鹽度對郫縣豆瓣甜瓣子發酵過程中微生物及產品品質的影響

李雄波，李 恒，鄧維琴，張其圣，陳相杰，范智義，李潔芝，陳 功,

（1.成都大學藥學與生物工程學院，四川 成都 610106；2.四川省食品發酵工業研究設計院，四川 成都 611130；3.四川東坡中國泡菜產業技術研究院，四川 眉山 620030；4.成都市丹丹川菜調味品產業研究院有限公司，四川 成都 611730）

郫縣豆瓣是中國傳統發酵食品，被譽為“川菜之魂”，近年來，隨著川菜產業的發展，郫縣豆瓣產業實現了井噴式發展，然而由于郫縣豆瓣鹽度過高，發酵速度慢已成為制約產業發展的瓶頸，同時高鹽食品也不符合人們低鹽飲食的消費趨勢[1]。甜瓣子是將去皮干制的蠶豆瓣復水漂燙后接種米曲霉制曲發酵1～2 d后（豆瓣曲），再與一定比例的鹽水（平衡后鹽度15%）混合發酵而成的一種半固態的豆瓣醬半成品[2-3]，因其瓣形完整而顯著區別于其他發酵醬類產品[4]。甜瓣子發酵是郫縣豆瓣生產的重要環節之一，因其特有的“短時漂燙”、“熟不過心”等工藝條件，一般被認為是生料發酵[5]，生料發酵因原料未經滅菌處理，附著較多雜菌，需要采用較高的鹽度以抑制雜菌的生長，這是郫縣豆瓣制作周期長和產品鹽度高的癥結所在。

鹽度是影響甜瓣子發酵的重要因素之一，然而國內外鮮有關于鹽度對甜瓣子發酵過程影響的研究報道，但是其他豆類發酵食品（如：大醬、黃豆醬等）中鹽度對發酵的影響研究已有報道。研究結果表明，曲霉屬在各鹽度發酵的豆類食品中都是主導真菌菌群[6-7]；但細菌菌群在不同鹽度條件下存在較大差異。Kim等[8]研究發現低鹽大醬是由Enterococcus啟動發酵，然后由Lactobacillus主導發酵，而高鹽大醬中Enterococcus主導整個發酵過程；Cui Yanhua等[9]對黃豆醬的研究表明，不同鹽度黃豆醬中乳酸菌菌群結構差異較大，其中高鹽黃豆醬中以嗜鹽乳酸菌（Tetragenococcus）為主，而低鹽黃豆醬中則以非嗜鹽乳酸菌（Enterococcus）為主。發酵食品中，微生物菌群結構的差異是導致物質成分差異的主要原因，低鹽條件有利于總酸和氨基酸態氮的形成，但不利于還原糖的積累，高鹽條件則反之[10-12]。由此可見，不同鹽度條件下微生物菌群差異顯著；低鹽條件有利于提高發酵速度，產生更多的有機酸和氨基酸態氮等物質；從產品指標角度來說，可能有利于提高甜瓣子的品質。然而，也有研究報道稱發酵食品中鹽度降低往往對產品風味產生不利影響，使得消費者難以接受[12-13]。

目前，鹽度對甜瓣子發酵的影響研究非常匱乏，因此系統研究鹽度對甜瓣子發酵的影響，探明發酵過程中的微生物演變規律和物質成分及產品品質之間的關系，有助于優化甜瓣子發酵工藝，為甜瓣子降鹽和快速發酵提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

食鹽 市售；霉瓣子由郫都區某豆瓣醬生產企業提供。

平板計數瓊脂、孟加拉紅培養基、MRS培養基（生化試劑） 北京奧博星生物技術有限責任公司；氫氧化鈉、鄰苯二甲酸氫鉀、37%甲醛溶液、酒石酸鉀鈉、葡萄糖、3,5-二硝基水楊酸、重蒸酚、亞硫酸鈉、碳酸鈣（均為分析純） 成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

752G型紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；DZKW-4型恒溫水浴鍋 北京中興偉業儀器有限公司；ESJ200-4A型分析天平 沈陽龍騰電子有限公司；PHSJ-4F型pH計 梅特勒型-托利多國際貿易（上海）有限公司；SW-CJ-2F型超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術有限公司；LDZF-75L-H型高壓蒸汽滅菌鍋 上海申安醫療器械廠；SPX-150B-4型生化培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 方法

