超高壓處理對苦杏仁分離蛋白結構和致敏性的影響

朱乾乾， 陳靜靜， 張 濤， 江 波*

（1.食品科學與技術國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫214122；2.江南大學，食品安全國際聯合實驗室，江蘇 無錫214122）

食物過敏是由于進食含有過敏原的食物引起的免疫反應。癥狀主要包括皮膚瘙癢、咳嗽、惡心、嘔吐等。引起食物過敏的食品主要包括奶類、禽蛋類、魚類、甲殼類、花生、大豆、堅果類和小麥[1]。預防食物過敏的最好方式就是完全避免接觸過敏食物。與此同時，越來越多的研究人員致力于通過食品加工過程來消除或減少食物中的過敏原。大部分過敏原是蛋白質，加工處理會掩蓋或展開引起過敏的抗原表位，從而降低或提高對抗原的識別，進而改變過敏性食物的致敏性。迄今為止，用于消除食物致敏原的加工技術有熱處理、美拉德反應、發酵、輻射、酶法水解和超高壓技術[2]。超高壓技術是一種替代性食品保存技術，具有保留食品感官和營養品質的特性。通過高壓使蛋白質結構破裂或形成非共價鍵、靜電相互作用、疏水相互作用和氫鍵改變蛋白質結構，也可以誘導形成新的二硫鍵來穩定變性蛋白或使蛋白質聚集[3]。近年來，利用超高壓技術降低或消除食品致敏性的報道較多，例如利用超高壓技術來降低牛奶、大豆、花生等食品的致敏性[4]。

苦杏仁是一種富含必需脂肪酸、蛋白質、膳食纖維和其他功能性成分的堅果，油脂質量分數為45%～50%，蛋白質23.6%～26.2%，苦杏仁苷約為3%[5]。據報道，苦杏仁在我國新疆、河北和山東等地種植面積廣，資源豐富，2016年產量達2.6×106噸。現代醫學研究表明，苦杏仁具有止咳、祛痰的功效[6]。杏仁乳是由杏仁和水均質獲得的膠體分散體系，近年來，杏仁乳被作為乳糖不耐癥人群的替代乳品，在市場上廣受歡迎。但苦杏仁含有和美國大杏仁almond相同的過敏原成分amandin[7]。二維電泳結果顯示，美國大杏仁almond種子含有188種不同的蛋白質[8]。據世界衛生組織和國際免疫學會聯盟過敏原命名小組委員會報道，美國大杏仁almond中含有5種 過 敏 原，命 名 為Prudu 3、Prudu 4、Prudu 5、Prudu 6和Prudu 8。Prudu 6是11S類大豆球蛋白，相對分子質量約為3.6×105，被稱為amandin，是美國大杏仁almond最主要的過敏原成分。

國外關于美國大杏仁almond過敏性的研究，主要有熱加工、輻射和超高壓處理。輻射處理不能改變almond杏仁蛋白結構及其致敏性，輻射處理和高壓滅菌，也不能明顯地改變almond杏仁蛋白的結構和致敏性[9]。almond杏仁過敏原熱穩定性好，且不受輻射處理的影響。Li等人通過多克隆抗體的ELISA實驗證明，超高壓處理對almond杏仁致敏性沒有影響，但Santosh Dhakal等人通過amandin的4C10（構型表位）和4F10（線性表位）表位分別制備的抗體，證實超高壓能夠降低美國大杏仁almond的致敏性。在450、600 MPa，30℃處理600 s，4C10相關表位的免疫反應性低于5%，4F10相關表位的免疫反應性大約為50%[10]。而關于超高壓處理對苦杏仁分離蛋白結構和整體致敏性影響等方面的研究比較少。作者研究不同超高壓強度處理對苦杏仁分離蛋白分離物結構和致敏性的影響，以期為超高壓處理在食品致敏性方面的應用提供理論參考和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦杏仁種子：市售；丙烯酰胺、N-N-亞甲基雙丙烯酰胺和四甲基乙二胺：生工生物工程（上海）股份有限公司產品；福林酚、8-苯胺-1-萘磺酸銨鹽：美國Sigma-Aldrich產品；杏仁過敏原ELISA試劑盒：德國Pribolab公司產品；其他化學試劑均為分析純產品。

