植物組培內生菌污染的防治措施

溫璐華，武瑞娜

(河北富碩農業科技發展有限公司，河北 邢臺 054499)

植物內生菌是指在其一生或一生中的某個階段能進入活體植物組織內，并且不引起明顯組織變化的真菌或細菌[1]，主要包括內生細菌、內生真菌和內生放線菌[2]。植物內生菌是一個生態學概念，而非分類學單位[3]。內生菌普遍存在于植物組織中，且難以用常規方法徹底消滅。當植物組織進行離體培養時，這些內生菌就容易引起污染。Leifert[4]等認為在正常的滅菌條件下，由內生菌產生的污染占所有污染源的1/4。污染發生在培養過程早期，往往導致增殖效率降低，材料生長減緩，玻璃化苗增加，甚至培養失敗。發生在后期會導致組培苗移栽困難和死亡。此外，污染還會引起培養材料的遺傳物質變異[5]。

1 植物內生菌污染特性

1.1 內生菌污染與表面菌污染的區別

內生菌存在于植物細胞內或細胞間，在外植體接種后的前幾代培養中不易被肉眼察覺[6]。初代培養中，表面細菌引起的污染通常出現在接種后2～3d，表現為外植體周圍或培養基表面產生明顯的諸如水污狀、油污狀、氣泡，或干縮的呈現紅、黃、乳白等顏色的菌落。接種后3～5d內無癥狀，之后的培養過程中不斷出現菌落，就可能是由內生菌引起的[7]。湯雪燕[8]等認為，內生菌造成的污染發生在接種5d以后，且污染菌從培養基以上部分長起。

1.2 常見內生菌污染種類

內生細菌不能被一般的表面消毒方法所清除，隨材料帶入培養過程引起的污染，稱為內生細菌污染[7]。方麗[9]等發現組培中細菌污染占52.13%，分屬于9個種，主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)和假單胞菌屬(Pseudomonas)；真菌污染占43.87%，分屬于18個種，其中芽枝霉(Cladosporiumspp.)、黑曲霉(Aspergillusniger)、青霉(Penicillumspp.)和酵母為主要污染真菌。沈瑞清[10]等發現污染馬鈴薯組培苗的真菌分屬6屬，至少12種，分別為鐮刀菌屬的5個種，毛霉菌屬的2個種，鏈格孢屬的2個種等。

目前，被鑒定的組培污染內生細菌主要有芽孢桿菌屬(Bacillus)[11]、土壤桿菌屬(Agrobacterium)[12]、葡萄球菌屬(Staphylococcus)[13]、鏈格孢屬(Alternaria)和鐮刀菌屬(Fusarium)[14]等。

1.3 植物內生菌的分布規律

內生菌的分布規律取決于宿主本身及內生菌的種類。在不同宿主，以及同一宿主的不同器官的分布均存在著差異[15]。此外，還受植物的種類、環境和氣候等因素的影響。通常多年生材料攜帶的細菌數較多；田間取得的材料細菌數較溫室內材料多；溫室材料攜帶的細菌數較水培材料多；未經陽光照射過的材料，較經過陽光照射的材料多。[16]選取極幼嫩的胚或幼嫩莖尖等帶菌量較少的材料作為外植體，可減少內生菌污染。

2 組培內生菌污染的預防措施

通過外植體選擇、材料預處理、組培環境的控制，以及殺菌劑、抗生素的使用等措施，能夠有效降低內生菌污染率。

2.1 外植體選擇

生長在土壤中的塊根、塊莖和鱗莖，帶菌量多。表面積相對較大的材料，帶菌量也較多。故應盡量選擇幼嫩的莖尖、胚，并選擇清潔環境下的植物材料作為外植體。

2.2 材料預處理

2.2.1 采用栽培手段降低材料帶菌量 減少外植體帶菌量的栽培手段主要包括促發新枝、暗培養和水培等。侯喜林[17]發現在黑暗條件下黃化培養仙客來實生苗，能夠消除內生菌污染。

2.2.2 用殺菌劑或抗生素對母株進行預處理 采用殺菌劑或抗生素對母株進行連續多日消毒處理，可降低帶菌量。例如，每2～3天噴灑1次消毒液，濃度不宜過高，半個月到1個月之后，可以有效控制母株的內生菌量[18]。同時，為防止內生菌產生耐藥性，抗生素和殺菌劑應復合使用。

2.2.3 其他方法 采用特殊的滅菌方法。周俊輝[19]等利用減壓方法，抽去植物組織中的氣體，使消毒劑更易進入組織內部，增強殺菌效果，污染率相比對照降低43.3%。

采用熱擊處理。宋艷祥[20]等發現對桉樹組培苗采用40 ℃熱擊處理可有效降低內生菌污染率。崔巍[21]等發現，對毛尖紫萼蘚進行40 ℃分段水浴并結合升汞溶液浸泡能夠有效降低污染，但材料接種后全部死亡。因此，不同外植體材料在采用熱擊消毒方法時，需要通過試驗獲得具體的處理溫度和時間。