1.3.1 不同鹽度甜瓣子的制備

實驗設置了4 個實驗組，鹽度（質量分數）分別為6%、9%、12%和15%，每組3 個平行，分別稱取2.5 kg豆瓣曲和2.5 kg鹽水混勻，置于食用酒精消毒處理后的玻璃罐中，37 ℃發酵57 d。定期采用無菌勺子攪拌甜瓣子，取樣待后續分析。

1.3.2 成分測定

中華合作時報社編委、中國農資傳媒執行總編輯孫立新以媒體視角看經銷商的轉型。他在《新時代農資經銷商的機遇與使命》專題報告中，以媒體的視角分析了近年來農資經銷商的轉型和未來的發展方向，以中國農資傳媒傳統活動項目——全國百佳（優秀）農資經銷商評選的活動為例，闡述經銷商正在發揮自身的特殊優勢，扎根基層、誠信經營，悄然向對“三農”的服務商轉變，投身公益事業，努力成為國家倡導的“一懂兩愛”的群體，承擔起美麗鄉村建設的特殊中間力量。

總酸與氨基酸態氮的測定：采用GB 5009.235—2016《食品中氨基酸態氮的測定》中酸度計法進行測定；還原糖測定：采用3,5-二硝基水楊酸法[14]進行測定。

1.3.3 感官特性評定

選取10 名項目組長期從事豆瓣醬發酵相關研究的研究員（男5 名，女5 名）組成評價小組，并對評價小組人員進行感官評價知識和技能培訓，以保證評價人員對甜瓣子的風味特征能達成共識。評價小組人員從香氣、滋味、色澤、體態4 個方面對不同鹽度的甜瓣子進行感官評分，以平均分作為產品指標的評分。感官評定標準見表1。

表1 甜瓣子的感官標準Table 1 Criteria for sensory evaluation of Pixian broad bean paste mash

1.3.4 微生物數量的測定

細菌總數的測定：根據GB 4789.2—2016《食品微生物學檢驗：菌落總數測定》中方法稍作修改，改用含0.03%納他霉素的平板計數培養基傾注培養；霉菌總數的測定：采用GB 4789.15—2016《食品微生物學檢驗：霉菌和酵母菌計數》中平板計數法進行計數；乳酸菌總數的測定：稱取25.0 g樣品于裝有225 mL無菌生理鹽水的三角瓶中，制成10－1稀釋液后于試管內進行梯度稀釋，選取3 個適宜稀釋度，分別取1 mL稀釋液于培養皿中，注入MRS固體培養基（含2%碳酸鈣）傾注培養，每個梯度做3 次平行，37 ℃培養箱培養48 h后，選取有明顯透明圈的菌落進行計數。

1.3.5 樣品總DNA抽提及高通量測序

樣品總DNA抽提、聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴增及基于Illumina MiSeq平臺的測序均由上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。采用338F-806R為引物擴增細菌16S DNA V3-V4區序列，采用ITS1F-ITS2R為引物擴增真菌ITS區序列。最終得到的序列按照97%相似性對非重復序列（不含單序列）進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類，得到OTU的代表序列，將所有優化序列map至OTU代表序列，選出與OTU代表序列相似性在97%以上的序列，最后采用RDP classififier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在各水平統計每個樣品的群落組成。16S細菌使用Silva數據庫，ITS真菌使用Unite的真菌數據庫進行比對。

1.4 數據處理與分析

2 結果與分析

2.1 不同鹽度甜瓣子發酵過程中微生物數量的變化

霉菌是甜瓣子發酵優勢微生物，霉菌孢子的數量往往與甜瓣子的蛋白酶活性等相關，是保證后續郫縣豆瓣發酵成功的關鍵。由于采用了純種制曲，霉菌（圖1A）的起始數量較高（7.4（lg（CFU/g））），隨著發酵的進行霉菌數量逐漸下降；高鹽條件下霉菌下降速度較慢，低鹽條件下降速度較快；尤其是在第8天之后，低鹽甜瓣子（6%和9%）與高鹽甜瓣子（12%和15%）之間霉菌數量有顯著差異，霉菌數量相差0.8（lg（CFU/g））以上，其中6%鹽度的甜瓣子發酵37 d以后霉菌幾乎不能檢出。