1.2 儀器與設備

超高壓設備：包頭九久科技發展有限公司產品；紫外可見分光光度計：島津（上海）有限公司產品；圓二色譜：英國應用物理公司產品；F-7000熒光分析儀：日本日立公司產品。酶標儀：美國Molecular Devices公司產品。

1.3 實驗方法

1.3.1 苦杏仁分離蛋白的制備

1）脫脂：將苦杏仁浸泡20 h，去皮，40℃真空干燥10 h。研磨成粉末，以1 g∶10 mL的比例加入丙酮，磁力攪拌2 h進行脫脂，重復3次。在通風櫥中過夜蒸發剩余丙酮，研磨均勻。

2）苦杏仁分離蛋白的提取：以1 g∶10 mL的比例加入pH 8.1的20 mmol/L Tris-HCl的溶液，4℃磁力攪拌2 h，重復兩次，提取粉末中的苦杏仁分離蛋白分離物。8 000g離心20 min，取上清液，過0.45μm纖維素膜[11]。

1.3.2 苦杏仁分離蛋白質量濃度測定 通過福林酚法測定提取液中苦杏仁分離蛋白的質量濃度[12]。取1 mL分離蛋白溶液，與5 mL溶液A和溶液B的混合液（體積比1∶1）反應10 min，再加入0.5 mL的福林酚溶液反應30 min，在650 nm處測定吸光度值。以牛血清蛋白為標樣制定標準曲線，R2=0.99。用pH 8.1的20 mmol/L Tris-HCl的溶液將其稀釋為2 mg/mL，為后面的實驗定量。

1）溶液A：準確稱取10 g碳酸鈉，2 g氫氧化鈉和0.25 g酒石酸鉀鈉溶于500 mL去離子水中。

2）溶液B：準確稱取0.25 g五水合硫酸銅溶解于50 mL去離子水中。

1.3.3 超高壓處理 取5 mL溶液置于超高壓設備腔體中，自動升壓至所需壓力。加壓結束后，瞬間降壓，取出樣品，立即放入冰中保存。在100～500 MPa下處理900 s，研究不同強度的高壓處理對苦杏仁分離蛋白的影響。在500 MPa下處理0～900 s，研究不同加工時間對苦杏仁分離蛋白結構和性質的影響。加壓處理在常溫（25℃）條件下進行。

1.3.4 遠紫外圓二色光譜的測定 將處理前后的苦杏仁分離蛋白溶液樣品稀釋為0.05 mg/mL，將溶液置于1 mm的石英比色皿中，樣品的掃描波長范圍195～260 nm，掃描3次取平均值，步進分辨率為1 nm，采集時間為1 s，帶寬為1 nm，需扣除蛋白溶解緩沖液的背景。在計算中假設氨基酸殘基均值為900，圓二色性以殘基摩爾橢圓率表示，二級結構組成通過系統自帶的CDMN軟件分析。

1.3.5 外源熒光光譜的測定 將處理前后的苦杏仁分離蛋白溶液樣品稀釋成0.20 mg/mL，取20μL的ANS溶液（8.0 mmol/L溶于20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.1））加至4 mL的樣品溶液中，混合均勻，立即在激發波長為550 nm，發射波長為500～850 nm，狹縫為2.5 nm條件下掃描其熒光光譜[13]。

1.3.6 表面疏水性指數（H0）測定 將苦杏仁樣品稀釋成0.005～0.20 mg/mL的溶液[14]。然后將20 μL的ANS溶液（8.0 mmol/L溶于20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.1））加至4 mL的樣品液中，混合均勻，立即在激發波長550 nm，發射波長549 nm，狹縫為2.5 nm的條件下測定其熒光強度。熒光強度相對于蛋白質量濃度的初始斜率，被定義為蛋白表面疏水性指數（H0）。