2.3 改變培養基條件

2.3.1 培養基中添加抑菌劑 在培養基中添加抗生素能夠有效防止細菌污染的發生。黃俊軒[22]等在北美海棠培養基中添加羧芐青霉素(250mgL-1)+卡那霉素(50mgL-1)，獲得良好的脫菌效果。田永亮[23]等發現在葡萄培養基中添加40mgL-1四環素，能夠有效抑制內生菌的滋生，且其對不同葡萄品種的抑菌效果不同。李鳳飛[24]等在榆葉梅培養基中混合添加青霉素鈉300mgL-1、鏈霉素100mgL-1，獲得相對較低的污染率。

在培養基中添加殺菌劑，能夠減少內生真菌污染的發生。許婉芳[25]等研究發現，在金線蓮培養基中加入50%多菌靈，抑菌率達100%。李海峰[26]等研究發現，培養基中添加0.5～1.0mgL-1培福朗能夠有效控制蓮瓣蘭胚培養過程中的真菌污染。張立[27]等研究發現采用濃度80%多福鋅可濕性粉劑800倍液的培養基對降低污染率有良好效果。

2.3.2 調節培養基成分 內生菌生長需要一定的營養條件，通過增加或去除、提高或降低培養基中的某種成分的濃度(鹽分、糖分或者單寧酸等)，創造不適宜的生長環境，使其無法繼續發育而死亡。宋鋒惠[28]等研究發現，除去阿月渾子培養基中的VB1、VB6、煙酸等有機成分(保留肌醇)，對細菌生長有抑制作用，且不影響材料生長增殖。

2.3.3 調節培養基的pHpH值對細菌和真菌細胞內酶的活力、細胞膜的通透性、細胞內外物質的運輸和細胞呼吸等均有很大影響。除歐文氏菌屬之外，大多數細菌在pH<4.5環境下不能生長。因此，可以通過適當調節培養基的pH，來避免大量的細菌污染產生。

3 污染發生后的補救措施

3.1 抗生素在組培細菌污染中的應用

細菌污染通常表現為：菌落分布在培養基表面，呈現黏液狀或渾濁的水漬狀，甚至出現泡沫發酵狀，其中以芽孢桿菌引發的污染最為普遍和嚴重，菌落乳白色，呈滴形云霧狀[29]。

黃俊軒[22]等以北美海棠為試材，在MS培養基中添加250mgL-1羧芐青霉素和50mgL-1卡那霉素，連續3次繼代培養，能夠獲得生長穩定的脫菌苗。王梅[30]等研究發現青霉素G濃度為400mgL-1，能夠有效控制‘章姬’草莓苗內生菌污染。而李穎[31]等以銀白楊、四倍體刺槐、微型月季和地被菊為材料研究發現，青霉素對細菌污染只起到一定抑制作用，并不能殺滅細菌。

不適宜的抗生素種類對組培苗生長具有負面作用。任艷[32]等研究發現，羧卞青霉素對花生組培苗的生長有負面影響。蔡坤秀[33]等研究發現，卡那霉素和鏈霉素對蘆筍的生長有明顯的毒害作用。閻志紅[34]等研究發現，培養基中分別添加青霉素或乳酸，培養數代后西瓜組培苗生長生根受到明顯抑制，二者交替使用，能夠降低其對生長的抑制作用。

針對不同內生細菌污染需要根據細菌的種類選擇適宜的抗生素，并通過試驗確定最小使用濃度，避免抗生素因遇酸、堿或加熱后分解而失去活性，并尋找穩定、耐高溫高壓的抑菌劑。

3.2 殺菌劑在組培真菌污染中的應用

組培真菌污染通常表現為培養容器內出現白色、黑色、綠色等不同顏色的菌絲塊，其中最為常見的是曲霉、毛霉和青霉屬真菌[35]。

常用的殺菌劑有多菌靈、代森錳鋅、百菌清等。李穎[31]等研究發現，采用3 %多菌靈無菌液浸泡被真菌污染的材料0.5h以上之后接種，能夠消除真菌污染。李云海[36]等研究發現，培養基加入75%代森錳鋅對蓮瓣蘭等地生蘭的組織培養過程中出現的真菌污染具有顯著的防治效果。趙雙雙[37]等研究發現，在種子萌發階段使用含0.05%多菌靈的培養基，幼苗生長階段使用含0.05%百菌清的培養基，可明顯抑制組培污染。方麗[38]等研究發現，乙蒜素和鏈土霉素對組培細菌和真菌有良好的殺滅效果，且乙蒜素耐高溫，可以在配制培養基時直接添加。

3.3 其他藥劑的使用

其他藥劑包括防腐劑、乙醇、升汞和一些植物提取物等。李穎[31]等研究發現，采用75%乙醇和0.1%HgCl2處理可以徹底殺滅真菌和細菌。周蔣陳[39]等研究發現，培養基中添加防腐劑苯甲酸鈉和山梨酸鉀，能夠抑制鳶尾組培內生菌的滋生，且耐高溫高壓，但苯甲酸鈉的使用濃度不應超過0.5%，否則會影響組培苗的增殖率。李白[40]等研究發現生姜、洋蔥、大蒜和苦瓜的食用器官的粗提物對分離的組培污染細菌有一定的抑制效果，且與抗生素相比，植物源抑菌劑具有低毒、低殘留、對組培苗傷害小等優勢。