Nisin、?-聚賴氨酸、pH值對蝦源枯草芽孢桿菌生長/非生長界面模型構建與評價

郭全友，劉 玲,，李保國，楊 絮，姜朝軍

（1.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；2.上海理工大學醫療器械與食品學院，上海 200093）

熟制水產品通常是以魚類、甲殼類、貝類、軟體類、棘皮類等動物性水產品為主要原料，經蒸、煮、烘烤、油炸等加熱熟制過程制成的直接食用的水產加工品，在加工過程中自原料、預處理、熟制或滅菌、包裝等工藝難以將芽孢桿菌完全殺滅，即使經過高溫殺菌的食品，可能因殘存芽孢桿菌和孢子萌發而受到污染。枯草芽孢桿菌耐高溫，極端條件下還可被誘導產生抗逆性很強的內源孢子[1]，孢子的萌發為食品安全埋下隱患。枯草芽孢桿菌常存在于烤腸、對蝦或鮑汁等熟制水產品中[1-3]。陳曉等[1]在酸臭的蒜蓉烤腸中檢出枯草芽孢桿菌，發現該菌滋生與原料、設備、加工和二次滅菌等關鍵控制點均密切相關。鄭瑞生[3]發現，枯草芽孢桿菌感染的鮑魚無明顯惡臭和黑變特征，但存在部分流汁和酸敗現象，其分泌的酶類物質可能是其變質的重要因素。鄭麗君等[4]通過測定免泡豆桿中腐敗代謝產物（揮發性鹽基氮）的產量因子為35.38 mg/100 g，確定枯草芽孢桿菌是致腐能力較強的腐敗菌之一。表明枯草芽孢桿菌是熟制水產品中被檢出常見的優勢腐敗菌，因而抑制其生長對保障食品質量安全至關重要。

預測微生物學是食品微生物學領域中一種有效的預測工具，可定量描述環境因子（溫度、pH值、水分活度等）與微生物（如致病菌和腐敗菌）生長的關系，在食品貨架期預測及安全質量管理中具有較強的應用價值[5]。預測微生物模型分為初級模型、二級模型和三級模型，經驗模型和理論模型，動力學模型及概率模型等[6]。20世紀90年代以來，動力學模型是預測微生物學的研究重點，能較好描述微生物生長與環境因子之間的關系，但不能對微生物的非生長狀況進行定量表述[7]。微生物生長/非生長模型可定量描述不同因子作用下微生物生長的可能性（或概率），獲知其生長/非生長動態信息，為食品保藏和風險評價提供一種有效工具[8]。目前微生物的生長/非生長模型有確定性方法[9]、Logistic回歸法[10]、最小凸多面體法[11]、人工神經網絡法[12]、簡化式法[13]等。Logistic回歸模型具有模型擬合度高、表達直觀、應用方便等優點，更適合多種控制因子不同水平生長/非生長模型的建立。研究者多采用改變溫度、pH值、水分活度及NaCl等環境因子控制微生物的生長[8,14-15]，目前，通過生物因子（如乳酸鏈球菌肽（Nisin）、?-聚賴氨酸（?-polylysine，?-PL））與環境因子的交互作用定量調控生長/非生長狀況逐漸引起關注，如Boziaris等[16]研究了NaCl、KCl、pH值及Nisin對單核細胞性李斯特菌生長/非生長邊界的影響，Na等[17]研究?-PL和殼聚糖涂層對冷藏蝦質量及其微生物群生長的影響。相關研究表明[18]Nisin對大多數革蘭氏陽性菌具有較強抑制作用，其機理表現為對菌體凈表面電荷改變、疏水性變化、磷脂組成改變、膜脂肪酸組成的變化、細胞壁增厚或蛋白水解等起重要作用；?-PL是一種對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母菌及霉菌均有抑制作用的天然防腐劑，且對細菌的抑制作用強于霉菌，尤其對枯草芽孢桿菌等抑制作用較明顯[19]，同時有研究[20]發現Nisin具有依賴于pH值的即時性殺菌效果，其殺菌效果隨pH值的降低而增加。

