駝乳蛋白α-淀粉酶抑制活性肽的制備與鑒定

蘇 娜，伊 麗,2，吉日木圖,2,

（1.內蒙古農業大學 乳品生物技術與工程教育部重點實驗室，內蒙古 呼和浩特 010018；2.內蒙古駱駝研究院，內蒙古 阿拉善 750306）

隨著生活水平的提高，越來越多的人患上糖尿病，致使其成為僅次于心腦血管疾病、惡性腫瘤后排名第三的慢性非傳染疾病[1]。目前，在預防糖尿病方面采用了各種策略，如改變飲食、避免加工食品，增加蔬菜和水果的攝入量、定期進行鍛煉以及使用不同的降血糖藥物[2]。然而由于胰島素和常規口服降血糖藥物的副作用和有限的長期持久性，需要探索自然和安全的方法防止糖尿病的進一步發展。近年來，食源性降血糖肽不斷被開發出來，例如植物源降血糖肽（核桃、燕麥和山杏仁等）[3-5]；動物源性降血糖肽（山羊乳、蠶蛹和帶魚等）[6-8]。它們較化合藥物具有很多優勢，已成為當下的研究熱點。文獻表明，一些降血糖肽能有效刺激胰島素的分泌，改善糖尿病動物模型和受試者的血糖水平[9]。其中α-淀粉酶抑制活性肽可有效控制餐后血糖，降低血糖水平，備受學術界關注。

駝乳營養成分獨特，容易消化吸收，過敏原性低，含有豐富的蛋白質、不飽和脂肪酸、維生素和必需的礦物質元素，營養價值遠高于其他動物乳。它的基本化學成分與牛乳相似，但干物質、蛋白質、灰分和脂肪等含量都高于牛乳[10]。駝乳獨特的健康益處可能與自身的蛋白質組成有關[11]，駝乳含有其他動物乳所罕有的純天然生物活性蛋白，如乳鐵蛋白、溶菌酶、免疫球蛋白、重鏈抗體、胰島素和類胰島素生長因子等，可應用于抑制血糖升高的研究中[12]。研究表明，駝乳在體外和體內試驗都顯示出良好的降血糖活性[13-16]，引起消費者的極大興趣。以駝乳蛋白為原料制備α-淀粉酶抑制活性肽，顯得十分有價值。

本實驗預采用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶對駝乳蛋白進行水解，優化其工藝條件。測定最優酶解條件下駝乳多肽的α-淀粉酶抑制活性，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）驗證駝乳多肽的酶解效果和基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix assisted laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）測定駝乳多肽的分子質量分布。并利用氨基酸自動分析儀和液相色譜-質譜（liquid chromatograph-mass spectrometry，LC-MS）聯用儀對駝乳多肽進行鑒定，比較不同蛋白酶作用下駝乳多肽的氨基酸組成和肽段序列，分離出有效的生物活性肽，為今后駝乳蛋白α-淀粉酶抑制活性肽的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

駝乳由內蒙古阿拉善盟阿拉善右旗養駝戶提供。

BCA蛋白濃度測定試劑盒（增強型） 上海碧云天生物技術有限公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g）、木瓜蛋白酶（6 000 000 U/g）、1,4-二巰基蘇糖醇（1,4-dithiothreitol，DTT，純度為99%）、絲氨酸、α-淀粉酶（40 000 U/g）、可溶性淀粉、DNS試劑、考馬斯亮藍蛋白膠快速染色液 北京索萊寶科技有限公司；SDS、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、α-氰基-4-羥基肉桂酸（α-cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA） 美國Sigma公司；鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA，純度為97%） 天津市光復精細化工研究所；標準蛋白Marker（10～180 kDa） 美國Thermo Fisher Scientitic公司；SDS-PAGE預制膠 江蘇金斯瑞有限公司；SDSPAGE上樣緩沖液（5×） 北京博奧森生物技術有限公司；乙腈、三氟乙酸（均為色譜純） 德國Merck公司；Mass Standards Kit for thr 4700 Proteomics Analyzer美國AB Sciex公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

