茅臺鎮醬香白酒不同輪次主釀區可培養霉菌種群結構多樣性

朱治宇，黃永光

（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州省發酵工程與生物制藥重點實驗室，貴州 貴陽 550025）

以貴州茅臺酒為代表的醬香型白酒，因其獨特的釀造工藝和優質的口感，受到廣大消費者的青睞。與國外的蒸餾酒不同，醬香型白酒釀造屬于傳統固態發酵，工藝復雜、開放式多菌混合發酵。醬香型白酒獨特釀造環境和釀造工藝形成了其獨特的微生物體系，致使其形成獨特的風格特征：醬香突出、酒體醇厚、幽雅細膩、空杯留香持久[1-5]。研究發現[6]，醬香型白酒酒醅中的微生物來自大曲、原料、空氣及地面灰塵，其發酵過程涵蓋著細菌、酵母、霉菌等菌群結構復雜的演替。其中，霉菌能夠分泌多種酶，包括糖化酶、脂肪酶、蛋白酶和水解酶等，具有分解酒醅中的大分子物質、產生酒體中的風味物質或其前體物質的功能，與整個醬香型白酒風味物質的形成密切相關[7]，其中的絲狀真菌能夠產生糖化酶作用于原料中的淀粉，提高出酒率[8]，還可提升基酒品質。因此，系統性研究醬香白酒主釀區環境霉菌和大曲霉菌群落結構及其種間演替規律對科學探究醬香白酒發酵具有重要意義。

酒曲是白酒釀造的糖化發酵劑，富含多種酶類和菌類，醬香白酒的釀造用曲量高達1∶1，因此大曲在釀造過程中非常重要[9]。醬香白酒的大曲中含有多類霉菌，已知大多數的霉菌都參與酒醅發酵[10]，研究表明，霉菌代謝為大曲提供了豐富的酶系[11]，推動了大曲的發酵成熟，對大曲淀粉的糖化降解和防止曲塊裂口等具有重要意義[12]。其中Aspergillussp.、Absidiasp.、Rhizopussp.、Rhizomucorsp.、Mucorsp.、Penicilliumsp.和Monascussp.是酒曲中主要存在的7 類霉菌，約50 種[13]，游劍等[14]采用傳統可培養方法從枝江大曲酒的大曲中分離出Penicilliumsp.、Aspergillussp.和Mucorsp.等霉菌；班世棟等[15]從醬香型白酒大曲中得到了19 株不同的霉菌。但高溫大曲中溫度和濕度等條件會限制很多霉菌的生長[16]，醬香白酒還需要通過堆積發酵網羅環境中的霉菌來完成發酵[17]，由此可見，研究釀造大曲霉菌菌群結構及主釀區環境微生態霉菌多樣性對醬香白酒發酵具有重要意義。

目前，鮮見對茅臺鎮醬香白酒主釀區環境和大曲霉菌系統性研究，本課題為了從物種分類水平上詳細描述茅臺鎮醬香白酒釀造環境和大曲中霉菌群落的特征性結構[18]，在前期利用宏基因組學系統分析微生物結構的基礎上，對茅臺鎮醬香型白酒7 個不同輪次主要釀造區域（共包括17 家酒企，分為7 個區域）進行取樣，采用傳統可培養技術和現代18S rRNA聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）產物基因測序技術確定霉菌種屬，通過探究霉菌在各輪次種類、數量變化和功能分析（跟蹤整個生產期），擬充分認識醬香型白酒1～7輪次中起主導作用的霉菌多樣性結構特征、輪次間種群結構差異性以及消亡率、富集率變化，更清晰地從微觀角度描述大曲霉菌和環境霉菌對白酒釀造的作用，為今后醬香白酒微生物數據庫的建立和微生物層面的工藝優化提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：取自貴州省茅臺鎮TMS、GT、DDH等17 家醬香型白酒公司的白酒生產車間，2018—2019年1～7輪次主釀區環境樣品和大曲樣品。