1.3.7 SDS-PAGE采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）對超高壓處理前后的苦杏仁分離蛋白組分進行分析[6]。電泳分離膠質量濃度為12 g/dL，濃縮膠質量濃度為4 g/dL。將樣品與緩沖液以體積比1∶4混合，沸水浴煮沸10 min后上樣，電壓為120 V。電泳完畢，采用考馬斯亮藍染色液G-250染色2 h，過夜脫色后進行凝膠成像。

1.3.8 苦杏仁分離蛋白致敏性的測定 處理前后樣品的致敏性通過杏仁過敏原ELISA試劑盒進行檢測[15]。取100μL上清液加到96孔酶標板，室溫下孵育20 min。然后每孔加入300μL洗滌緩沖液清洗3次，用力甩干。每孔加入100μL培養物（苦杏仁過氧化物酶）到每孔中，室溫下培育20 min，如前洗滌3次。每孔加入100μL培養基溶液，室溫下允許暗處反應20 min。每孔添加100μL停止液（0.5 mol/L H2SO4）終止酶反應。測定其在450 nm波長處的吸光值。

2 結果與分析

2.1 超高壓處理對苦杏仁分離蛋白二級結構的影響

超高壓處理苦杏仁分離蛋白的圓二色譜圖如圖1所示。苦杏仁分離蛋白的二級結構由α-螺旋、β-折疊、β-轉角及無規則卷曲組成。208 nm和222 nm處出現負峰，表明α-螺旋的存在；218 nm處出現寬的負峰，表明β-折疊的存在。圓二色譜圖顯示，隨著超高壓處理強度逐漸增加，處理前后苦杏仁分離蛋白樣品的負峰對應波長維持不變，負峰強度基本沒有發生變化，表明α-螺旋和β-折疊的含量不變。通過CDMN軟件分析組分含量，與圖譜顯示信息一致。研究結果顯示，超高壓處理不影響蛋白樣品的二級結構，該處理方法對苦杏仁分離蛋白二級結構的構成所引起的致敏性沒有顯著影響。

圖1 超高壓處理對苦杏仁分離蛋白圓二色譜圖的影響Fig.1 CD results of bitter apricot kernel protein isolate subjected to different pressure treatments under the same processing time

2.2 超高壓處理對苦杏仁分離蛋白三級結構的影響

圖2 描述了不同強度超高壓處理以及500 MPa處理不同時間對應的苦杏仁分離蛋白熒光光譜圖。由圖可知，當超高壓處理的時間固定為900 s時，隨著壓強的增加，苦杏仁分離蛋白在波長為500～850 nm的范圍內，熒光強度增加，壓強達到500 MPa時，熒光強度顯著增加，表明苦杏仁分離蛋白的疏水區域增加。另外，當壓強固定為500 MPa時，隨著加壓時間的增加，熒光強度逐漸增加。在較高壓強與較長時間的條件下，超高壓處理可能導致疏水性基團的暴露，改變苦杏仁分離蛋白的三級結構，影響苦杏仁分離蛋白的構型表位，進一步降低或增加苦杏仁分離蛋白致敏性。

2.3 超高壓處理對苦杏仁分離蛋白表面疏水性的影響

為進一步研究超高壓處理對苦杏仁分離蛋白三級結構的影響，證明熒光強度的增加是由于疏水性基團暴露所引起的，作者研究了不同壓強、時間處理后苦杏仁分離蛋白的表面疏水性變化，結果如圖3所示。表面疏水性通常被用作蛋白構象改變的探針。100～400 MPa處理900 s時，苦杏仁分離蛋白的表面疏水性沒有發生明顯變化，當壓強達到500 MPa時，表面疏水性顯著增加。在500 MPa的強度下處理不同時間，隨著加壓時間的增大，表面疏水性逐漸增大。表面疏水性的變化趨勢表明超高壓處理導致蛋白結構的展開，使內部疏水區域暴露，從而增強了表面疏水性強度。

圖2 不同壓強處理900 s和500 MPa處理不同時間對苦杏仁分離蛋白熒光光譜的影響Fig.2 Fluorescence spectroscopy results of bitter apricot kernel protein isolate subjected to 500 MPa pressure treatment for 900 s

