綠豆抗氧化肽的酶法制備及其抗氧化活性

夏吉安， 黃 凱， 李 森， 宋洪東， 管 驍

（上海理工大學 醫療器械與食品學院，上海200093）

抗氧化性的多肽屬于天然抗氧化物，安全性高，可作為添加劑或者食品原料廣泛應用于食品和藥品的生產中，具有較廣闊的發展前景[1-5]。

綠豆是一種在世界各地廣泛種植的豆科類植物，在我國有著悠久的種植歷史[6]。綠豆富含碳水化合物、蛋白質、礦物質和多種維生素，其蛋白質質量分數高達19.5%～33.1%，是蛋白質的良好來源[4]。綠豆蛋白主要包含球蛋白、清蛋白、醇溶蛋白以及谷蛋白，其中球蛋白和清蛋白含量最多。綠豆蛋白質是由17種氨基酸構成，其中包括7種必需氨基酸[7]。綠豆肽是通過酶水解綠豆蛋白獲得的寡肽混合物，綠豆肽比綠豆蛋白具有更高的溶解度和吸水性，更低的黏度和更高的流動性。此外，綠豆肽還包含多種生物活性成分[8-9]。我國綠豆資源豐富，但是精深加工程度低，主要集中在綠豆淀粉的加工生產方面，綠豆蛋白則是綠豆淀粉加工過程中的廢棄物，其利用程度較低。使用酶解技術對綠豆蛋白進行深度開發，制備具有抗氧化活性的綠豆多肽是提高綠豆資源利用率的有效途徑[10]。

作者以綠豆蛋白為原料，選取中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶以及中性蛋白酶與堿性蛋白酶復合，在不同酶解時間和加酶量的條件下對綠豆蛋白進行酶解，得到綠豆抗氧化肽，并對其抗氧化活性進行測定。最后，以凝膠過濾層析法分離純化最優酶解條件下得到的酶解液，根據測定得到的體外抗氧化指標，挑選出抗氧化性能最優的組分，為綠豆抗氧化肽在天然抗氧化劑和保健食品領域的應用提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

綠豆蛋白粉：購于陜西雙瑞生物科技有限公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g）：購于西亞化學技術有限公司；DPPH、中性蛋白酶（100 000 U/g）：購于上海維塔化學試劑有限公司；胰蛋白酶（50 000 U/g）、胃蛋白酶（1 200 U/g）：購于上海滬試化工有限公司；BCA蛋白濃度試劑盒：購于碧云天生物技術有限公司；氫氧化鈉、鐵氰化鉀、無水三氯化鐵、三氯乙酸、硫酸亞鐵銨、鹽酸、無水乙醇等試劑均為分析純試劑。

Synergy HTX多功能微孔板檢測儀：美國伯騰儀器有限公司產品；HimacCR22N高速冷凍離心機：天美（中國）科學儀器有限公司產品；低溫恒溫槽：上海衡平儀器儀表廠產品；FE20 pH計、ME204E電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產品；酶反應器：上海壘固儀器有限公司產品；IKARO5多點磁力攪拌器：艾卡儀器設備有限公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠豆蛋白酶解液的制備方法 配制底物質量分數為3%的綠豆蛋白溶液。用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液與鹽酸溶液調節綠豆蛋白溶液的pH至蛋白酶的最適pH。稱取蛋白酶（加酶量為質量分數6%）加入綠豆蛋白溶液中，酶反應器的溫度設定為該蛋白酶的最適溫度。使用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液與鹽酸溶液調節pH值，使得整個酶解過程中酶解液的pH始終在蛋白酶的最適pH區域。持續酶解3 h后，沸水浴10 min滅酶。將酶解液冷卻至室溫，置于低溫離心機中8 000 r/min離心10 min，取上清液即得到綠豆蛋白酶解液。

1.2.2 不同蛋白酶對綠豆蛋白酶解效果的影響選用中性蛋白酶、堿性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶分別在各種蛋白酶的最適溫度、pH條件下對綠豆蛋白進行酶解，酶解時間為3 h，通過測定酶解產物抗氧化活性來選取合適的蛋白酶。