真菌DNA試劑盒 北京索萊寶科技有限公司；霉菌引物（ITS1和ITS4） 北京全式金生物技術有限公司；DAN Marker（DM2000） 寶生物工程有限公司；瓊脂糖 南京生興生物技術有限公司；核酸染料（Gengreen） 上海賽百盛有限公司。

孟加拉紅培養基（上海博微生物有限公司）：蛋白胨5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、磷酸氫二鉀1.0 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、孟加拉紅0.033 3 g/L、瓊脂20.0 g/L、氯霉素0.1 g/L，pH 7.0～7.4。

麥芽汁液體培養基（上海博微生物有限公司）：麥芽膏粉130.0 g/L、氯霉素0.1 g/L、pH 5.6±0.2。

1.2 儀器與設備

超凈工作臺 蘇州金凈科技有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋、臺式高速冷凍離心機 美國Thermo Fisher Scientific公司；旋渦混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；HH-4數顯恒溫水浴鍋 常州澳華儀器有限公司；CP153電子天平 奧豪斯儀器（上海）有限公司；PCR儀 美國伯樂公司；DYY-8C型電泳儀北京六一儀器廠；JS-680C凝膠成像儀 上海培清科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品采集

樣品取自貴州省仁懷市茅臺鎮觀音寺區、上坪村、椿樹村、巖灘村、向陽村、盧榮壩村及合馬鎮街道社區共7 個醬香白酒主釀區域的17 個代表性釀酒企業，1～7輪次酒醅堆積發酵期間的主釀區環境樣品和生產使用大曲樣品。其中環境樣品采集包括：將各酒廠生產車間的窗戶玻璃、窗臺、晾堂及四周地面、墻面、墻角、行車梯子及上表面、配電箱上表面、消防箱上表面、儲酒罐和一些平時不易被打掃的角落等處的采樣點進行灰塵樣品等量采集并均勻混合。

將均勻混合的樣品作為該輪次樣品（17 家公司1～7輪次共計119 個大曲樣品和119 個環境樣品），均勻密封袋密封，并立即生物性保藏運回實驗室4 ℃冰柜低溫保存。準確標記每個取樣點以防被破壞，且每次都在相同取樣點取樣。最終，按照區域劃分將每個酒廠的樣品等量混合為代表一個區域的最終混合樣品（本實驗共分為7 個區域，每個區域1 個最終混合樣品，7 個輪次共計49 個大曲最終混合樣品和49 個環境最終混合樣品）。

1.3.2 霉菌菌株分離鑒定

實現“三教融合”的有效路徑就是通過農村普法教育的方式和途徑，將自治教育和德治教育內容填充其中。這是因為，普法教育內容與自治教育、德治教育存在內容上的交集和方式上的共通。一方面，村民自治教育的主要內容，除了我國現行的《村民委員會組織法》外，一般是村委會自身制定的自治性章程規范，而后者制定的淵源是前者。德治教育的內容離不開法律這一最低的限度，法律既是實現道德的手段，也是衡量道德的標準。另一方面，經過40年的普法教育，無論是傳統的說教宣傳手段，還是便捷先進的普法形式，在鄉村都已經有了相當的經驗和固定的通道，利用成熟的媒介進行“三教融合”便利又高效。

取25 g最終樣品溶于225 mL生理鹽水中[15]，加入玻璃珠，在160 r/min的搖床充分振蕩30 min，稀釋到不同梯度（取10－3、10－4、10－5三個梯度）并設置3 個平行組，涂布于孟加拉紅培養基上置于30 ℃培養箱中培養3～5 d，統計肉眼可見的不同霉菌菌落數目，參照《常見與常用真菌》[19]中的方法鑒定。

1.3.3 霉菌DNA的提取

將初篩所得的霉菌點板于孟加拉紅培養基上（設置3 個平行組），30 ℃培養箱中培養3～5 d，取6.5 g麥芽汁培養基溶于50 mL蒸餾水中，滅菌后冷卻，在無菌操作臺挑取部分菌體置于液體培養基中，在120 r/min的搖床振蕩3 d后，取培養基中的菌體研磨，再根據北京索萊寶科技有限公司的柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒說明書，對霉菌進行基因組DNA提取，將提取的菌株基因組DNA置于－20 ℃冰箱中保存備用。

