高效降解檸檬酸酵母菌的篩選鑒定及其在紅樹莓果汁中降酸特性

陳思睿，唐琳琳，馮建文，孫麗娜，王金玲,4,

（1.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.呼倫貝爾眾合源農業科技有限公司，內蒙古 呼倫貝爾 021000；3.大連市現代農業生產發展服務中心，遼寧 大連 116036；4.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040）

水果中相當一部分干物質是有機酸，不同種類的水果中有機酸種類和含量差異很大[1]。紅樹莓有機酸含量高且主要是檸檬酸[2]，導致紅樹莓產品口感不佳，糖酸比不協調，限制了紅樹莓的開發利用。相關研究表明，水果型飲料中高濃度的有機酸和低pH值對于人牙釉質和牙本質具有腐蝕作用[3-4]。因此，采用有效方法降低紅樹莓汁的檸檬酸含量，提高pH值，保留活性成分并形成良好風味，成為了開發紅樹莓產品的研究重點。

果汁降酸的方法主要包括化學降酸、物理降酸、生物降酸?；瘜W降酸是通過添加降酸劑進行降酸，效果明顯，操作簡單，但會對原料成分、色澤、風味和穩定性產生一定影響。常用物理降酸法有離子交換樹脂降酸法、電滲析降酸法、低溫冷凍降酸法等，主要是針對酒石酸的降酸[5]。生物降酸是指微生物以有機酸為碳源，利用并分解有機酸，從而達到降酸目的；一種是蘋果酸-乳酸發酵法[6-7]，不適用于檸檬酸降酸；另一種采用酵母菌發酵，使得有機酸通過相關代謝降解[5]。何志剛等[8]從自然發酵的枇杷酒和刺葡萄酒中分離出2 株釀酒酵母菌，應用于枇杷酒和葡萄酒發酵，分別使總酸下降了16.60%、11.07%和13.76%、8.59%。

目前，對于降低高酸果汁中檸檬酸的菌株及其接種后對果汁有機酸變化影響的研究較少。本研究從紅樹莓果園泥土和紅樹莓鮮果中篩選降酸效果最好的菌株，測定發酵過程中有機酸的變化，利用生理生化測定和內轉錄間隔區（internal transcribed spacer，ITS）序列測定對降酸菌株進行鑒定，旨在為降低高檸檬酸果汁酸度及菌株后續的實際應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

采集哈爾濱阿城區紅樹莓種植園地表下5～10 cm處土壤和紅樹莓鮮果作為樣品。取土壤2 g和適量紅樹莓鮮果分別加到盛有100 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中，并加入8～12 粒無菌玻璃珠，室溫150 r/min振蕩20 min，取出靜置得上清液。

紅樹莓購自黑龍江省尚志市，品種為秋福，速凍處理后運回東北林業大學食品科學與工程實驗室凍藏。

1.1.2 培養基

麥芽汁培養基配制參照文獻[9]；酵母生孢子培養基配制參照文獻[10]；孟加拉紅培養基購自北京奧博星生物技術有限責任公司；檸檬酸培養基：(NH4)2SO42 g，KH2PO42.5 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，酵母膏0.5 g，檸檬酸20 g，溶于1 L蒸餾水中，取100 mL配制溶液分裝于250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min。配制固體培養基時，檸檬酸加入200 mL蒸餾水中，其他成分溶于800 mL蒸餾水中，加瓊脂粉25 g，分別在121 ℃滅菌20 min，冷卻到50～60 ℃，混勻后倒平板[11]。

1.1.3 試劑

酵母菌鑒定生化管 上海江萊生物科技有限公司；檸檬酸、L-蘋果酸、α-酮戊二酸、琥珀酸標準品（色譜純） 上海源葉生物科技有限公司；甲醇（色譜純）賽默飛世爾（中國）有限公司；DNA膠回收試劑盒、真菌基因組DNA抽提試劑盒 生工生物工程（上海）股份有限公司；常規藥品試劑均為國產分析純或優級純。