目前針對枯草芽孢桿菌在Nisin、?-PL和pH值交互作用下生長/非生長界面模型與效應評價少見報道，本研究以源自熟制南美白對蝦優勢腐敗菌枯草芽孢桿菌為研究對象，在37 ℃通過pH值、Nisin及ε-PL交互作用對枯草芽孢桿菌生長概率產生影響，用Logistic回歸模型建立該交互作用下生長/非生長模型，對其擬合優度和適用性進行評估及驗證，分析比較3 種抑菌因子對枯草芽孢桿菌的交互作用，以期為優化熟制水產品生產工藝、定量預測枯草芽孢桿菌生長/非生長情況狀況提供一種有效手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

真空包裝熟制對蝦蝦仁采購于寧德市某水產公司，在其貨架期終點時分離純化出優勢菌株，經MIDI脂肪酸鑒定、BIOLOG微生物鑒定和16S rRNA測序（序列號：KU570452.1）鑒定為枯草芽孢桿菌[21-22]，凍干，4 ℃貯藏，待用。

0.01 mol/L HCl標準溶液 深圳市博材達科技有限公司；營養瓊脂、營養肉湯、氯化鈉 上海市國藥集團化學試劑有限公司；Nisin 浙江新銀象生物工程有限公司；?-PL 鄭州博研生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

Bioscreen C微生物生長測定儀 芬蘭Oy Growth Curves Ab有限公司；PHS-3C pH計 上海雷磁儀器廠；SW-CJ-1FB潔凈工作臺 上海博訊實業有限公司醫療設備廠；ZM-100反壓蒸煮消毒鍋 廣州標際包裝設備有限公司；ZHWY-200H恒溫培養振蕩器 上海智城分析儀器制造有限公司；低溫培養箱 日本三洋公司。

1.3 方法

1.3.1 生長介質的制備

設計多因子交互試驗，使用營養肉湯作為培養介質。參考GB 2760—2014《食品添加劑使用標準》及相關文獻[23]，Nisin在熟制水產品中限量≤0.5 g/kg，?-PL在熟肉制品中限量≤0.25 g/kg 。?-PL及Nisin溶液梯度皆設置為0、20、60、100、140、180 μg/mL共6 個水平。枯草芽孢桿菌及孢子在3.0～10.0的pH值范圍內具有耐受性[24-25]，考慮到產品特性，參考GB 4789.26—2013《食品微生物學檢驗 商業無菌檢驗》低酸性食品與酸性食品界定為pH 4.6，取pH 4.0、4.6、5.0、6.0、7.0共5 個水平。參考文獻[10,12]選取144 例數據作為訓練集，36 例數據作為驗證集，試驗設計見表1。

表1 交互試驗訓練集與驗證集設計Table 1 Design of training and validation set for interactiom experiments

1.3.2 菌懸液的制備及接種

菌株活化：取枯草芽孢桿菌接種于無菌營養肉湯中，振蕩30 s，37 ℃培養24 h，在營養瓊脂培養基中劃線得到單菌落。

菌懸液制備：挑取單菌落，接種到10 mL無菌營養肉湯中，37 ℃培養18 h，取1 mL培養液至9 mL無菌生理鹽水中得到10－1菌懸液，逐級稀釋，制成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6梯度菌懸液，各取0.1 mL涂布于營養瓊脂平板，37 ℃培養48 h，選取菌量約105CFU/mL菌懸液作為接種液。

調節過pH值、ε-PL質量濃度的營養肉湯溶液經121 ℃滅菌處理，無菌條件下調節Nisin至所需質量濃度，每孔180 μL接入200微孔板中，取105CFU/mL 的接種液20 μL，確定最終接種液濃度為3.8×104CFU/mL ，接種入孔，每個條件10 組平行，1 個空白，微生物生長測定儀中速振蕩25 ℃培養，7 d內每隔1 h測其OD600nm值。