FE28 pH計 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；DK-8AXX電熱恒溫水槽、GHP-9270隔水式恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；5810R離心機德國Eppendorf公司；MD25（3 500 Da）透析袋 北京索萊寶科技有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機寧波新芝生物科技股份有限公司；SYNERGY H1酶標儀、165-8001垂直電泳槽、164-5050電泳儀、GelDoc XR＋凝膠成像系統 美國Bio-Tek有限公司；TS-1000水平脫色搖床 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；L-8900型全自動氨基酸分析儀 日本日立公司；4800 Plus MALDI TOF/TOF質譜儀 美國AB Sciex公司；Q-Exactive質譜儀 美國Thermo Fisher Scientitic公司。

1.3 方法

1.3.1 駝乳蛋白的制備

新鮮的駝乳經離心（8 000 r/min、20 min、4 ℃），棄去上層脂肪，即得脫脂駝乳。脫脂后的駝乳置于透析袋中，透析外液為磷酸鹽緩沖液，透析24 h除雜。取出后置于－80 ℃預凍24 h，放入真空冷凍干燥機中，在－50 ℃、1 Pa條件下干燥成粉備用。駝乳蛋白含量采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行測定，駝乳蛋白質量分數約為64.61%。

1.3.2 酶解制備駝乳多肽

駝乳蛋白以0.1 g/mL的底物質量濃度復原后，選用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶分別對駝乳蛋白進行水解。水解完成后90 ℃、20 min滅酶，冷卻，離心沉淀（4 000 r/min、10 min、4 ℃）提取上清液，即為駝乳多肽。

1.3.3 單因素試驗

分別對堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶的酶用量、酶解溫度、酶解pH值和酶解時間進行單因素試驗，測定各酶解液的蛋白質水解度，確定單因素試驗的酶解條件。

控制酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.0、酶解時間3 h，設定酶用量分別為（E/S）質量分數1%、3%、5%、7%、9%，考察酶用量對駝乳蛋白水解度的影響。控制酶用量5%、酶解pH 7.0、酶解時間3 h，設定酶解溫度分別為45、50、55、60、65 ℃，考察酶解溫度對駝乳蛋白水解度的影響。控制酶用量5%、酶解溫度55 ℃、酶解時間3 h，設定酶解pH值分別為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，考察酶解pH值對駝乳蛋白水解度的影響。控制酶用量5%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.0，設定酶解時間分別為1、2、3、4、5 h，考察酶解時間對駝乳蛋白水解度的影響。

1.3.4 正交試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，以蛋白質水解度作為評價指標，設計酶用量、酶解溫度、酶解pH值和酶解時間的4因素3水平L9（34）正交試驗，以期獲得堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白的最佳工藝條件，正交試驗的因素與水平設計見表1、2。

表1 堿性蛋白酶水解駝乳蛋白正交試驗設計L9（34）因素與水平Table 1 Factors and levels used in L9(34) orthogonal array design for optimization of camel milk protein hydrolysis by alcalase

表2 木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白正交試驗設計L9（34）因素與水平Table 2 Factors and levels used in L9(34) orthogonal array design for optimization of camel milk protein hydrolysis by papain

1.3.5 蛋白質水解度的測定

采用OPA法測定蛋白質水解度[17]。在避光條件下，向裝有3 mL OPA試劑（200 mg SDS、7.62 g四硼酸鈉、160 mg OPA、4 mL乙醇和176 mg DTT用去離子水溶解，定容至200 mL，避光保存）的試管中分別加入400 μL絲氨酸溶液（標準溶液）、去離子水（空白溶液）和駝乳多肽溶液（樣品溶液），混勻5 s后，室溫反應2 min，于波長340 nm處測定吸光度。按式（1）計算蛋白質水解度：