1.2 儀器與設備

HZQ-X100振蕩培養箱 哈爾濱市東明醫療儀器廠產品；PHS-3C型pH酸度計 上海精密科學儀器有限公司；SW-CJ-1FD型單人凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司；YJ-2005M型生物顯微鏡 寧波天宇光電科技有限公司；DH6000A型電熱恒溫培養箱 天津市泰斯特儀器有限公司；5030-PVL型高壓滅菌鍋 長春百奧生物儀器有限公司；Verity 96well型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國ABI公司；FR-980A型凝膠成像儀 上海復日科技有限公司；DYY-6C型電泳儀 北京六一儀器廠；1260 Infinity II液相色譜儀美國安捷倫科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅樹莓果汁預處理

紅樹莓凍果自然解凍后，榨汁機打漿1 min，在水浴鍋中進行酶解，酶解條件為50 ℃、2 h，果膠酶（40 000 U/g）添加量為0.02%（質量分數）。酶解結束后，置于90 ℃水浴鍋中滅酶5 min，經8 層紗布過濾取果汁，置于滅菌錐形瓶中，巴氏殺菌后冷卻，待用[12-13]。

1.3.2 菌種篩選和分離純化

取1.1.1節預處理的上清液5 mL，接入檸檬酸質量濃度為2 g/L且以檸檬酸為唯一碳源的錐形瓶中，在裝液量100 mL/250 mL、28 ℃、120 r/min條件下振蕩培養24 h。以同樣條件依次將所培養的菌液轉接，連續轉接培養5 次，檸檬酸質量濃度由4、8、12、16 g/L逐漸遞增到20 g/L；通過初篩和復篩，選出對檸檬酸具有較好降酸效果的菌株，挑取單菌落重復平板劃線純化培養[4,11]。

1.3.3 降酸菌降酸效果

將分離到的菌株在裝液量100 mL/250 mL、28 ℃、120 r/min條件下培養24 h，制成種子液，活菌數為8×107CFU/mL，以接種量4%（體積分數）接種于檸檬酸液體培養基中，培養基裝液量為50 mL/250 mL，28 ℃靜置發酵8 d。發酵期間，每1 d取樣測定總酸含量，比較菌株降酸能力，選擇降酸速度快和降酸量高的菌株。

將上述降酸效果較好菌種的種子液，以接種量4%接種于1.3.1節制得的紅樹莓果汁中，果汁裝液量為50 mL/250 mL，以未接菌的紅樹莓果汁作為對照，28 ℃靜置發酵8 d，發酵期間，每1 d取樣測定pH值和總酸含量，采用高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法對紅樹莓果汁中有機酸進行定量和定性分析，驗證酵母菌的降酸效果。

1.3.4 菌株形態學鑒定

進行平板培養和菌體染色鏡檢，觀察菌落的生長特征和菌株的形態特征。

菌落培養特征：將菌液稀釋涂布于麥芽糖平板培養基上，28 ℃恒溫培養2～3 d，觀察菌落形態。經美藍染色后[14]，顯微鏡觀察菌株細胞形態及芽殖方式。采用芽孢染色法，觀察菌株子囊孢子形狀及每個子囊內子囊孢子的數目[8]。

液體培養基培養特征：將菌株活化后挑取單菌落接種于100 mL麥芽汁液體培養基中，28 ℃恒溫培養2～3 d，觀察液體培養基中菌體培養狀態。

1.3.5 菌株生理生化鑒定

參照文獻[15-16]的方法進行降酸菌株的糖發酵、同化碳源、同化氮源實驗等生理生化鑒定。

1.3.6 分子生物學鑒定

采用真菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株基因組DNA，以此基因組DNA為模板，使用ITS的通用引物：ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），擴增ITS序列。PCR條件：94 ℃預變性4.0 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.0 min，30 個循環；72 ℃延伸10.0 min。測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成，將測得的ITS序列在美國國家生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）進行BLAST分析，在GenBank核酸序列數據庫中搜索同源序列，與已知序列進行比較分析，找出與其相似性最高的菌株，確定菌株的生物學分類地位[17-18]，利用MEGA Version 7軟件構建系統發育樹。