1.3.3 生長/非生長界面的判別

實驗結束時，微孔中出現明顯混濁或沉淀物且OD值讀數大于3×空白值（0.10左右）則判定枯草芽孢桿菌生長[10,12,26]，當OD值∈（0.10，0.30）或對小孔中菌懸液渾濁度無法判定時，通過涂布營養瓊脂平板證明，出現該菌典型菌落形態，且菌數大于初始菌量0.5（lg（CFU/mL））時[14]，則確定枯草芽孢桿菌生長，否則確定為不生長。當結果確定枯草芽孢桿菌生長，記為“1”，反之則記為“0”。

1.3.4 生長/非生長模型構建與驗證

1.3.4.1 Logistic模型構建

Ratkowsky等[27]提出了簡單Logistic回歸模型，其能夠在一個或多個生長控制因子和添加劑的情況下，擬合菌株生長與非生長之間的邊界，通過預測微生物學概率及動力學方面的整合，從而應用于預測食品微生物學中，選取144 例數據為訓練集用以構建模型。

式（1）中：Logit（P）=ln[P/（1－P）]；P為枯草芽孢桿菌生長概率；ai（i=0～3）為擬合參數；Nisin、ε-PL均表示質量濃度/（μg/mL）。式（2）同。

多項式Logistic回歸模型是一種建立在一個多項式的邏輯回歸模型的算法，可避免對大系數的過度擬合[12]：

式（2）中：bi（i＝0～9）為擬合參數。

1.3.4.2 模型評價與驗證

模型評價：評價指標主要包括R2-Nagelkerke和Hosmer-Lemeshow。Hosmer-Lemeshow測試常用來評估模型的擬合優度及任意數量的連續與分散的解釋變量，其值越小擬合效果越好。R2-Nagelkerke值主要反映了解釋變量與響應變量間的關系，其值越接近1，擬合優度越好[12]。預測正確率（fraction correct，FC）是指預測值與實際值一致樣本占總樣本數量的百分比，可用來評價模型預測精度[28]。

模型驗證：選取表1中36 例驗證集，代入建立的Logistic模型中，采用C-matrix獲得FC，驗證模型的準確度。

式（3）中：FC=（a＋d）/（a＋b＋c＋d）。

1.4 數據分析

模型擬合通過SPSS 18.0（美國IBM公司），并通過Origin 9.0（美國OriginLab公司）繪制生長概率等高線圖（選取概率Pi（i=1～9）為0.1～0.9時的預測值）。

2 結果與分析

2.1 生長/非生長模型構建及驗證

2.1.1 Logistic回歸模型構建及評價

枯草芽孢桿菌2 種生長/非生長模型的擬合參數見表2。采用簡單Logistic回歸模型，pH值、ε-PL與Nisin對枯草芽孢桿菌生長/非生長影響顯著（P＜0.05）；采用多項式Logistic回歸模型，pH值、ε-PL與Nisin對枯草芽孢桿菌生長/非生長影響亦顯著（P＜0.05）。

簡單Logistic回歸模型：

多項式Logistic回歸模型：

表2 Logistic模型擬合參數及擬合優度比較Table 2 Comparison of parameters and goodness of fit between simple and polynomial Logistic models

表3 兩種模型擬合優度評價和驗證Table 3 Goodness of fit evaluation and verification of simple and polynomial Logistic models

表3 為兩種模型擬合優度評價。R2-Nagelkerke是評價模型擬合度的指標；Hosmer-Lemeshow檢驗表明，測試P值越大，χ2值越小，模型擬合優度越高[28]。由表3可知，多項式Logistic模型的R2-Nagelkerke為0.91，高于簡單Logistic模型R2-Nagelkerke為0.79，說明多項式Logistic模型擬合優度高于簡單Logistic模型，枯草芽孢桿菌生長/非生長擬合效果更好。比較Hosmer-Lemeshow結果亦得出，多項式Logistic模型（χ2=0.76，P=1）擬合效果優于簡單Logistic模型（χ2=2.00，P=0.981），多項式Logistic模型擬合效果優于簡單Logistic模型。