式中：h為被水解的肽鍵數/（meqv/g）；htot為蛋白質總肽鍵數（8.2 meqv/g）。

1.3.6α-淀粉酶抑制活性的測定

吸取不同濃度的駝乳多肽與駝乳蛋白溶液100 μL及1 U/mL的α-淀粉酶（用pH 6.8，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液配制）100 μL于試管中，混勻后于37 ℃恒溫反應5 min，再加入250 μL 1%淀粉溶液（用pH 6.8，0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液配制），混勻后于37 ℃恒溫反應5 min，加入200 μL的DNS試劑，反應液于沸水浴中加熱15 min后取出，并于冰水浴中迅速冷卻，再加入2 mL蒸餾水，于波長540 nm處測定吸光度[18]。按式（2）計算α-淀粉酶抑制率：

式中：A樣品為樣品反應液吸光度；A空白為以磷酸鹽緩沖液代替酶的吸光度；A對照為以磷酸鹽緩沖液代替樣品的吸光度。

1.3.7 SDS-PAGE

配制SDS-PAGE 15%分離膠、5%濃縮膠和質量濃度為30 mg/mL的駝乳多肽和駝乳蛋白，并與蛋白上樣緩沖液4∶1混合，備用。待濃縮膠凝固后，取下膠板，裝入電泳槽，倒入電泳緩沖液，取下樣品梳，開始加樣。堿性蛋白酶水解駝乳蛋白制備的多肽（以下簡稱JX）、木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白制備的多肽（以下簡稱MG）、駝乳蛋白和標準蛋白分子Marker（10～180 kDa）的上樣量為5 μL，濃縮膠和分離膠的電壓分別為90 V和120 V。電泳結束后，用考馬斯亮藍染色液對膠片進行染色，再用脫色液脫色至背景透明，條帶清晰可見，并置于凝膠成像儀上拍照分析。

1.3.8 氨基酸組成的測定

根據GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》的測定方法[19]，采用L-8900型全自動氨基酸分析儀對駝乳多肽的游離氨基酸組成進行測定。

1.3.9 分子質量的測定

將駝乳多肽樣品與CHCA基質溶液按體積比1∶1混勻，取1 μL點至樣品靶上，再以相同的方法將校準標準品點在樣品的相鄰靶位上，待自然干燥成結晶后，置于4800 Plus MALDI TOF/TOF質譜儀離子源中進行測定，圖譜掃描范圍為m/z0～10 000，累計10 次單次掃描信號為最終質譜圖[20]。

1.3.10 多肽的鑒定

1.3.10.1 樣品處理

駝乳多肽通過10 kDa離心過濾器過濾，SPE C18柱除鹽，真空蒸發后，用40 μL 0.1 mol/L的三氟乙酸溶液重溶，通過LC-MS鑒定。

1.3.10.2 色譜分離

流動相A液為0.1%甲酸溶液，B液為0.1%甲酸-乙腈溶液（乙腈體積分數84%）。色譜柱為RP-C18（0.15 mm×150 mm，5 μm），進樣量20 μL，流速0.25 mL/min，進樣時間60 min。流動相洗脫程序：流動相梯度：0～50 min，96%～50% A，4%～50% B；50～54 min，50%～20% A， 50%～80% B；54～60 min，0% A，100% B。

1.3.10.3 質譜鑒定

檢測方式：正離子模式，質量掃描范圍m/z300～1 800，離子源溫度280 ℃，噴霧電壓3 800 V，信號強度閾值2×104，碰撞能量27 eV。肽段序列用軟件MaxQuant 1.5.5.1檢索相應的數據庫，最后得到駝乳多肽鑒定和定量的分析結果。

1.3.11 多肽的合成

采用固相合成法對篩選的肽段進行合成，并通過LC-MS分析儀對合成肽的純度和分子質量進行鑒定，以上步驟由浙江昂拓萊司生物技術有限公司輔助完成。

1.4 數據處理

所得數據均用SPSS 20.0和Microsoft Excel 2016進行統計分析。各組實驗均重復3 次，采用ANOVA進行Duncan差異分析，P＜0.05，差異顯著。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酶用量對駝乳蛋白水解度的影響