1.3.7 指標測定

1.3.7.1 總酸和pH值測定

總酸測定參考GB/T 12456—2008《食品中總酸的測定》中電位滴定法，以檸檬酸計；pH值用pH計測定。

1.3.7.2 降酸率的計算

式中：A0為未發酵樣品中總酸或有機酸的質量濃度；A1為發酵結束后總酸或有機酸的質量濃度。

1.3.7.3 有機酸組分測定

HPLC條件：色譜柱Agilent ZORBAX Extend-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A為0.5% KH2PO4溶液（用磷酸調節pH 2.5），流動相B為甲醇，A-B體積比為97∶3；等度洗脫10 min，流速0.7 mL/min，進樣量10 μL，柱溫35 ℃，檢測波長210 nm。依次測定標準品系列和樣品。采用外標法對樣液中的有機酸定量。

標準曲線：分別用純凈水溶解配制不同質量濃度的L-蘋果酸、α-酮戊二酸、檸檬酸、琥珀酸混合標準溶液，經0.22 μm的微孔濾膜過濾后進行HPLC分析，得到峰面積（x）和有機酸質量濃度（y）的回歸方程及相關系數。

樣品處理：樣品4 000 r/min離心15 min[19]，吸取上清液于容量瓶中，用超純水定容，混勻，稀釋為適合濃度。用0.22 μm濾膜過濾后上機測定。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 降酸菌篩選

用檸檬酸固體培養基對降酸菌株進行篩選，結果顯示，共有8 株菌可利用檸檬酸生長，分別接種到檸檬酸液體培養基中，比較菌株降酸能力，選擇降酸速度快且降酸量高的菌株。

圖1 各菌株的降酸效果Fig. 1 Deacidification abilities of eight isolates

由圖1可知，不同菌株的降酸效果不同，總酸降低速率均呈先增加后降低趨勢。其中來自土壤的菌株T2和來自果實的菌株G4降酸效果最好。在發酵8 d后，菌株T2總酸質量濃度從20 g/L下降到7.25 g/L，菌株G4下降到6.55 g/L，均可降解60%以上的總酸，其他菌株的降酸效果不如這2 株菌，故選擇對降酸效果最好的菌株T2和G4進行進一步研究。

2.2 紅樹莓果汁降酸效果

將菌株T2和G4分別接入總酸質量濃度（以檸檬酸計）25.16 g/L、pH 3.08的紅樹莓果汁中，28 ℃靜置發酵8 d，以未接菌紅樹莓果汁為對照，測定發酵過程中不同時間所取樣品的總酸和pH值。

圖2 發酵過程中紅樹莓果汁總酸和p值變化Fig. 2 Variations in total acidity and pH of red raspberry juice during fermentation and storage

由圖2可知，對照果汁中總酸和pH值的變化很小，接入降酸菌的果汁與對照果汁相比，變化明顯。菌株T2和G4在發酵過程中總酸變化不穩定，但總體呈下降趨勢，pH值也相應發生了一定變化。發酵8 d后，菌株T2使果汁總酸質量濃度下降到11.24 g/L，降解果汁中55.32%的總酸，pH值由3.08上升到3.27；菌株G4使果汁總酸質量濃度下降到9.96 g/L，降解果汁中60.41%的總酸，pH值由3.08上升到3.36。

2.3 紅樹莓果汁降酸過程中有機酸變化

2.3.1 樣品測定結果

圖3 標準品和紅樹莓果汁有機酸色譜圖Fig. 3 HPLC chromatograms of organic acid standards and red raspberry juice

由圖3a可知，有機酸混合標準溶液分離效果良好。圖3b～d為樣品稀釋20 倍發酵8 d的檢測結果，3號色譜峰為檸檬酸色譜峰，發酵結束后峰面積明顯變小，可知降酸菌將紅樹莓果汁中的檸檬酸進行了降解。

2.3.2 降酸發酵過程中有機酸的變化

圖4 菌株T2（a）和菌株G4（b）發酵過程中紅樹莓汁有機酸含量變化Fig. 4 Variations in organic acid concentrations of red raspberry juice during fermentation with strains T2 (a) and G4 (b)