1.3.4 PCR擴增及凝膠電泳

霉菌PCR擴增引物：ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）；PCR體系：2 μL DNA，1 μL Primer 1和1 μL Primer 2兩種引物，12.5 μL 2×EsTaqMasterMix和8.5 μL ddH2O，總體系共計25 μL。PCR擴增產物置于－20 ℃冰箱保存至送樣。PCR程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性60 s；51 ℃退火60 s；72 ℃延伸1 min，其中變性、退火和第1次延伸共經過35 個循環，最后在72 ℃延伸5 min結束。

1.3.5 18S rRNA PCR產物測序

1%瓊脂糖凝膠（加有10 μL Gel Red核酸染色劑）檢測確定的PCR產物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。后將測序結果在NCBI的BLAST數據庫中進行DNA序列比對分析[20]，從而確定霉菌的種屬。

斜面保藏：挑取純化的霉菌接種于已滅菌且凝固的孟加拉紅斜面試管中，在30 ℃培養箱中培養2～5 d后置于4 ℃的冰箱保藏。

甘油管保藏：挑取純化的霉菌菌株于5 mL己滅菌的麥芽汁液體培養基中30 ℃過夜培養，取多個菌絲團稍微研磨成渾濁菌液（約0.5 mL）加入0.5 mL已滅菌的30%甘油于1.5 mL的EP管中混合均勻，每個菌株做3 個甘油保藏，標記并放置于－80 ℃冰箱長期保藏。

1.4 數據處理

使用WPS 2019進行數據統計分析，堆積柱狀圖使用Origin 8.6繪制，RStudio繪制相對豐度圖、Venn圖和和弦圖。

2 結果與分析

2.1 不同輪次環境和大曲中可培養霉菌菌種分析

整合茅臺鎮7 個主釀區樣品數據作為該輪次數據進行分析，從不同輪次環境和大曲中分別分離得到614 株和486 株霉菌。根據點板霉菌菌落形態及其顏色特征排重，共送檢256 株霉菌，通過霉菌18S rRNA基因測序比對分析，結果如表1所示，環境樣品中共鑒定得到27 個屬57 個種，大曲樣品中共鑒定得到15 個屬31 個種。

表1 環境和大曲中分離篩選可培養霉菌分析結果Table 1 Separation and identification of culturable molds from the brewing environment and Daqu

續表1

表1 中M4、M6、M32、M46、M54、M67菌ITS的相似度小于98%，因此本實驗結合系統樹、菌落表征及生理特性等指標的考察，并查閱相關文獻報道比對，明確了上述結果的可靠性，菌落表征分析見表2。

如表1所示，從醬香型白酒釀造環境中共篩出27 個屬：Lichtheimia、Mucor、Aspergillus、Monascus、Penicillium、Talaromyces、Rhizomucor、Rhizopus、Pleosporales、Coniothyrium、Galactomyces、Ascomycota、Epicoccum、Trichosporon、Paecilomyces、Trichoderma、Syncephalastrum、Gymnomyces、Irpex、Phanerochaete、Trametes、Fusarium、Chaetomium、Schizophyllum、Scopulariopsis、Geotrichum、Phlebia，包括2 種Lichtheimia、17 種Aspergillus、2 種Monascus、5 種Penicillium、5 種Mucor、2 種Rhizopus、2 種Rhizomucor、3 種Talaromyces等57 種霉菌。從醬香型白酒釀造大曲中共篩出15 個屬：Lichtheimia、Aspergillus、Monascus、Penicillium、Thermoascus、Phanerochaete、Paecilomyces、Rhizomucor、Irpex、Emmia、Cladosporium、Schizophyllum、Mucor、Trametes、Hyphodontia，包括2 種Lichtheimia、8 種Aspergillus、6 種Monascus、4 種Penicillium等31 種霉菌。