2.1.2 生長/非生長模型的驗證

FC一般用以反映模型的預測能力，通常作為模型預測準確度的評價指標，反映預測值和實際值的一致性[14]。由表3可見，簡單Logistic模型訓練集FC為65.2%，驗證集FC為61.8%，訓練集和驗證集的FC較接近，但FC較低，說明該模型預測準確度較低。多項式Logistic模型的訓練集和驗證集的FC分別為87.4%和84.1%，兩者較接近，對于同一性質的數據預測準確度較高。從驗證集看，FC值越高，代表模型對驗證集的預測準確度較高。

2.2 環境因子對枯草芽孢桿菌生長/非生長的作用

2.2.1 Nisin對枯草芽孢桿菌生長/非生長的作用

圖1 不同Nisin質量濃度下枯草芽孢桿菌生長/非生長界面圖Fig. 1 Growth/no growth boundaries at different concentrations of nisin for B. subtilis

圖1 為Nisin對枯草芽孢桿菌生長概率的影響，根據模型擬合出生長概率P為0.1～0.9的分界線，P=1表明該條件下適宜生長；P=0說明該區域條件下Nisin、?-PL和pH值的交互作用對枯草芽孢桿菌有較好的抑制作用，該條件下不適宜生長。隨著Nisin質量濃度增加，枯草芽孢桿菌非生長區變大，其生長受到抑制，Nisin質量濃度對枯草芽孢桿菌的生長/非生長情況影響顯著（P＜0.05）。

圖1 a～c中，根據非生長區大小可知，Nisin質量濃度≤60 μg/mL時，Nisin對枯草芽孢桿菌生長/非生長界面的影響較小，?-PL質量濃度越高則生長區越小，pH值越接近7.0則生長區越大；圖1d～f中，Nisin質量濃度大于60 μg/mL時，Nisin是影響枯草芽孢桿菌生長/非生長界面的主要因素。隨Nisin質量濃度的增加，生長概率等高線圖逐漸變緩，說明pH值與?-PL質量濃度的交互作用中pH值的影響減弱，?-PL質量濃度的影響增強。無論?-PL質量濃度為何值，Nisin質量濃度為60、100、140、180 μg/mL時，枯草芽孢桿菌在pH值分別為4.0、4.25、4.5、5.0時表現為不生長。隨pH值增大至7.0，圖1c中Nisin質量濃度為60 μg/mL時，生長概率在?-PL質量濃度為90 μg/mL時達到0.98；圖1d中Nisin質量濃度為100 μg/mL時，生長概率在?-PL質量濃度為60 μg/mL時達到0.94；圖1e中當Nisin質量濃度為140 μg/mL時，?-PL質量濃度為20 μg/mL，生長概率為0.92；圖1f中當Nisin質量濃度達到180 μg/mL時，生長概率在?-PL質量濃度為20 μg/mL時僅為0.40。隨Nisin質量濃度增加，生長/非生長界限向更高?-PL質量濃度、更低pH值方向移動。Nisin在本次實驗中表現出對枯草芽孢桿菌生長/非生長界面的影響，其背后機理可能為Nisin中ATP結合盒轉運蛋白對枯草芽孢桿菌等細菌起到抗菌作用[29]。枯草芽孢桿菌的生長區隨Nisin質量濃度的增加而變小，這與Boziaris等[16]研究NaCl、KC、pH值及Nisin對單核細胞性李斯特菌生長/非生長邊界的影響結果較為相似，其結果顯示增加Nisin質量濃度顯著影響生長/非生長界面，導致單核細胞性李斯特菌Scott A非生長區增大，Nisin的存在導致單核細胞性李斯特菌Scott A更受抑制；因此，結合生長/非生長界面模型對調控Nisin與pH值間的交互作用，以及靶向控制熟制水產品中的腐敗菌具有重要意義。

