鑒別狗骨與易混淆品豬骨、牛骨。高效板的分離效果最好，其余兩家薄層板斑點較清晰，也可達到分離效果，不同溫濕度條件下，均可得到清晰斑點，該方法耐用性較好。

取10 批樣品各1 g，加70%乙醇5 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液作為供試品溶液。另取狗骨對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。取纈氨酸對照品，加70%乙醇制成每1 mL 含0.25 mg 的溶液，作為對照品溶液[8]。照薄層色譜法（中國藥典2015 年版四部通則0502）試驗，吸取上述溶液各5μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（3 ∶1 ∶1）為展開劑，展開、取出、晾干、噴以茚三酮試液，以105℃加熱至斑點顯色清晰。結果表明，10 批樣品均可得到清晰圓整的斑點，色譜分離情況較好。

3 討論

根據方法學驗證研究，分別對可能影響薄層色譜結果的條件進行考察，包括供試品制備的條件，薄層方法的條件，對照品與對照藥材的選擇，專屬性和耐用性的考察，實驗結果顯示，用70%乙醇超聲提取的方法制備供試品，操作容易較簡便，能將狗骨中含有的蛋白質充分水解成不同種類的氨基酸，并利用其極性大小的不同，在薄層板上呈現不同的Rf 值，通過展開劑為正丁醇-冰醋酸-水（3 ∶1 ∶1）的薄層方法在薄層硅膠G 板上清晰分離，噴以茚三酮試液，加熱使斑點清晰明顯，以便觀察，呈現一定的特征色譜圖，來用于狗骨藥材的鑒別。各種氨基酸在此條件下進行展開，有些是相互重疊的，因此參考相關的質量標準，選擇纈氨酸作為對照品。其中易混淆品豬骨、牛骨，雖然在性狀上具有相似的特征，但在薄層色譜鑒別條件下不具有狗骨的特征斑點，此方法可更好地用來鑒別不同動物骨。另外，狗骨的來源除了農村家養外，尚有養狗場提供肉狗，資源較豐富，因此使用其他非肉狗類狗骨如寵物狗、警犬等的可能性較少。需要注意的是，為防止已被煎煮過的狗骨混雜其中，影響藥材蛋白質含量，使薄層色譜分離效果變差，建議在收購時宜整架收購，或直接去屠宰場收購。

實驗結果表明：狗骨藥材薄層鑒別方法簡便，準確，重現性好，耐用性好，專屬性強，并且樣品中的油脂等其他成分不影響測定結果，可作為狗骨藥材鑒別的準確方法。該方法的研究十分有利于狗骨藥材的深入開發，為制訂狗骨藥材的質量控制標準奠定基礎，并完善該藥材的質量標準，控制藥材質量，更好的保證中成藥的質量、保障人民用藥安全，同時也為狗骨藥材的開發和廣泛應用提供質量保 證。

本實驗還表明，狗骨蛋白質含量較高，具有一定的藥用價值。中醫中藥研究表明：狗骨具有補腎壯骨，祛風止痛，止血止痢，斂瘡生肌。治風濕痛，腰腿無力，四肢麻木，久痢，瘡瘺，凍瘡的功效。并且炮制后使藥物純凈，酒制去除腥臭味，增強藥用功效。煅制狗骨使藥物質地疏脆，易于粉碎，便于調劑、制劑。關于狗骨的炮制品鑒別研究還有待進一步深入。