表2 ITS相似度小于98%可培養霉菌菌落表征分析Table 2 Characterization of culturable mold colonies with ITS similarity less than 98%

范光先等[21]以茅臺釀造過程中的酒醅、大曲、環境灰塵為樣品，利用傳統可培養技術分離出51 種霉菌；黃永光[22]從醬香白酒釀造環境及其主要釀造環節中共篩出10 種曲霉：A. niger、A. oryzae、A. terreus、A. tubingensis、A. flavus、A. hennebergii、A. fumigatus、A. niveus、A. candidus和M. ruber，其中有7 種曲霉與本實驗結果一致。本課題在醬香白酒釀造區域環境和大曲樣品中共分離篩選出霉菌31 個屬68 個種，包括17 種Aspergillus和6 種Monascus。由于實驗采樣區域廣泛，涵蓋茅臺鎮多個醬酒主釀區，且對整個生產周期進行了跟蹤，使數據較前人研究霉菌種類更豐富。另外，在醬香白酒釀造區域環境和大曲樣品中首次檢出6 種霉菌：S. racemosum、P. cinnamopurpureum、T. diversiformis、A. pragensis、A. allahabadii、H. palmae，多種霉菌混合發酵為白酒生產提供了豐富的酶系、有利的酸堿環境、多種風味成分和前體物質等[23]。

沈毅等[24]分析了醬香酒醅中真菌微生物的組成及其多樣性，發現了Paecilomyces、Thermomyces、Monascus等豐度較高的霉菌；孫劍秋等[25]通過傳統可培養技術分離醬香型白酒酒醅中的霉菌，其中Aspergillus、Penicillium、Geotrichum、Monascus、Mucor、Scopulariopsis、Paecilomyces、Cladosporium等屬霉菌與本實驗發現的霉菌相符；徐佳等[26]研究發現，Monascus、Mucor、Penicillium、Lichtheimia、Aspergillus、Rhizopus等屬霉菌是茅臺酒醅中常見的霉菌，其中A. nidulans、A. fumigatus、A. candidus、A. flavus、M. rutilus、M. ruber、M. purpureus等精確到種的霉菌與本實驗發現的霉菌相符；母應春等[27]運用高通量測序技術分析了貴州省3 個地區的酒曲中微生物群落組成和多樣性，結果表明Rhizopus、Aspergillus和Thermomyces是酒曲中優勢霉菌；李靜心等[28]運用高通量測序技術從白酒高溫大曲和中高溫大曲中分離出Aspergillus、Thermomyces和Rhizomucor等高豐度霉菌。本實驗中Thermomyces在大曲中豐度較高，但在環境中未篩出，分析原因可能是該菌嗜熱，環境溫度較低不適合該菌的生長；對比前人研究發現，醬香白酒酒醅發酵過程中多種霉菌與本實驗研究相符，說明釀造大曲和環境為酒醅發酵提供了主要微生物來源。

2.2 不同輪次環境中可培養霉菌種群結構分析

2.2.1 多樣性結構分析

圖1 不同輪次環境中霉菌相對豐度Fig. 1 Relative abundance of molds from the brewing environment in different fermentation rounds