2.2.2?-PL對枯草芽孢桿菌生長/非生長的作用

由圖2可知，與Nisin對枯草芽孢桿菌生長/非生長界面的作用類似，?-PL對其生長/非生長情況影響顯著，即隨著?-PL質量濃度增加，枯草芽孢桿菌非生長區變大，其生長受到抑制越強。由圖2可知，隨?-PL質量濃度的增加，生長概率等高線圖也逐漸變緩，說明pH值與Nisin質量濃度交互作用中Nisin占主導作用，且Nisin與?-PL的交互作用增強。無論Nisin質量濃度為何值，?-PL質量濃度為60、100、140、180 μg/mL時，枯草芽孢桿菌在pH值分別為4.0、4.5、4.75、5.25時生長概率為0。隨pH值增大至7.0，圖2c中當?-PL質量濃度為60 μg/mL時，生長概率在Nisin質量濃度為90 μg/mL時達到0.97；圖2d中當?-PL質量濃度為100 μg/mL時，生長概率在Nisin質量濃度為50 μg/mL時達到0.98；圖2e中當?-PL質量濃度為140 μg/mL時，Nisin質量濃度為20 μg/mL時，生長概率為0.97；圖2f中當?-PL質量濃度達到180 μg/mL時，生長概率在Nisin質量濃度為20 μg/mL時僅為0.73。若?-PL質量濃度不斷增加，生長/非生長界限向更高Nisin質量濃度、更低pH值方向移動。綜上，?-PL對枯草芽孢桿菌表現出較好的抑制作用，與蔡瑞等[30]研究得出?-PL對芽孢桿菌屬具有顯著抑制效果結論相似，當添加量為最小抑菌質量濃度（1.25～5 mg/L）時，對芽孢桿菌屬菌數減少量為1～2 個數量級，與Sun Haitao等[31]通過澆鑄法將Nisin（質量分數0.25%～0.5%）和?-PL（質量分數0.2%）摻入玉米磷酸二淀粉/納米纖維素薄膜中制備抑菌生物納米復合薄膜，結果表明結合Nisin和?-PL的納米纖維素薄膜生物納米復合膜對革蘭氏陽性菌（金黃色葡萄球菌）和革蘭氏陰性菌（大腸桿菌）具有協同抑菌活性也較為一致。?-PL作用機理主要呈現為導致細菌質壁分離，菌體塌陷及細胞質溢出等現象[19]，而?-PL與Nisin、pH值交互作用下對枯草芽孢桿菌的內在抑菌機制仍需進一步研究。

圖2 不同?-PL質量濃度下枯草芽孢桿菌生長/非生長界面圖Fig. 2 Growth/no growth boundaries at different concentrations of ?-polylysine for B. subtilis

2.2.3 pH值對枯草芽孢桿菌生長/非生長的作用

由圖3可知，pH值由7.0逐漸調至4.0，枯草芽孢桿菌非生長區逐步擴大，pH值抑制作用增強。當pH值低于5.0，枯草芽孢桿菌的生長受到強烈抑制（非生長區/生長區＞1）。圖3a中，當pH值為4.0時，pH值是影響枯草芽孢桿菌生長的主要因素；圖3b～d中，當pH≥5.0時，Nisin與?-PL的交互作用影響加強。同時，隨pH值的升高，生長概率等高線逐漸變陡，可能是Nisin與?-PL的交互作用中，?-PL的影響減小，Nisin的影響增強導致的。pH值對枯草芽孢桿菌生長/非生長情況影響顯著（P＞0.05）。pH值越低，Nisin與?-PL的交互作用被減弱，枯草芽孢桿菌越不適宜生長，生長/非生長界限開始變化點向低濃度生物因子（Nisin與?-PL）范圍移動。