圖3 不同壓強處理900 s和500 MPa處理不同時間對苦杏仁分離蛋白表面疏水性的影響Fig.3 Surface hydrophobicity results of bitterapricot kernelproteinisolate that were subjected to 500 MPa pressure treatment for 900 s

2.4 超高壓處理對苦杏仁分離蛋白SDS-PAGE的影響

在非還原電泳中，苦杏仁主要蛋白amandin主要由相對分子質量為61 000和63 000的多肽組成。每個多肽都由一個酸性亞基（42 000～46 000）和一個堿性亞基（20 000～22 000）組成，亞基之間通過二硫鍵相連[19]。在存在還原劑的條件下，amandin的SDS-PAGE圖顯示相對分子質量為44 000、42 000、28 000的條帶或41 000、39 000、22 000和21 000大小的條帶。超高壓處理前后杏仁蛋白的SDSPAGE結果如圖4所示，未處理杏仁蛋白（通道0）的泳道中可以清晰地看到61 000、63 000、41 000和39 000的多肽條帶，在100～400 MPa處理900 s時，苦杏仁分離蛋白的條帶沒有發生明顯變化；當超高壓的強度為500 MPa，處理900 s時，伴隨有大相對分子質量條帶的減弱，以及小相對分子質量條帶的形成。SDS-PAGE圖也顯示500 MPa處理0～300 s時，多肽條帶不會改變；當處理600、900 s時，61 000和63 000的條帶強度減弱，伴隨有約45 000大小的條帶生成，可能是由于苦杏仁分離蛋白的不完全裂解造成的。結果與Sathe等人結果一致，他們認為在450～600 MPa壓力強度處理時，杏仁蛋白amandin相對分子質量為61 000和63 000的條帶逐漸減弱，伴隨著20 000和40 000條帶的生成[10]。超高壓處理可能使蛋白質結構展開，導致二硫鍵的斷裂或重組。

圖4 不同壓強處理900 s和500 MPa壓力下處理不同時間對苦杏仁分離蛋白SDS-PAGE的影響Fig.4 SDS-PAGE results of bitter apricot kernel protein isolate subjected to 500 MPa for 900 s

2.5 超高壓處理對苦杏仁分離蛋白致敏性的影響

圖5 顯示超高壓處理后苦杏仁分離蛋白的免疫反應性發生了變化，100～500 MPa處理900 s后，苦杏仁分離蛋白的致敏性逐漸降低。在500 MPa處理900 s的條件下，苦杏仁分離蛋白的致敏性可以降低到25.69%，所以在后續實驗中采用此壓力強度。由圖可知，500 MPa處理0～900 s，杏仁蛋白的免疫反應性顯著下降，900 s時免疫反應性的下降最為顯著。苦杏仁分離蛋白經超高壓處理后致敏性的下降，可能是由于超高壓處理引起蛋白質構象的變化引起的。Li等認為超高壓處理能夠引起大豆蛋白結構的伸展與變性，也能引起蛋白質的解聚或聚合[17]。

圖5 不同壓強處理900 s和500 MPa處理不同時間對苦杏仁分離蛋白免疫反應性的影響Fig.5 ELISA results of allergens in bitter apricot kernel protein isolate subjected to 500 MPa for 900 s

3 結語

超高壓處理在降低食品的免疫反應性方面提供了潛在的能力，此處理方式對食品質量和營養特性不會產生不利影響。圓二色譜和熒光光譜結果表明，超高壓處理不能顯著改變苦杏仁分離蛋白的二級結構，但可以通過疏水性基團的暴露，增加杏仁蛋白質的表面疏水性，使蛋白質的三級結構展開，增強其熒光強度。超高壓處理對苦杏仁分離蛋白三級結構的改變，可能破壞其構象表位，引起苦杏仁致敏性的變化。ELISA結果表明，500 MPa處理900 s，苦杏仁分離蛋白的免疫反應性可以降低至25.69%。總的來說，這項研究表明超高壓技術可以作為降低食品致敏性的新型食品加工技術，用于改善苦杏仁產品的質量，增加其潛在的應用價值。