將環境樣品中鑒定得到的霉菌按照GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》方法計數[29]，運用軟件Origin 8.6繪制上述釀造環境中57 種霉菌在1～7輪次相對豐度堆積柱形圖。從圖1可以看出，至少在1 個輪次平均相對豐度大于20%的霉菌包括4 個屬4 個種，分別為L. corymbifera21%、M. circinelloides21.58%、P. variotii24.37%和S. commune21.17%；至少在1 個輪次平均相對豐度大于10%的霉菌包括6 個屬12 個種，分別為L. corymbifera、L. ramosa、M. circinelloides、M. racemosus、A. sydowii、A. flavus、A. tritici、A. oryzae、Monascussp. Atc8、R. pusillus、P. variotii、S. commune。綜上研究表明，Lichtheimia、Mucor、Aspergillus、Monascus、Rhizomucor、Paecilomyces、Schizophyllum等屬霉菌是醬香白酒釀造環境中具有絕對優勢的霉菌，其中Aspergillus的種類多達4 種，說明Aspergillus在醬香白酒釀造過程中發揮重要作用，與前人研究相符[25-26]。另外，霉菌種類在2、3、4、5輪次最多，其中第4輪次霉菌種類多達13 個屬21 個種。說明醬香白酒發酵過程中2、3、4、5輪次是發酵最主要的幾個輪次，其中第4輪次中霉菌數量和種類均最多，是發酵的核心輪次。該結果與楊大金等[30]研究相符，被稱為“大回酒”的3、4、5輪次酒具有產酒率高、酒質好、醬香風味突出等特點。另外，前期應用Illumina高通量測序分析霉菌菌群結構，主釀區環境樣品中得到4 個門、20 個科、89 個屬，對比本實驗數據，有75%以上的屬能與高通量數據對應，25%左右的屬未在高通量數據中對應。分析原因可能是培養條件和分析方法的不同，使得數據在可接受范圍內產生一定的差異。相對而言，高通量測序技術能更全面準確地分析樣品微生態結構，而傳統可培養技術較具局限性，適用于分析有限優勢菌群結構[31]。本實驗中優勢霉菌與高通量測序分析結果基本一致，證實了本實驗的可靠性。

分析霉菌的消漲可知，Lichtheimia在1～6輪次趨于穩定，第7輪次未篩出該菌；Mucor在1、5、6、7輪次含量較高，2、3、4輪次含量較低；Aspergillus、Monascus隨輪次的增加逐漸減少；Rhizomucor在1、6、7輪次含量較高；Paecilomyces隨輪次先增加后減少，在3、4、5輪次含量較高；Schizophyllum分布輪次較少，主要集中在3、4輪次。原因主要是發酵前期原料淀粉含量較高、溫度較低，發酵中期受季節影響溫度較高，發酵后期淀粉含量和環境溫度均降低，Lichtheimia具有產熱穩定性淀粉酶的能力[32]，適合在高溫、高淀粉含量條件下生長，而第7輪次溫度降低及原料中淀粉含量減少不利于該菌生長；Mucor和Rhizomucor適合在適宜的條件下生長，溫度升高則被抑制[33]；Aspergillus和Monascus酶系豐富[34-35]，當原料逐漸消耗殆盡[36]，其含量也逐漸下降；Paecilomyces和Schizophyllum適合在高溫條件下生長[37-38]，隨溫度的降低受到抑制。綜上表明，在茅臺鎮醬香型白酒發酵過程中，霉菌種群多樣性結構隨著發酵輪次的進行發生改變，說明不同發酵輪次對霉菌生長具有調控作用，霉菌種類和優勢霉菌的更替產生豐富的酶系對醬香白酒酒體的飽滿具有積極促進作用[7]。

2.2.2 輪次間種群結構差異性分析

圖2 不同輪次環境中相對豐度大于5%的霉菌Upset圖Fig. 2 Upset plot of molds with relative abundance greater than 5%from the brewing environment in different fermentation rounds

運用軟件RStudio繪制不同釀造輪次環境相對豐度大于5%（共23 種）霉菌Upset圖，見圖2。對環境樣品中57 種霉菌進行篩選，得到23 種霉菌相對豐度大于5%。由左側條形圖可知，3、4、5輪次種類優勢明顯，其中4輪次最多；右側Upset圖表明，23 種霉菌有6 種單獨出現在2、6、7輪次中，剩余17 種霉菌具有輪次間的傳承性，其中，3、4輪次之間有10 種共有霉菌，4、5輪次之間有9 種共有霉菌，3、4、5輪次之間6 種共有霉菌。結果表明，茅臺鎮醬香白酒釀造環境中各輪次霉菌之間存在一定的共性特征，且特征霉菌穩定性較強，遷移率較高，具有數量和種類的傳承性。