圖3 不同p值下枯草芽孢桿菌生長/非生長界面圖Fig. 3 Growth/no growth boundaries at different pH for B. subtilis

pH值下降會改變細胞膜通透性[26]，造成微生物新陳代謝有關酶失活[32]，進而導致微生物死亡。有學者指出pH值對枯草芽孢桿菌的生長和失活等影響顯著，如Balasubramanian等[33]研究了熱-壓力-pH值（4.0～7.0）的交互效應下檸檬酸鹽-磷酸鹽緩沖液中枯草芽孢桿菌ATCC 6633孢子的失活過程，結果顯示當孢子分別懸浮在pH 5.0和pH 3.0的緩沖溶液中，孢子數量能減少約為6 個和7 個對數值。于枯草芽孢桿菌而言，pH值低于5.0時，Nisin與?-PL的交互作用逐漸受到影響，此時pH值為影響生長/非生長邊界的主導因素。Vermeulen等[34]研究了pH值、水分活度及乙酸對單核細胞性李斯特菌的生長/非生長情況，pH值越小，非生長區范圍變大，生長概率降低，生長/非生長界面往更低乙酸質量分數（0%～0.4%）、更高水分活度（0.960～0.990）方向偏移，這也與本研究結果一致。考慮到產品安全性及感官品質的可接受性，例如為避免水產品或酸性食品中肉毒桿菌中毒的危害，pH 4.6通常被普遍接受為達到安全劑量的最小值[35]；有研究者[15]在調味軟烤扇貝中發現，pH值在5.7～5.9時，有一定去腥效果且酸感不明顯，而當pH值低于5.5時，酸感較顯著。因此，結合生長/非生長界面模型，調節適當pH值并結合產品感官品質特征在熟制水產品的加工及應用中也具有一定參考價值。

3 結 論

研究源自熟制南美白對蝦的優勢腐敗菌（枯草芽孢桿菌）37 ℃條件下，pH值、Nisin及?-PL的交互作用對其生長概率的影響，通過簡單Logistic和多項式Logistic方程擬合生長/非生長模型，并對模型進行了評價和驗證，比較3 種抑菌因子對枯草芽孢桿菌的生長抑制效用，主要結論如下：1）建立了枯草芽孢桿菌簡單Logistic和多項式Logistic生長/非生長模型，可預測pH值、Nisin及?-PL作用下的枯草芽孢桿菌生長概率。簡單Logistic模型與多項式Logistic模型訓練集FC、R2-Nagelkerke及Hosmer-Lemeshow測試結果得出，多項式Logistic模型擬合效果優于簡單Logistic模型，表明多項式Logistic生長/非生長模型能更好預測pH值、Nisin及?-PL作用下枯草芽孢桿菌的生長概率。2）隨Nisin質量濃度、?-PL質量濃度增加或pH值的降低，生長區域逐漸減小，非生長區域逐漸擴大，枯草芽孢桿菌的生長受到抑制。當Nisin質量濃度增加，枯草芽孢桿菌的生長/非生長界限往更高?-PL質量濃度、更低pH值方向移動。無論第3種因子質量濃度為何值，當Nisin質量濃度為60、100、140、180 μg/mL時，枯草芽孢桿菌在pH值分別為4.0、4.25、4.5、5.0時表現為不生長。?-PL質量濃度為60、100、140、180 μg/mL時，枯草芽孢桿菌在pH值分別為4.0、4.5、4.75、5.25時生長概率為0。當pH＜5.0時，枯草芽孢桿菌的生長受到較強抑制，此時pH值是影響枯草芽孢桿菌生長/非生長界限的主要因素。

綜上，通過構建水產品中腐敗菌/致病菌的生長/非生長模型，在預測和控制微生物安全和產品品質等方面具有重要參考價值，為實際生產中有效預測風險概率提供指導。由于水產品原料、加工、流通、銷售過程中影響因素的復雜性及不確定性，仍需根據產品特性和關鍵控制點導入更多調控因子，并對其協同/拮抗效應作進一步研究。