細菌在甜瓣子發酵過程中起到非常重要的作用，與甜瓣子的風味和質量密切相關。細菌總數在整個發酵過程中變化趨勢相似（圖1B），發酵開始時甜瓣子中細菌總數較高（6.9～7.1（lg（CFU/g））），當與一定質量分數鹽水混合發酵以后，細菌數量急劇下降，不耐鹽的細菌數量大幅度減少，隨后細菌總數開始緩慢上升，后期則保持相對穩定（7.3～7.4（lg（CFU/g）））。發酵前期，低鹽甜瓣子（6%和9%）和高鹽甜瓣子（12%和15%）中細菌數量有明顯差異，且低鹽條件下細菌數量高于高鹽條件下細菌數量，但發酵16 d以后二者差異逐漸縮小，不同鹽度條件下細菌數量基本相同且變化規律相近。乳酸菌只在低鹽甜瓣子（6%和9%）的發酵初期被檢測出（圖1C），其初始值在4.6（lg（CFU/g））左右，但16 d以后也全部消亡，這是由于后期總酸含量過高，反而抑制了乳酸菌的生長[15]。

圖1 鹽度對甜瓣子發酵過程中霉菌總數、細菌總數和乳酸菌總數的影響Fig. 1 Effects of salt concentration on mold, bacteria and lactic acid bacteria counts during fermentation of broad bean paste mash

2.2 不同鹽度甜瓣子發酵過程中微生物群落結構的變化

微生物組成的差異可能是不同鹽度甜瓣子發酵過程中微生物含量差異的主要原因，采用Illumina高通量測序平臺對發酵前期（8 d）和發酵后期（57 d）不同鹽度的甜瓣子樣品進行分析，細菌采用338F-806R為引物擴增16S DNA V3-V4區序列，測得原始序列856 780 條，對原始序列進行優化處理后，得到有效序列428 390 條，并在97%相似度下將其進行OTU聚類，共產生364 個OTU分類；真菌采用ITS1F-ITS2R為引物擴增ITS區序列，測得原始序列988 740 條，對原始序列進行優化處理后，得到有效序列494 370 條，并在97%相似度下將其進行OTU聚類，共產生7 個OTU分類。各樣本在屬水平上相對豐度大于1%的菌群結構，如圖2所示。

如圖2A所示，從屬水平看，不同鹽度甜瓣子中真菌菌群結構單一，樣品中真菌菌群只包含3 個屬，分別為Aspergillus、Millerozyma和Zygosaccharomyces；且鹽度對發酵過程中真菌菌群結構影響較小，Aspergillus是不同甜瓣子發酵過程中絕對優勢真菌菌群。其中，Aspergillus是不同鹽度甜瓣子發酵前期檢測到的唯一真菌菌屬，雖然發酵后期也檢測到Millerozyma、Zygosaccharomyces等酵母菌，但除了6%鹽度中Millerozyma相對豐度較高以外，其余鹽度甜瓣子中酵母菌相對豐度均低。有研究表明，酵母菌產生乙醇和其他代謝物能給發酵食品帶來理想的風味和香氣特征[16]。

圖2 鹽度對甜瓣子發酵過程中屬水平真菌和細菌菌群結構的影響Fig. 2 Effects of salt concentration on fungal and bacterial community in broad bean paste mash during fermentation at the genus level