圖1 酶用量對駝乳蛋白水解度的影響Fig. 1 Effect of enzyme dosage on hydrolysis degree of camel milk protein

從圖1可以看出，隨著酶用量的增加，水解度整體呈現上升的趨勢。堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶在酶用量達到5%時，水解度分別為67.17%和52.96%。繼續增加酶用量，酶解反應達飽和，蛋白質水解度變化無顯著性差異（P＞0.05）。為節約成本，故確定堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白的最佳酶用量為5%。

2.1.2 酶解溫度對駝乳蛋白水解度的影響

由圖2可知，隨著酶解溫度的升高，酶與底物接觸機會增多，水解程度增大。當酶解溫度到達60 ℃，蛋白質水解度達最高，分別為63.27%（堿性蛋白酶）和57.28%（木瓜蛋白酶）。隨后酶解溫度繼續升高，導致蛋白酶失活，酶解效果變差，蛋白質水解度也開始下降。故確定堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白的最佳酶解溫度為60 ℃。

圖2 酶解溫度對駝乳蛋白水解度的影響Fig. 2 Effect of hydrolysis temperature on hydrolysis degree of camel milk protein

2.1.3 酶解pH值對駝乳蛋白水解度的影響

圖3 酶解p值對駝乳蛋白水解度的影響Fig. 3 Effect of pH on hydrolysis degree of camel milk protein

如圖3所示，隨著酶解pH值的增大，堿性蛋白酶水解駝乳蛋白水解度也逐漸增大。在酶解pH值為7.5時，蛋白質水解度相對較高，達62.94%，隨后蛋白質水解度又下降，因此確定堿性蛋白酶水解駝乳蛋白最佳酶解pH值為7.5。木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白隨著酶解pH值的增大，水解度呈先升高后降低的趨勢。酶解pH值為6.5時，蛋白質水解度為60.61%，達到最大。這可能是由于過堿會影響蛋白酶的穩定性，改變酶的空間結構，最終導致酶失活。因此確定木瓜蛋白酶的最佳酶解pH值為6.5。

2.1.4 酶解時間對駝乳蛋白水解度的影響

圖4 酶解時間對駝乳蛋白水解度的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis time on hydrolysis degree of camel milk protein

如圖4可知，在堿性蛋白酶作用下，在1～3 h內駝乳蛋白的水解度呈上升趨勢，水解度由46.09%增加到61.27%。隨著水解的進行，底物逐漸被消耗，3 h后的水解度開始下降。但在2～3 h內，水解度已基本趨于平緩，無顯著差異（P＞0.05）。故確定堿性蛋白酶水解駝乳蛋白的最佳酶解時間為2 h。木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白隨著酶解時間的延長，水解度有所提高，酶解時間在2 h時，蛋白質水解度達最高，為50.04%。因此確定2 h為木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白的最佳酶解時間。

2.2 正交試驗結果

表3 堿性蛋白酶水解駝乳蛋白正交試驗L9（34）結果Table 3 Results of L9(34) orthogonal array design for optimization of camel milk protein hydrolysis by alcalase

表4 木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白正交試驗L9（34）結果Table 4 Results of L9(34) orthogonal array design for optimization of camel milk protein hydrolysis by papain

如表3、4所示，堿性蛋白酶水解駝乳蛋白的實際最優組合為A2B1C2D3，即酶用量5%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.5、酶解時間2.5 h，水解度達64.43%；木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白的實際最優組合為A3B1C3D2，即酶用量6%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.0、酶解時間2 h，水解度達62.95%。