1.2.3 組合酶對綠豆蛋白酶解效果的影響 分別配制5份底物質量分數為3%的綠豆蛋白溶液，樣品從1—5編號。1號樣品為中性蛋白酶單酶水解4 h；2號樣品為中性蛋白酶水解3 h后堿性蛋白酶水解1 h；3號樣品為中性蛋白酶水解2 h后堿性蛋白酶水解2 h；4號樣品為中性蛋白酶水解1 h后堿性蛋白酶水解3 h；5號樣品為堿性蛋白酶單酶水解4 h。添加中性蛋白酶時調節pH至7，滅酶后再添加堿性蛋白酶時調節pH為8，在1—4號樣品中加入中性蛋白酶（加酶量為質量分數6%），在5號樣品中加入堿性蛋白酶（加酶量為質量分數6%），于50℃下酶解。1天后，將4號樣品取出沸水浴滅酶，再加入堿性蛋白酶繼續酶解，后續操作類似。整個酶解過程為4 h，使用0.5 mol/L氫氧化鈉溶液與鹽酸溶液調節pH值，使得整個酶解過程中酶解液的pH始終為蛋白酶的最適pH。酶解結束后，將所有樣品滅酶，離心，取上清液測其體外抗氧化指標[11]。

1.2.4 不同酶解時間對綠豆蛋白酶解效果的影響質量分數3%的綠豆蛋白溶液在加酶量為質量分數6%、溫度50℃、pH 7的條件下，分別水解0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 h后，取出30 mL酶解液，沸水浴滅酶10 min，再將樣品冷卻至室溫，8 000 r/min離心10 min，取上清液，測其體外抗氧化指標[12]。

1.2.5 不同酶用量對綠豆蛋白酶解效果的影響質量分數3%的綠豆蛋白溶液在水解溫度50℃、pH為7.0、酶用量分別質量分數為2%、4%、6%、8%、10%的條件下，水解3 h，沸水浴滅酶10 min，再將樣品冷卻至室溫，8 000 r/min離心10 min，取上清液，測其體外抗氧化指標[13]。

1.2.6 綠豆蛋白酶解液的分離純化 采用凝膠過濾層析法對綠豆蛋白酶解液（酶解條件：中性蛋白酶質量分數2%、底物質量分數為3%、溫度50℃、pH 7.0、水解3 h）進行分離純化。選用SephadexG-25填料，將處理好的填料裝入層析柱中。凝膠柱通過預處理、裝柱、平衡后，緩慢加入經0.45μm超濾膜過濾后的樣品，樣品質量濃度為100 mg/mL，進樣量為3 mL。洗脫液為去離子水，洗脫流量控制在0.7 mL/min，每10分鐘收集一管，紫外檢測波長220 nm，收集各峰處的洗脫液后濃縮，測定蛋白質濃度以及體外抗氧化指標[14]。

1.2.7 DPPH自由基清除能力的測定 用無水乙醇配置0.1 mmol/L的DPPH溶液，避光保存。將1 mL測試樣品溶液加入到1 mL DPPH溶液中，混勻，室溫下避光靜置30 min后在517 nm處測定其吸光度，同時測定1 mL DPPH溶液與1 mL乙醇混合后的吸光度，以及1 mL測試樣品溶液與1 mL無水乙醇混合后的吸光度，計算清除率[15]。

1.2.8 還原能力的測定 取0.4 mL樣品和1 mL PBS（pH 6.6，0.2 moL/L）以及1 mL質量分數為1%鐵氰化鉀溶液混合，50℃水浴20 min，冷卻后加1 mL質量分數為10%三氯乙酸溶液混勻，靜置15 min。取1 mL上清液，加入0.2 mL質量分數為0.1%三氯化鐵溶液和1 mL去離子水。10 min后，把樣品吸入96孔板中，在700 nm處測吸光度，吸光度值越高，則還原能力越強[16]。

1.2.9 羥基（OH）自由基清除能力的測定 采用Fenton反應法，取1 mL樣品溶液分別加入1 mL 2 mmol/L硫酸亞鐵溶液、1 mL 6 mmol/L水楊酸溶液以及1 mL 6 mmol/L過氧化氫溶液，混勻，于510 nm處測定吸光度，用去離子水代替樣品溶液測定吸光度，用去離子水代替過氧化氫溶液測定吸光度，計算清除率[17]。

1.3 數據處理

每組實驗重復3次，實驗結果分析取平均值±標準差。采用GraphPad Prism 17.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 蛋白酶的選擇