另外，上述23 種霉菌在第1輪次發酵起始時發現9 種（相對豐度和占88.54%），到第7輪次發酵結束時剩余3 種（相對豐度和占38.71%），消亡率高達49.83%；有5 種霉菌發酵起始時未發現，但在發酵結束時檢出（相對豐度和占61.29%）；有9 種霉菌僅出現于發酵中間階段，即2～6輪次（相對豐度和占比分別為34.04%、6.72%、37.23%、25.17%、24.00%，均低于50%）。消亡率與富集率較高說明不同發酵階段對霉菌調控作用明顯，而各階段霉菌存在差異性為各輪次白酒生產提供更豐富酶系，但差異性低于相似性說明各階段起主導作用的霉菌具有較強的傳承性。

2.3 不同輪次大曲中可培養霉菌種群結構分析

2.3.1 多樣性結構分析

將大曲樣品中鑒定得到的霉菌按照上述方法，繪制釀造大曲中31 種霉菌在1～7輪次相對豐度堆積柱形圖，見圖3。至少在1 個輪次平均相對豐度大于20%的霉菌包括4 個屬5 個種，分別為L. corymbifera20.55%、L. ramosa27.27%、A. allahabadii20.00%、P. sordida25.64%、T. crustaceus22.06%；至少在1 個輪次平均相對豐度大于10%的霉菌包括5 個屬8 個種，分別為L. corymbifera、L. ramosa、A. allahabadii、P. griseofulvum、P. citrinum、P. crustosum、P. sordida、T. crustaceus。綜上研究表明，Lichtheimia、Aspergillus、Penicillium、Phanerochaete、Thermoascus等屬霉菌是醬香白酒釀造區域大曲中具有絕對優勢的霉菌，對比本實驗結果與前人研究基本相符[26-27]。但R. pusillus數量和輪次分布均較少僅在第1輪次發現，對比環境中R. pusillus的生長狀況，認為該菌雖然具有一定的耐熱性[39]，但醬香白酒中高溫大曲的溫度過高，不適合該菌的生長。值得注意的是，本實驗發現A. allahabadii是大曲中的優勢霉菌，也是首次在醬香白酒大曲中被發現，但該結果并沒有前人研究證實，原因可能是：1）本實驗涉及白酒主釀區域較廣，樣品較多，實現了數據的創新；2）該菌原本并非優勢菌，但由于樣品采集導致環境條件改變，有利于該菌的繁殖；3）平板培養的環境條件適合該菌的生長。實驗后期采用空白平板篩選實驗室環境中的霉菌，并未發現該菌，證明該菌是樣品本身攜帶。研究發現A. allahabadii可以產生包括β-葡糖苷酶、β-半乳糖苷酶在內的多種酶，其中β-半乳糖苷酶的產量最高，該酶可以水解多糖中的端鏈半乳糖殘基、降解抗營養因子，提高人體免疫力，是一種功能性很強的有益菌[40]，但是否為大曲中的優勢菌種以及在大曲中發揮的作用，還待后續進一步的研究。另外，前期應用Illumina高通量測序分析霉菌菌群結構，主釀區生產大曲樣品中得到5 個門、17 個科、68 個屬。對比本實驗數據，有80%以上的屬和能與高通量數據對應，而優勢霉菌Penicillium與高通量測序分析結果略有不同，原因可能是可培養條件較適宜該菌的生長，使其成為本實驗的優勢菌種。

圖3 不同輪次大曲中霉菌相對豐度Fig. 3 Relative abundance of molds from Daqu in different fermentation rounds

分析霉菌的消漲可以發現，Lichtheimia在2、3、4輪次含量較低，6、7輪次含量較高；Aspergillus在1、7輪次含量較高，5、6輪次含量較低；Penicillium在各輪次含量趨于穩定；Phanerochaete在1～5輪次含量較高，6、7輪次含量較低；Thermoascus在3～7輪次含量較高，2輪次含量較低，1輪次中未發現。分析原因可知，傳統醬香高溫大曲品溫高達60 ℃左右，加之發酵中期受季節影響溫度較高，抑制了包括Lichtheimia、Aspergillus等微生物的生長，Penicillium耐高溫性不好，在不利的條件下會以孢子形式存在，樣品采集后條件改變使得孢子萌發，導致其在各輪次含量趨于穩定[41]；Thermoascus能夠在45 ℃以上的高溫環境中生長代謝，并產生耐熱的纖維素酶和木聚糖酶[42]，在環境樣品中未篩出該菌，而大曲卻對Thermoascus進行了富集。實驗結果表明，高溫大曲會對環境中的霉菌進行篩選和富集，從而抑制酸敗菌的生長，促進高溫細菌和嗜熱霉菌的繁殖[43]，有利于醬香白酒酒體的成型與穩定[11-12]。