堿性蛋白酶水解駝乳蛋白的理論最優水平組合為A2B2C3D3，即酶用量5%、酶解溫度60 ℃、酶解pH 8.0、酶解時間2.5 h；木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白的理論最優組合為A1B1C3D2，即酶用量4%、酶解溫度55 ℃、酶解pH 7.0、酶解時間2 h。堿性蛋白酶水解駝乳蛋白的極差結果得出RA＞RB＞RD＞RC，即影響水解度因素的主次關系為酶用量＞酶解溫度＞酶解時間＞酶解pH值；木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白極差結果得出RA＞RC＞RB＞RD，即影響水解度因素的主次關系為酶用量＞酶解pH值＞酶解溫度＞酶解時間。

經實驗驗證，理論最優水平組合所得酶解產物測得的蛋白質水解度高于實際最優水平組合，所以堿性蛋白酶水解駝乳蛋白的最佳工藝組合為A2B2C3D3，木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白的最佳工藝組合為A1B1C3D2。

2.3 α-淀粉酶的抑制作用

圖5 JX、MG和駝乳蛋白質量濃度對α-淀粉酶抑制率的影響Fig. 5 α-Amylase inhibitory effects of different concentrations of JX,MG and camel milk protein

碳水化合物的分解是引起餐后血糖升高的主要原因，控制餐后血糖可有效預防糖尿病。α-淀粉酶是碳水化合物分解的關鍵酶，可隨機水解淀粉等碳水化合物內部的α-1,4-糖苷鍵，將淀粉類物質分解。因此可以通過抑制其酶促反應減少葡萄糖的生成，從而防止血糖濃度的升高[21-22]。如圖5所示，隨著樣品質量濃度的升高，α-淀粉酶的抑制率先升高后趨于平緩。這是由于樣品質量濃度的增加，與α-淀粉酶結合的有效肽段增多，因而抑制作用越來越強。隨后樣品質量濃度繼續增加，有效肽段與α-淀粉酶的結合達到了飽和，再增加樣品質量濃度對于抑制效果并不明顯[23]。JX、MG和駝乳蛋白對α-淀粉酶的IC50分別為0.027、0.026 mg/mL和0.089 mg/mL。駝乳多肽的IC50值低于駝乳蛋白，表明駝乳蛋白被酶解后，生成了有效的生物活性肽，從而使抑制α-淀粉酶的作用增加，這與Mudgil等[24]研究的結果相同。相比于JX，MG的IC50值更低，對α-淀粉酶的抑制作用更強，表明MG產生了更為有效的α-淀粉酶抑制活性肽。由于蛋白酶種類和水解條件的差異，可能導致蛋白質更大程度水解成一些無效的短肽和游離氨基酸，從而使JX的α-淀粉酶抑制活性偏低[25]。Jan等[6]研究發現綿羊乳酪蛋白水解3 h時，α-淀粉酶抑制活性升高，而水解5 h后α-淀粉酶抑制活性降低。后續Ngoh等[26]也發現用復合蛋白酶水解黑白斑豆1 h可改善α-淀粉酶抑制活性，而水解1.5 h后α-淀粉酶抑制活性降低。因此，木瓜蛋白酶更適合制備α-淀粉酶抑制活性肽。

2.4 SDS-PAGE結果

圖6 JX、MG和駝乳蛋白的SDS-PAG結果Fig. 6 SDS-PAGE profiles of JX, MG and camel milk protein

如圖6所示，大多數駝乳蛋白在水解后都被降解成SDS-PAGE無法檢測到的小分子肽段。JX和MG都有不明顯的κ-酪蛋白條帶，說明這2 種蛋白酶對κ-酪蛋白的降解能力有限，且κ-酪蛋白含量較高。對于α-乳白蛋白，木瓜蛋白酶有一定程度的水解作用，而堿性蛋白酶都對α-乳白蛋白有一定的抗性。相對來說，由于蛋白質的結構不同，酪蛋白和α-乳白蛋白都比較難水解。酪蛋白的水解是隨機且靈活的，而α-乳白蛋白的肽段分裂位置藏在較深的桶狀結構中，導致蛋白酶對它們表現出較差的降解能力[24]。酶解后的產物在10 kDa以下的條帶顏色較深且連續，說明駝乳蛋白已經水解成多肽，酶解很徹底。總的來說，酪蛋白和α-乳白蛋白較其他蛋白難降解，木瓜蛋白酶較堿性蛋白酶更容易水解蛋白質，這與Salami等[27]的研究一致。