如圖2B所示，在屬水平上，甜瓣子中鹽度越高，細菌菌群多樣性越豐富，但不同鹽度之間細菌菌群結構存在較大差異。發酵初期，6%鹽度甜瓣子中Lactobacillus（57.49%）、Weissella（20.18%）和Staphylococcus（14.40%）是優勢菌群；而9%、12%、15%鹽度甜瓣子中細菌菌群結構相似，以Staphylococcus（62.58%；59.78%；42.22%）、Bacillus（8.10%；13.04%；10.11%）、Weissella（4.32%；4.62%；9.51%）、Pseudomonas（2.51%；4.41%；1.33%）、Leuconostoc（6.17%；2.66%；7.53%）、Lactococcus（2.62%；2.25%；2.86%）為主要細菌菌群。6%鹽度的甜瓣子中細菌菌群結構在發酵初期便顯著區別于其他鹽度的甜瓣子，這是由于6%的鹽度對Lactobacillus等乳酸菌抑制作用弱[17]，乳酸菌產生乳酸，導致發酵體系中pH值迅速降低，進而抑制競爭微生物的生長[18]。隨著發酵進行，不同鹽度甜瓣子中細菌菌群結構變化呈現出不同趨勢。發酵后期，6%鹽度的甜瓣子中Lactobacillus（78.08%）成為了絕對優勢菌群；9%鹽度的甜瓣子中Staphylococcus（33.90%）相對豐度下降，而Lactobacillus（18.05%）和Pseudomonas（11.70%）相對豐度上升；12%鹽度的甜瓣子中Staphylococcus（29.46%）相對豐度下降，而Tetragenococcus（38.47%）相對豐度大幅提升；而15%鹽度的甜瓣子中細菌菌群結構相對穩定，這是由于高鹽抑制了絕大部分微生物的代謝活動，使得菌群之間相互競爭作用較弱。

2.3 不同鹽度甜瓣子發酵過程中物質成分的變化

甜瓣子發酵過程中，微生物及酶利用原料中蛋白質、淀粉等大分子物質分解代謝形成總酸、氨基酸態氮和還原糖等物質成分，這些物質成分本身就是重要的風味物質，此外還參與多種風味物質的合成。因此，總酸、氨基酸態氮和還原糖含量是衡量甜瓣子品質、發酵程度和微生物代謝情況的主要指標。

圖3 鹽度對甜瓣子發酵過程中總酸、氨基酸態氮和還原糖含量的影響Fig. 3 Effects of salt concentration on total acidity, amino nitrogen and reducing sugar during fermentation of broad bean paste mash

由圖3A可知，甜瓣子中鹽度越低，總酸含量越高，特別是發酵12 d以后，低鹽甜瓣子（6%和9%）中總酸含量遠遠高于高鹽甜瓣子（12%和15%）。高鹽甜瓣子（12%和15%）發酵過程中總酸含量始終較低，發酵結束時分別只有1.4%、1.1%；而低鹽甜瓣子（6%和9%）中總酸含量在發酵前期快速上升，分別在第12、16天達到峰值3.2%、2.3%。但是，6%鹽度甜瓣子中總酸含量在發酵后期逐漸下降，這是由于低鹽條件下乳酸菌在發酵后期消亡（圖1C），而酵母生長代謝旺盛，酵母菌產生的乙醇通過酯化反應消耗了部分酸類物質，從而使得總酸含量下降。從鹽度對甜瓣子中總酸含量的影響來看，甜瓣子中鹽度控制在12%以上才能有效防止發酵過程產酸過高。

由圖3B可知，不同鹽度條件下，甜瓣子發酵過程中氨基酸態氮含量均呈先增加后趨于穩定的變化趨勢，但不同鹽度之間變化趨勢存在一定差異，表現為鹽度越高，氨基態氮含量上升速度越慢，含量越低。發酵結束時，6%、9%、12%、15%鹽度的甜瓣子中氨基酸態氮質量分數分別為1.00、0.77、0.66、0.53%，低鹽甜瓣子（6%和9%）中氨基酸態氮含量遠高于高鹽甜瓣子（12%和15%）中氨基酸態氮含量。此外，甜瓣子中氨基酸態氮主要在發酵前期（0～12 d）形成，6%、9%、12%、15%鹽度的甜瓣子中氨基酸態氮質量分數在12 d時分別為0.85%、0.67%、0.55%、0.44%，此時含量均超過發酵結束時含量的80%以上，這可能與發酵初期蛋白酶活性高有關。從氨基酸態氮含量來看，低鹽條件更有助于提高甜瓣子的發酵速度。