2.3.2 輪次間種群結構差異性分析

圖4 不同輪次大曲中相對豐度大于5%霉菌Upset圖Fig. 4 Upset plot of molds with relative abundance greater than 5%from Daqu in different fermentation rounds

對大曲樣品中31 種霉菌進行篩選，得到18 種霉菌相對豐度大于5%（圖4）。由左側條形圖可知，各輪次霉菌種類差異性不大，1輪次種類最多，4輪次最少；右側Upset圖表明，18 種霉菌有3 種單獨出現在2、3輪次中，剩余15 種霉菌具有輪次間的傳承性，其中，有5 種霉菌在7 個輪次都被發現。對比環境霉菌，釀造大曲各輪次霉菌之間傳承性更強，推測原因是由于外界環境比曲房更復雜，曲房內穩定的環境更有利于霉菌的傳承與遷移。

上述18 種霉菌在第1輪次發酵起始時發現12 種（相對豐度和占90.40%），到第7輪次發酵結束時剩余7 種（相對豐度和占79.09%），消亡率為11.31%；有2 種霉菌發酵起始時未發現，但在發酵結束時檢出（相對豐度和占20.91%）；有4 種霉菌僅出現于發酵中間階段，即2～6輪次（相對豐度和占比分別為9.01%、11.97%、0%、15.87%、2.21%）。結果表明，大曲中起主導作用霉菌傳承性極強，各階段霉菌差異性較低，消亡率遠低于環境（49.83%），正是由于高溫大曲對優勢霉菌具有良好的傳承和篩選特性，加之醬香白酒用曲量較大[9]，使得這些優勢霉菌進入酒醅后迅速主導發酵。本實驗詮釋了“曲為酒骨”，用微觀的角度分析了制曲的重要性。

2.4 不同輪次環境與大曲霉菌種群結構差異性分析

圖5 環境和大曲中霉菌種群Venn圖Fig. 5 Venn diagram showing the number of molds at the genus and species level between the brewing environment and Daqu

圖6 不同釀造輪次環境及大曲中霉菌種群和弦圖分析Fig. 6 Chord diagram showing the relative abundance of molds between the brewing environment and Daqu

繪制Venn圖和和弦圖直觀分析醬香白酒釀造區域環境及大曲中霉菌的共性與特性，見圖5、6。大曲霉菌中有11 個屬與環境一致，占大曲總屬73.33%，各輪次相對豐度和分別為99.32%、96.53%、86.33%、85.25%、92.06%、77.94%和85.45%；大曲霉菌中有20 個種與環境一致，占大曲總種的64.52%，各輪次相對豐度和分別為75.33%、79.84%、81.19%、85.25%、75.39%、63.98%和85.45%。值得注意的是，醬香型高溫大曲曲坯初入房時并非高溫，此時溫度較低濕度較高，適合籠絡環境中多種微生物生長和代謝，隨著溫度的升高實現了對嗜熱微生物的篩選[37]。上述結果可知，大曲與環境中霉菌類群相似度較高，說明大曲在曲房開放式發酵過程中與環境霉菌資源具有一定的交集作用，而大曲通過品溫上升的篩選，最終實現環境、原料等外界中的有益霉菌向大曲遷移富集。