發酵所使用的紅樹莓果汁總酸質量濃度為25.16 g/L，檸檬酸質量濃度為22.87 g/L，占總酸的90.9%，所以檸檬酸為紅樹莓果汁中的主要有機酸，可通過降解檸檬酸進而降低果汁總酸。由圖4可知，隨著靜置發酵時間的延長，接種菌株T2和G4的果汁中檸檬酸含量持續下降，L-蘋果酸含量整體均呈下降趨勢，琥珀酸含量在第1天增加后呈下降趨勢，L-蘋果酸和琥珀酸含量均在5～8 d保持在相對穩定的水平，α-酮戊二酸含量在第2天降到最低，之后呈現相似的緩慢波動上升趨勢。與0 d的紅樹莓果汁相比，發酵8 d，菌株T2降檸檬酸效果顯著（P＜0.05），檸檬酸質量濃度為9.48 g/L，下降了58.55%，L-蘋果酸含量下降了44.67%，琥珀酸含量下降了9.16%；菌株G4降檸檬酸效果也顯著（P＜0.05），檸檬酸質量濃度為9.25 g/L，下降了59.54%，L-蘋果酸含量下降了43.12%，琥珀酸含量下降了20.29%。

果汁發酵過程中的有機酸隨著發酵菌種生長與代謝而發生改變[20]。它們作為中間產物或最終產物參與代謝的各種基本途徑[21]，如蘋果酸、α-酮戊二酸、琥珀酸和檸檬酸，這些酸屬于三羧酸循環（tricarboxylic acid cycle，TCA）的鏈環酸[22]，它們的定量可以提供細胞中發生的分解代謝和合成代謝過程的基本信息[23]。

發酵過程中，L-蘋果酸含量的緩慢降低可能是菌株在降解檸檬酸的同時降解L-蘋果酸。α-酮戊二酸質量濃度在發酵過程中波動可能主要是由代謝積累引起的[24]。α-酮戊二酸是氨基酸和核苷酸生物合成所必需的前體代謝物，它在TCA過程中基本沒有凈生成，2～8 d含量升高可能是由于一些回補途徑合成得到[25]。檸檬酸通過其他途徑降解，也可提高α-酮戊二酸含量。檸檬酸可以首先在順烏頭酸酶的催化作用下生成異檸檬酸，然后通過NADP-異檸檬酸脫氫酶催化生成α-酮戊二酸[26]。琥珀酸是糖類和大部分氨基酸代謝過程中的重要中間產物[27]。推測琥珀酸含量在第1天增加的原因是檸檬酸經TCA代謝，使得含量略有增加[28]。琥珀酸下降的原因可能是被降酸菌直接消耗代謝或者發生轉化生成其他物質，經其他途徑降解。有的酵母菌能夠同化琥珀酸，通過合成反應利用，也會導致琥珀酸含量降低。

結果表明，菌株T2有機酸總體變化趨勢與菌株G4的變化趨勢相似，菌株T2和G4是2 株可分解檸檬酸且降酸能力較強的優良菌株。

2.4 降酸菌形態特征

菌株T2和G4的形態特征相似，在麥芽汁固體培養基上的形態如圖5A所示，菌落為乳白色，菌落較大，呈圓形，具有一定厚度，中間略有凸起，表面光滑、濕潤，質地均勻較黏稠，容易挑起，邊緣整齊。顯微鏡觀察細胞形態如圖5B所示，細胞呈圓形或橢圓形。繁殖方式為芽殖，在酵母產子囊孢子培養基中25 ℃培養3 d，顯微鏡觀察，子囊內產生1～4 個光滑的球形子囊孢子。在麥芽汁液體培養基中28 ℃培養2 d，培養基表面有醭形成。

圖5 菌株菌落形態（A）和細胞形態（B）（×1 000）Fig. 5 Colonial morphological characteristics (A) and cell morphology (B)of strains T2 and G4 (×1 000)

2.5 生理生化鑒定

表1 生理生化實驗結果Table 1 Physiological and biochemical properties of strains T2 and G4

由表1可知，菌株T2和G4均能利用葡萄糖，不能利用乳糖、半乳糖、蔗糖等其他糖源，除均能同化葡萄糖、甘油和乙醇外，其他碳源均不能被同化，菌株T2和G4可同化硫酸銨，不能同化硝酸鹽。

2.6 分子生物學鑒定

2.6.1 菌株的PCR擴增結果

將純化后的PCR擴增產物進行電泳，在紫外燈照射下觀察，結果如圖6所示。菌株T2和G4的ITS序列PCR產物電泳樣品條帶出現在300～500 bp之間，大小均為400 bp左右。