由圖3C可知，甜瓣子中還原糖含量呈先增加后逐漸趨于穩定的變化趨勢，且鹽度越低，還原糖含量越低。6%鹽度甜瓣子中還原糖含量在整個發酵過程中始終較低，發酵結束時僅有2.8%；9%、12%、15%鹽度的甜瓣子中還原糖質量分數在0～8 d差異較小，都由1.9%左右快速上升至5.9%左右，此后逐漸出現差異，發酵結束時分別為4.2%、5.7%、6.6%。

2.4 鹽度對甜瓣子感官品質的影響

感官品質是直接表征甜瓣子品質的重要指標。通過從香氣、滋味、色澤和體態4 個方面對發酵結束的甜瓣子進行評價，評價結果如圖4所示。

圖4 鹽度對甜瓣子感官品質的影響Fig. 4 Effects of salt concentration on sensory quality of broad bean paste mash

由圖4可知，鹽度對甜瓣子的香氣、滋味、色澤和體態均有較大影響。12%鹽度的甜瓣子感官品質最佳，其醬酯香較濃郁，味鮮醇厚。15%鹽度的甜瓣子感官品質次之，口味偏咸，醬酯香和鮮味不及12%鹽度的甜瓣子，這與甜瓣子中氨基酸態氮含量有關（圖3B），延長發酵時間，甜瓣子感官品質能有所改善。6%和9%鹽度的甜瓣子整體感官品質最差，雖然其色澤較好，但是蠶豆瓣軟爛不成形，并且具有明顯的酸敗氣味，口感過酸，這與甜瓣子中蛋白質被過度分解（圖3B）、總酸含量過高有關（圖3A）。根據感官評價結果發現，總酸和氨基酸態氮含量是影響甜瓣子感官品質的關鍵因素，氨基酸態氮含量高有利于感官品質提升，總酸含量過高則導致感官品質下降。低鹽化有利于氨基酸態氮形成，縮短發酵時間，但同時也造成總酸含量過高，感官品質不佳。因此，甜瓣子發酵不能一味的追求低鹽化，需要選擇一個合適的鹽度才能發酵得到品質較佳的甜瓣子。

3 討論與結論

鹽度是影響甜瓣子發酵的關鍵因素之一，本研究結果表明，不同鹽度對甜瓣子發酵過程中微生物數量、菌群結構以及產品品質有著不同程度的影響。甜瓣子發酵過程中，鹽度越低，霉菌總數下降速度越快，主要是由于不同鹽度甜瓣子中物質成分差異導致的，甜瓣子中總酸含量隨發酵的進行不斷積累，且鹽度越低總酸含量越高（圖3A），酸度過高致使霉菌的生長受到抑制，這在同類型產品中也常有報道[19-20]。不同鹽度甜瓣子中細菌總數變化規律一致，先下降后緩慢增加，最后趨于平穩，但發酵前期低鹽甜瓣子（6%和9%）中細菌總數高于高鹽甜瓣子（12%和15%）。發酵前期，由于低鹽條件下滲透壓作用相對較弱，一些較為耐受的細菌能夠正常生長，因此低鹽條件下細菌數量更高，尤其是低鹽甜瓣子（6%和9%）中乳酸菌數量（圖1C）明顯高于高鹽甜瓣子（12%和15%）（未檢出），這可能是導致二者細菌總數差異的主要原因。