2.5 駝乳多肽的氨基酸組成

如表5所示，在駝乳蛋白中，谷氨酸、亮氨酸和脯氨酸的含量普遍較高，與伊日貴等[28]的研究結果一致。從整體上看，酶解前后游離氨基酸的含量變化不大，可能是因為酶解只能將蛋白質水解成長短不一的肽段，而不能極大地改變酶解產物中游離氨基酸的含量。由于蛋白酶種類的不同，對蛋白質的作用位點不同，因而可以產生不同的酶解產物，導致JX和MG的氨基酸組成有所區別。MG中除絲氨酸和纈氨酸外，其余15 種氨基酸、總氨基酸含量都高于JX，說明MG水解更完全。有研究發現，淀粉酶有許多芳香族氨基酸殘基，這些殘基會與多肽中的芳香族氨基酸殘基（苯丙氨酸、酪氨酸）結合，形成氫鍵、靜電和范德瓦爾斯作用，使得多肽和酶之間產生芳香族氨基酸和芳香族氨基酸的相互作用，這與α-淀粉酶的抑制活性密切相關[29]。MG的芳香族氨基酸含量稍高于JX，說明MG的α-淀粉酶抑制活性偏高與其芳香族氨基酸有一定關系。

表5 JX、MG和駝乳蛋白的氨基酸組成Table 5 Amino acid composition of JX, MG and camel milk protein

2.6 駝乳多肽的分子質量分布

MALDI-TOF-MS是一種新型軟電離質譜技術，可直接應用于混合物的分析，測定其絕對的分子質量，具有準確、快速、靈敏度高和檢測范圍廣等優點，廣泛應用于眾多領域[30]。本實驗在正離子檢測模式下，利用反射方式（0～5 000 Da）和線性方式（5 000～10 000 Da）對2 種駝乳多肽進行分子質量的測定。如圖7、8所示，JX和MG都表現出很好的水解效果，其中MG的洗脫峰更多，水解程度高于JX。JX和MG分子質量分布如圖9所示，MG的分子質量主要集中在400～2 000 Da，JX的分子質量主要集中在400～3 000 Da。MG分子質量在400～1 000 Da范圍內肽段最多，所占比例高達68.29%，明顯高于其他分子質量范圍，說明木瓜蛋白酶相比于復合蛋白酶水解駝乳蛋白可以得到更多的小分子肽。

圖7 反射方式（A）和線性方式（B）下JX的分子質量質譜圖Fig. 7 Mass spectra showing molecular mass of JX in reflection mode (A) and linear mode (B)

圖8 反射方式（A）和線性方式（B）下MG的分子質量質譜圖Fig. 8 Mass spectra showing molecular mass of MG in reflection mode (A) and linear mode (B)

圖9 JX和MG的分子質量分布（0～10 kDa）Fig. 9 Molecular mass distribution of JX and MG (0–10 kDa)

2.7 駝乳多肽鑒定結果

表6 JX和MG中被鑒定的多肽及蛋白信息Table 6 Information about the identified peptides and proteins in JX and MG