圖6 菌株T2和G4的PCR產物電泳圖Fig. 6 Agarose gel electrophoretograms of PCR amplified DNA fragments of strains T2 and G4

2.6.2 菌株T2和G4的ITS序列分析與系統發育樹的建立

通過對降酸菌的ITS序列進行同源性分析，確定菌株T2和G4種屬。菌株T2和G4的ITS序列在GenBank核酸序列數據庫中進行同源序列搜索，利用NCBI網站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast）上的BLAST軟件與已知菌株序列進行比對分析，并依此構建系統發育樹。菌株T2和G4的ITS系統發育進化樹如圖7所示。

圖7 菌株T2和G4的ITS系統發育進化樹Fig. 7 Phylogenetic tree based on ITS sequences of strains T2 and G4

從圖7可知，菌株T2和G4與P. terricola和陸生伊薩酵母（I. terricola）的同源性最好，親緣關系最近。多重序列分析已將伊薩酵母屬（Issatchenkia）歸入畢赤酵母屬（Pichia），這2 個屬菌株的親緣關系較近[29-30]，可將P. terricola和I. terricola認定為一種菌，即I. terricola。結合上述菌株的形態學特征和生理生化實驗結果，確定菌株T2和G4均為I. terricola，并分別重新定名為I. terricolaWJL-T2、I. terricolaWJL-G4。

3 結論與討論

利用檸檬酸培養基對紅樹莓果園土壤和紅樹莓鮮果中的酵母菌進行篩選，得到具有良好降解檸檬酸效果的菌株T2和G4，在檸檬酸液體培養基中，菌株T2和G4的總酸降酸率分別為63.73%和67.23%。在紅樹莓果汁中，菌株T2和G4可分別降解55.32%和60.41%的總酸，58.55%和59.54%的檸檬酸。經生理生化實驗及分子學鑒定，結果均為I. terricola，由于降酸速率和效果略有不同，最終將菌株T2和G4分別命名為WJL-T2和WJL-G4，后續可以通過其他測序方法進一步確定2 株菌的關系。王立芳等[31]從葡萄園土壤中分離得到1 株可降解L-蘋果酸和檸檬酸的菌株為I. terricola，測得該菌株對12 g/L的L-蘋果酸和檸檬酸的降解率分別達到93.17%和92.08%。說明I. terricola具有很好的降酸能力。

I. terricola屬于果酒釀造的相關酵母。Bezerra-Bussoli等[32]的研究表明，通常情況下，自然發酵葡萄酒的發酵始于優勢非釀酒酵母，它們來自于葡萄汁和生長環境，并決定了葡萄酒的品質和風味，非釀酒酵母中就包括I. terricola和畢赤酵母屬的酵母。Drumonde-Neves等[33]在葡萄園中鑒定出包括P. terricola在內的23 種酵母菌種。在果酒釀造過程中，釀酒酵母會面臨果實中有機酸尤其是檸檬酸的脅迫，高質量濃度檸檬酸（19.21～76.86 g/L）或pH≤2.80時，釀酒酵母的生長受到抑制[34]，因此，將降酸菌應用于果酒降酸，提高pH值，有助于果酒生產。隋韶奕[35]利用I. terricolaS8進行生物降酸，降酸率為64.87%，并通過熱浸提等工藝釀造了全汁樹莓干型酒，總酸為6.1 g/L?？梢姡琁. terricola應用在高酸果汁及果酒的降酸，能達到理想的效果。

從降酸發酵過程可知，在第8天檸檬酸含量仍有下降趨勢，說明降酸率仍有可能增加；實驗還發現降酸菌在有氧條件下降酸速率更快，關于2 菌株的最適降酸條件，可綜合降酸率和對果汁中活性物質影響等因素，進一步實驗摸索。降酸菌的降酸途徑較復雜，可能不只TCA代謝一條途徑，后續研究還可以測定檸檬酸代謝中的相關酶類活性，更準確深入地研究降酸的途徑和機理。本實驗結果為降低紅樹莓果汁酸度、提高果汁品質、研究生物降酸提供一定參考。