環境霉菌中有16 個屬在大曲中未發現，占環境總屬59.26%，各輪次相對豐度和分別為11.44%、7.81%、5.04%、4.38%、2.88%、0%和24.74%；環境霉菌中有37 個種在大曲中未發現，占環境總種64.91%，各輪次相對豐度和分別為11.44%、39.74%、11.76%、16.06%、25.17%、26.00%和35.50%。結果顯示，環境中存在多種霉菌，其中未進入大曲發酵的霉菌種類超過50%。眾所周知，醬香白酒堆積發酵是自然網羅、富集釀造環境中微生物過程，能夠形成獨特的微生物菌群結構[2]，以上數據證實了醬香白酒堆積發酵網羅環境中微生物的重要性。

綜上可知，醬香白酒釀造區域環境中存在種類繁多的霉菌，無論是高溫大曲的制作工藝還是堆積發酵工藝，都是為籠絡環境中霉菌為后續發酵提供微生物動力。從微生物角度分析，若發酵過程中舍棄撒曲僅靠堆積發酵籠絡環境微生物，會使有益霉菌無法主導發酵或因生物量不足延長發酵時間，從而嚴重影響白酒口感甚至使酒醅變質；若舍棄堆積發酵，雖然大曲提供了主導發酵的有益霉菌，但如圖6所示，各輪次將有30%左右霉菌被摒棄。

表3 部分相對豐度小于5%可培養霉菌功能總結分析Table 3 Functions of selected culturable molds with relative abundance less than 5%

由表3可知，部分豐度較小的霉菌同樣具有產香功能，可見，若舍棄環境中這些豐度較小的霉菌可能會對醬香白酒品質產生重要影響。

3 結 論

對茅臺鎮醬香白酒7 個主釀區1～7輪次環境和大曲中可培養霉菌種群結構多樣性進行研究，分別分離得到614 株和486 株霉菌，通過形態特征和18S rRNA基因測序比對分析，共送檢256 株霉菌，最終環境樣品中鑒定得到27 個屬57 個種不同霉菌，大曲樣品中鑒定得到15 個屬31 個種不同霉菌。通過對不同輪次釀造環境和大曲中可培養霉菌多樣性結構分析，明確了Lichtheimia、Mucor、Aspergillus、Monascus、Rhizomucor、Paecilomyces、Schizophyllum等屬是醬香白酒釀造環境中具有絕對優勢的霉菌；Lichtheimia、Aspergillus、Penicillium、Phanerochaete、Thermoascus等屬是醬香白酒釀造大曲中具有絕對優勢的霉菌，通過對比前人研究發現，醬香白酒酒醅發酵過程中多種霉菌與本實驗研究相符，說明釀造大曲和環境為酒醅發酵提供了主要微生物來源。

通過對輪次間可培養霉菌種群結構差異性分析，證實了不同輪次環境中霉菌之間存在一定的共性特征，且特征霉菌穩定性較強，遷移率較高，具有數量和種類的傳承性。通過對比消亡率和富集率，進一步說明不同發酵階段對霉菌調控作用明顯，各階段霉菌存在的差異性為各輪次白酒生產提供更豐富酶系，但差異性低于相似性說明各階段起主導作用的霉菌具有較強的傳承性；對比環境霉菌，釀造大曲各輪次霉菌之間傳承性更強，各階段霉菌差異性較低，消亡率遠低于環境，起主導作用霉菌具有極強傳承性，該結論詮釋了“曲為酒骨”，從微觀的角度分析了制曲的重要性。

通過對環境與大曲霉菌種群結構差異性分析，發現大曲與環境中霉菌類群相似度較高，說明大曲在曲房開放式發酵過程中與環境霉菌資源具有一定的交集作用，而大曲通過品溫上升的篩選，最終實現環境、原料等外界中的有益霉菌向大曲遷移和富集。另外，實驗發現環境中有37 種（各輪次相對豐度和占30%左右）霉菌未在大曲中篩出，證實了醬香白酒堆積發酵網羅環境中微生物的重要性。本實驗深入剖析了環境霉菌和大曲霉菌對醬香白酒發酵的重要意義，從微生物角度詮釋了高溫大曲和堆積發酵都是醬香白酒中不可分割的釀造工藝。