選用中性蛋白酶（反應溫度50℃，pH 7）、堿性蛋白酶（反應溫度50℃，pH 8）、胰蛋白酶（反應溫度50℃，pH 8）、胃蛋白酶（反應溫度37℃，pH 2）4種蛋白酶酶解綠豆蛋白，酶解時間為3 h，酶用量為質量分數6%，測定酶解產物的體外抗氧化活性圖1（a）為各蛋白酶酶解產物的DPPH自由基清除率，由圖可以看出各蛋白酶酶解產物的DPPH自由基清除率均高于未經過酶解的綠豆蛋白溶液，其中中性蛋白酶酶解產物的清除率明顯高于其他3種蛋白酶的酶解產物，并且可以看出DPPH自由基清除率與酶解產物的濃度呈正相關性。隨著酶解產物濃度的增大，DPPH自由基清除率逐步增大，抗氧化能力越強。圖1（b）為各酶解產物的還原能力，與DPPH自由基清除率相同，各蛋白酶酶解產物的還原能力均高于未經過酶解的綠豆蛋白液，其中中性蛋白酶酶解產物的還原能力略高于其他3種蛋白酶的酶解產物。同樣可以看出，還原能力與酶解產物的濃度也呈正相關。隨著酶解產物濃度的增大，吸光度值越高，抗氧化能力越強。

選用中性蛋白酶與堿性蛋白酶組合酶解綠豆蛋白，測定酶解產物的抗氧化能力。圖2（a）為酶解產物的DPPH自由基清除率，由結果可知，中性蛋白酶酶解產物的DPPH自由基清除率明顯高于組合酶以及堿性蛋白酶酶解的產物，且隨著中性蛋白酶酶解時間減少以及堿性蛋白酶的酶解時間增加，清除率呈下降趨勢。圖2（b）為酶解產物的還原能力，中性蛋白酶酶解產物的還原能力與組合酶相當，略高于堿性蛋白酶酶解的產物。

圖1 不同蛋白酶酶解綠豆蛋白產物的抗氧化能力Fig.1 Antioxidant ability of different proteases to enzymolysis mung bean protein products

綜合各蛋白酶以及組合酶酶解綠豆蛋白產物的抗氧化能力來看，中性蛋白酶酶解產物的抗氧化效果最好，可作為制備綠豆抗氧化肽的最優蛋白酶。此結果也與李琴等人的實驗結果相符[13]。

圖2 組合酶酶解綠豆蛋白產物的抗氧化能力Fig.2 Antioxidant ability of combined enzymes to enzymolysis mung bean protein products

2.2 酶解時間的選擇

底物質量分數3%的綠豆蛋白在加酶量質量分數6%（中性蛋白酶）、溫度50℃、pH 7的條件下，分別酶解0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0 h后，滅酶取上清液后測其抗氧化指標。從圖3（a）中可以看出，隨著酶解時間的增加，酶解產物的DPPH清除率呈現出先增長后減緩的趨勢，并在3 h處達到清除率的頂峰。從圖3（b）中可以發現，酶解產物的還原能力相差不大，3 h處的還原能力略高于其他時間。分析原因可能是，酶解時間不足3 h時，水解不夠充分，當酶解時間超過3 h時，水解過度，綠豆蛋白被水解成了抗氧化活性較差的寡肽或者游離氨基酸，因而水解產物的抗氧化活性降低。所以選擇酶解時間為3 h。

2.3 加酶量的選擇

圖3 不同酶解時間綠豆蛋白酶解產物的抗氧化能力Fig.3 Antioxidant ability of mung bean proteolysis products with different enzymatic time

底物質量分數3%的綠豆蛋白在水解溫度50℃、pH 7、中性蛋白酶加酶量（質量分數）分別為2%、4%、6%、8%、10%的條件下，水解3 h，然后滅酶，離心取上清液，測體外抗氧化指標。圖4（a）為DPPH自由基清除率，隨著酶用量的增大，清除率先減小后緩慢增加，加酶量為質量分數2%時DPPH自由基清除率為最大值。圖4（c）為羥基自由基清除率，與DPPH自由基清除率變化相同，也是隨著酶用量的增大，清除率先減小后緩慢增大，加酶量為質量分數2%時，羥基自由基清除率為最大值。分析原因可能是，底物質量分數不變時，隨著加酶量的增加，綠豆蛋白被充分水解成了抗氧化活性相對較差的肽段。圖4（b）為還原能力與酶解時間關系，由圖可知，各組之間的還原能力差距不大，隨著酶用量的增大，還原能力略微增大，而且還原能力的體系所呈現出的組間差別并沒有清除率那么大。綜合DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率以及生產成本的角度來看，選擇質量分數2%的加酶量為最適加酶量條件。

圖4 不同加酶量綠豆蛋白酶解產物的抗氧化能力Fig.4 Antioxidant ability of mung bean proteolysis products with different enzyme contents