高通量測序結果顯示，不同鹽度對甜瓣子中真菌菌群結構影響較小，Aspergillus是不同鹽度甜瓣子發酵過程中絕對優勢真菌菌群，這是由于采用米曲霉純種制曲，導致甜瓣子發酵過程中真菌幾乎被Aspergillus所覆蓋。米曲霉能分泌蛋白酶、淀粉酶等多種酶，具有很強的蛋白質水解能力和淀粉糖化能力，因此被廣泛運用于傳統發酵食品生產中[21]。不同鹽度甜瓣子中細菌菌群結構存在顯著差異，低鹽甜瓣子（6%和9%）中優勢細菌菌群主要是Lactobacillus、Staphylococcus、Weissella，高鹽甜瓣子（12%和15%）中則主要是Staphylococcus、Tetragenococcus、Bacillus。細菌對鹽的耐受性不同，是導致不同鹽度條件下細菌菌群結構差異化的主要原因。Lactobacillus的耐鹽性能較差[17]，因此在低鹽甜瓣子（6%和9%）中相對豐度較高，而高鹽甜瓣子（12%和15%）中生長代謝受到抑制，它與發酵食品中乳酸、乙酸等有機酸形成密切相關[22]。Staphylococcus在鹽度越高的甜瓣子中相對豐度越高，有研究表明其對鹽具有高度的耐受性[23]，Staphylococcus是郫縣豆瓣中優勢菌屬[24-25]，可以為豆瓣醬帶來甜味而不是帶來酸味，被認為是豆瓣醬風味的一個重要貢獻者[26]。除6%鹽度以外，Bacillus在其余鹽度中都具有較高的相對豐度，研究表明，Bacillus也是甜瓣子中優勢菌屬之一，其具有極強的耐受性和產淀粉酶能力，對甜瓣子發酵進程和風味形成有著重要的作用[24,27]。Tetragenococcus具有較強的耐鹽性能[17]，因此廣泛存在于醬油、豆瓣醬等發酵食品中[24,28]，與發酵食品風味形成密切相關，有研究將其用于改善豆瓣醬風味[29]，而本研究中Tetragenococcus只在12%鹽度甜瓣子中含量豐富。此外，Weissella和Pseudomonas也是豆瓣醬中主要細菌菌群[30]，Weissella與發酵食品中有機酸和酯類等風味物質形成有關[31]，而Pseudomonas與甜瓣子中醛類化合物形成顯著相關[30]。由此可看出，甜瓣子發酵不僅僅是霉菌主導，細菌群落結構差異也是影響豆瓣甜瓣子品質的主要原因。

鹽度對甜瓣子中總酸、氨基酸態氮和還原糖等物質成分含量有顯著影響，鹽度越低，總酸和氨基酸態氮含量越高，而還原糖含量越低。甜瓣子中氨基酸態氮主要是由蛋白酶分解原料中蛋白質形成，而蛋白酶主要來自制曲階段，制曲的本質就是利用米曲霉等微生物在原料中生長繁殖，以獲取蛋白酶等多種生物酶[32]，因此發酵初期蛋白酶活性高，氨基酸態氮生成速度快。但是，有研究表明，蛋白酶活性隨著鹽含量的增加而顯著下降[21,33-34]，因此低鹽條件更有利于氨基酸態氮的形成。發酵食品中還原糖主要由淀粉酶水解淀粉產生，但會被發酵過程中微生物代謝所消耗。Su Nanwei等[34]研究發現，0%～18%的鹽度對淀粉酶活性影響較小，表明不同鹽度甜瓣子中還原糖含量差異主要由微生物代謝消耗差異導致。有研究表明，甜瓣子發酵過程中還原糖含量變化主要是由乳酸菌引起[24]。此外，傳統發酵食品中有機酸等酸類物質的形成也與乳酸菌密切相關[22,24]，低鹽甜瓣子（6%和9%）發酵初期乳酸菌生長代謝旺盛是導致其總酸含量過高的主要原因。但是，乳酸菌的生長代謝能力隨著鹽含量的增加而逐漸受到抑制[35-36]。因此，不同鹽度條件下乳酸菌在數量和代謝速率等方面的差異，是導致甜瓣子中還原糖含量和總酸含量差異的主要原因。低鹽甜瓣子（6%和9%）中乳酸菌含量豐富，生長代謝旺盛，導致還原糖被大量消耗并產生酸類物質；高鹽甜瓣子（12%和15%）中乳酸菌生長代謝活動受到抑制，還原糖在發酵過程中被大量積累。感官評價發現，12%鹽度的甜瓣子感官品質最佳，15%鹽度次之，6%和9%鹽度得分最低。低鹽條件有利于氨基酸態氮的形成，提高甜瓣子發酵速度，但鹽度過低，微生物代謝旺盛，發酵體系中酸度過大，蠶豆瓣被分解軟爛，不利于甜瓣子的感官品質。本研究結果顯示甜瓣子發酵不能一味追求低鹽化，鹽含量應控制在適宜范圍（≥12%）方可保證產品的風味和口感。