JX和MG鑒定出的肽段在UniProt Camelidae數據庫中進行比對。表6表明，JX鑒定出110 種肽段，共計147 條肽段，對應16 種蛋白，主要來源于酪蛋白，可達50.91%，分子質量主要集中在900～2 800 Da。MG鑒定出69 種肽段，共計81 條肽段，對應13 種蛋白，主要來源于酪蛋白，可達68.12%，分子質量主要集中在900～2 600 Da。經過不同的蛋白酶處理，獲得不同序列和大小的肽段以及分解蛋白質的來源也不同。由圖10可以看出，JX和MG有19 種相同肽段，JX和MG的差異性肽段分別有91 和50 種。基于Peptide Ranker評分大于0.80的標準，篩選潛在的生物活性肽[31]，見表7。JX篩選出1 條肽段HAGPTWNPISIGISFM，MG篩選出2 條肽段IPLPLPLPLP和LPLPLPLR。由于堿性蛋白酶主要作用于C-末端的芳香族或疏水性氨基酸[32]，酶切范圍較廣，易被水解，獲得的肽段序列比較復雜，而木瓜蛋白酶則主要作用于蛋白質N-末端的疏水性氨基酸殘基[33]，水解后疏水性基團暴露，導致肽序中含有較多的亮氨酸（L）和脯氨酸（P），MG有較高的α-淀粉酶抑制活性可能與此有關。篩選出的3 條肽段在數據庫（BIOPEP、PeptideDB、SwePep和EROPMoscow）中搜索無記錄，表明發現了新的生物活性肽，這為駝乳蛋白在防治糖尿病方面提供了新的依據。

圖10 JX和MG差異性肽段Venn圖Fig. 10 Venn diagram of differential peptides between JX and MG

表7 JX和MG中Peptide Ranker評分大于0.80的肽段Table 7 Selected peptides derived from JX and MG from Peptide Ranker score 0.80

2.8 合成肽的分析和驗證

采用固相合成法合成了3 條新發現的肽段，并驗證了潛在α-淀粉酶抑制活性相似序列合成肽的效價。如圖11A1、B1、C1所示，出峰時間穩定、峰形對稱、基線平穩，純度都大于95%。如圖11A2、B2、C2所示，各肽的分子質量測定值與其理論值相近，合成結果可靠，具體數據見表8。HAGPTWNPISIGISFM、IPLPLPLPLP和LPLPLPLR三條肽的α-淀粉酶的IC50分別為0.067、0.039 mg/mL和0.041 mg/mL，都低于與之對應的酶解產物，造成這樣結果的原因可能是合成肽僅為單一肽，而酶解產物中是多種混合肽的共同作用；合成肽的氨基酸序列和分子質量雖然與天然肽相近，但空間結構有所不同；此外合成過程中一些毒性物質的影響，也會對活性造成一定的破壞。HAGPTWNPISIGISFM的活性相對較低，IPLPLPLPLP和LPLPLPLR的活性相差不大，說明α-淀粉酶抑制活性與疏水性氨基酸有關，主要是亮氨酸和脯氨酸，驗證了氨基酸序列與活性的相關性。

圖113 條多肽的LC-MS圖Fig. 11 Liquid chromatograms and mass spectra of 3 peptides

表8 合成肽的色譜、質譜信息及α-淀粉酶的IC50Table 8 Chromatographic and mass spectrographic information of synthetic peptides and their IC50 against α-amylase

3 結 論

駝乳因其潛在的健康效益而受到科學界的關注。在本研究中，發現駝乳蛋白是生物活性肽的潛在來源，具有抑制與糖尿病相關的關鍵代謝酶的潛力。還觀察到用于產生生物活性肽的蛋白酶的類型和酶解時間對產生的肽的生物活性有深刻的影響。利用堿性蛋白酶和木瓜蛋白酶水解駝乳蛋白，都提高了α-淀粉酶的抑制活性，但IC50值有所不同，從而證實了用特異性蛋白酶控制水解的重要性。不同蛋白酶水解駝乳蛋白可產生不同的肽段，但JX和MG中鑒定的肽段分解的主要源蛋白相同。其中IPLPLPLPLP和LPLPLPLR可認為是最有效的α-淀粉酶抑制活性肽，驗證了肽段的氨基酸序列與α-淀粉酶抑制活性有一定的關系。為了將所制得的活性肽應用到實際生活中，今后的工作還需要對肽的消化穩定性、生物安全性以及體內模型的α-淀粉酶抑制活性進行進一步研究。