2.4 優化酶解條件下綠豆蛋白酶解產物的抗氧化能力

根據前期對綠豆蛋白酶解條件優化實驗的結果，得出最優酶解條件：用中性蛋白酶酶解綠豆蛋白，在pH 7、溫度50℃、底物質量分數3%、加酶量為質量分數2%的條件下，酶解3 h，后滅酶，離心取上清液，最后凍干得到綠豆肽，測定其抗氧化能力。圖5（a）中可看出，DPPH自由基清除率與酶解得到綠豆肽的質量濃度呈正相關性，隨著綠豆肽質量濃度的增大，其DPPH自由基清除率逐漸增大，這與酶種類選擇的實驗中酶解產物的濃度與DPPH自由基清除率呈正相關的結論一致。質量濃度為1、5、10 mg/mL的綠豆肽DPPH自由基清除率分別是（29.37±0.9）%、（91.58±2.44）%、（96.16±2.2）%，其中5 mg/mL綠豆肽的DPPH自由基清除率與圖5（c）中500μg/mL谷胱甘肽的DPPH自由基清除率相當，說明該綠豆肽具有較好的抗氧化能力。圖5（b）中可以看出，還原能力與酶解得到綠豆肽的質量濃度呈正相關，隨著綠豆肽質量濃度的增大，其DPPH自由基清除率逐漸增大，這同樣與酶種類選擇的實驗中酶解產物的質量濃度與還原能力呈正相關的結論一致。質量濃度為1、5、10 mg/mL綠豆肽的吸光度值分別為0.11±0.01、0.18±0.01、0.31±0.03，吸光度值逐漸增大，還原能力也逐漸增強，其中5 mg/mL綠豆肽的還原能力與圖5（d）中100μg/mL谷胱甘肽的還原能力相當，表明了優化酶解條件下綠豆蛋白酶解產物具有較好的抗氧化能力。

圖5 優化酶解條件下綠豆蛋白酶解產物以及谷胱甘肽的抗氧化能力Fig.5 Antioxidant capacity and mung bean proteolysis products under optimal enzymatic conditions

2.5 優化酶解條件下綠豆肽的分離純化及其抗氧化活性

將優化酶解條件后得到的綠豆肽用凝膠過濾層析法分離純化，收集峰值處組分，測其體外抗氧化指標。從圖6中可以看出，洗脫過程中按照洗脫時間的先后順序共出現5個明顯的峰，分別收集得到組分1—5，測其體外抗氧化指標與未分離多肽的抗氧化指標進行比較。圖7（a）為未分離多肽與分離的5個組分的DPPH自由基清除率，由圖可知，未分離多肽的自由基清除率高于組分2和組分3，但是低于組分1、組分4和組分5。組分5的清除率最高，為組分4清除率的2.6倍；其次是組分1，為組分4的2倍。圖7（b）為未分離多肽與分離的5個組分的還原能力，與DPPH自由基清除率的結果相似，組分5的還原能力最高，是組分4的4.7倍。按照圖6中出峰時間來判斷，組分5出峰時間最晚，為相對分子質量較小的肽段，該分析結果也符合其他參考文獻的結論，即相對分子質量較小肽段的抗氧化能力超過相對分子質量較大肽段和未分離多肽[2，18-19]。因此，小分子肽段組分5可作為綠豆蛋白酶解得到的抗氧化性能最好的蛋白肽段。而組分5的進一步分離純化以及鑒定工作則需要在后續的實驗中繼續探究。

圖6 綠豆肽層析圖譜Fig.6 Mung bean peptide chromatogram

圖7 綠豆肽分離組分抗氧化能力Fig.7 Antioxidant ability of mung bean peptide separation components

3 結語

以綠豆蛋白為原料，分別選用堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶以及組合酶分別在其最適溫度、pH條件下對綠豆蛋白酶解，再用酶解時間和加酶量作為單因素條件，以DPPH自由基清除率、還原能力以及羥基自由基清除率作為判斷酶解效果的指標。得到了綠豆蛋白最佳酶解條件為：中性蛋白酶酶解，底物質量分數3%，酶解時間3 h，加酶量為質量分數2%，pH 7.0，溫度50℃，該條件下制備的綠豆蛋白酶解產物的抗氧化性能最好。質量濃度為5 mg/mL時，DPPH自由基清除率已高達（91.58±2.44）%，與500μg/mL谷胱甘肽的DPPH自由基清除率相當，且具有較強的還原能力。另通過凝膠過濾層析分離綠豆肽，測其抗氧化能力，相對分子質量較小的肽段組分5為抗氧化效果最好的肽段。