鳳香型酒醅微生物群落演替及其與理化指標的相關性分析

陳 雪，張永利，閆宗科，孟勤燕，齊 歡，李浩浩，賈智勇

（陜西西鳳酒股份有限公司，陜西 鳳翔 721406）

中國白酒可分為清香型、醬香型、濃香型、鳳香型等12 種香型[1]。鳳香型白酒以乙酸乙酯為主，己酸乙酯和高級醇為輔，具有醇香秀雅、諸味諧調的特點，鳳香型白酒的獨特性與其生產工藝和微生物群落息息相關。

自2005年以來，隨著科學的發展，以羅氏公司454測序技術、Illumina公司Solexa測序技術和ABI公司的Solid測序技術為代表的高通量測序技術相繼誕生，并廣泛應用于傳統發酵食品的微生物群落的宏基因組研究中[2]，包括食醋[3]、魚露[4]、牛奶[5]、酸肉[6]、米酒[7]、濃香[8]和清香白酒[9-10]等。在白酒領域利用高通量測序對釀酒微生物群落的研究也逐漸增加，已有研究[11-13]關于洋河濃香白酒發酵過程中微生物群落結構及其與有機酸合成的相關性，找到與有機酸合成相關的7 個菌屬，分別為乳桿菌屬（Lactobacillus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、酵母屬（Saccharomyces）、Naumovozyma、伊薩酵母屬（Issatchenkia）、嗜冷芽孢桿菌屬（Psychrobacillus）和根霉屬（Rhizopus）。黃蘊利等[14]研究了醬香型白酒第2輪次發酵過程中微生物多樣性，檢測堆積和窖池發酵中的細菌和真菌，酒醅中主要優勢菌屬為Lactobacillus、Saccharomyces、假絲酵母屬（Candida）、青霉菌屬（Penicillium）、鐮孢霉屬（Fusarium）。王雪山[15]分析不同環境清香類型白酒發酵微生物種群結構比較及溯源解析，采用高通量測序得到酒醅中主要的細菌種群包含Lactobacillus、芽孢桿菌屬（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、Kroppenstedtia、魏斯氏菌屬（Weissella）和不動桿菌屬（Acinetobacter），真菌種群主要包含畢赤酵母屬（Pichia）、Candida、Kazachstania、復膜孢酵母屬（Saccharomycopsis）、Saccharomyces、維克漢姆酵母屬（Wickerhamomyces）和曲霉屬（Aspergillus）。但鳳香型白酒釀造微生物群落的研究尚鮮有報道，對微生物結構的復雜性、多樣性以及動態變化情況等方面認識仍然不足。

本研究以鳳香型白酒發酵過程中酒醅為對象，通過高通量測序技術解析不同發酵時間的酒醅微生物群落組成，評價微生物群落多樣性與理化指標的相關性。以期為更好了解研究鳳香型白酒的釀造機理提供理論依據，對鳳香型白酒的提質發展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酒醅樣：西鳳酒903制酒車間，圓窖期間3月份的重點窖酒醅。分別按入池0、4、7、10、14、18、22 d和30 d（出窖）時間跟蹤取樣8 次，記為J0d、J4d…J30d。用取樣器依次取上層、中層和下層酒醅（每層取3 個區域的點樣混合，見圖1），將3 層的樣品進行混合，放于－20 ℃冰箱保存。

0.1 mol/L NaOH溶液、1%酚酞溶液、0.2%葡萄糖溶液、斐林氏甲液、斐林氏乙液、10 g/L次甲基藍指示劑美國Sigma公司。

圖1 取樣位點示意圖Fig. 1 Schematic of sampling sites

1.2 儀器與設備

DH-2000R高速臺式冷凍離心機 上海德洋意邦儀器有限公司；D-78224超聲水浴清洗儀 德國Elma公司；AB204-E分析天平 瑞士Mettler Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 酒醅理化指標的檢測

酸度、淀粉、還原糖測定：參照DB 34/T 2264—2014《固態發酵酒醅分析方法》；溫度測定：用測溫計測量取樣點附近的溫度。

1.3.2 酒醅微生物多樣性檢測

將酒醅樣品送北京奧維森基因科技有限公司，利用ITS2 MiSeq PE300平臺進行高通量測序分析。提取酒醅微生物總基因組后，分別對基因組的16S V3-V4區和ITS2（ITS3-ITS4）區擴增子測序分析。

2 結果與分析

2.1 酒醅發酵過程中微生物群落結構多樣性分析

2.1.1 真菌

2.1.1.1 真菌菌群測序數據統計

表1 酒醅真菌菌群測序數據統計分析Table 1 Statistical analysis of fungal community sequencing data of fermented grains

如表1所示，得到每個樣品所對應的分類序列條數（tag數），通過歸類操作，將每個樣品序列按照彼此的相似性分歸為許多可操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）。其中發酵30 d真菌的OTU數最高為58，所有樣品共有的真菌OTU數為27。發酵過程中酒醅樣本的Chao1指數在50.15～78.38之間，Shannon指數在1.80～3.26之間。發酵30 d的Shannon指數最高，達到3.26（Shannon指數越高，多樣性越高），說明出池酒醅的微生物多樣性遠高于發酵期酒醅。發酵過程中氧逐漸被消耗，產生酸和乙醇，對有些微生物起到抑制作用，所以發酵中期多樣性指數較低。所有樣本的覆蓋率（Coverage）在0.999 5～0.999 7之間，測序結果能完整反映西鳳酒酒醅真菌菌群組成信息。

2.1.1.2 發酵過程中真菌群落的演替規律

圖2 門水平下真菌群落結構組成分布Fig. 2 Distribution of fungal community structure at phylum level

如圖2所示，整個發酵過程中有子囊菌門（Ascomycota）、毛霉亞門（Mucoromycota），其中Ascomycota占絕對優勢。已有研究表明，Ascomycota不僅是鳳香型酒醅中優勢真菌種群，同樣也是醬香型白酒及食醋等多種發酵食品中的主要真菌種群。

圖3 屬水平下真菌群落結構分布Fig. 3 Distribution of fungal community structure at genus level

西鳳酒酒醅發酵過程中共檢測出33 個屬的真菌微生物，真菌群落屬水平的演替規律如圖3所示，其中主要存在11 個真菌類群：Naumovozyma、Rhizopus、熱子囊菌屬（Thermoascus）、Aspergillus、Candida、Pseudeurotium、Saccharomycopsis、Pichia和Saccharomyces、Kregervanrija、Penicillium。發酵過程中主要優勢菌為Rhizopus、Naumovozyma、Thermoascus、Candida、Pichia、Pseudeurotium和Saccharomyces。其中Naumovozyma占絕對優勢，相對豐度為8.77%～66.69%，發酵前期增殖迅速，成為優勢菌株，在11 d相對豐度達到峰值，發酵后期逐漸降低。Rhizopus相對豐度為0.39%～24.87%；Rhizopus、Aspergillus在發酵前期占據優勢地位，隨著氧氣的耗盡、溫度的升高呈下降趨勢，在18 d短暫回升，發酵后期再次下降至發酵結束。Saccharomyces相對豐度為0.24%～3.30%，發酵前期繁殖迅速，在動態穩定期成為第二優勢菌株，主要完成乙醇發酵；在發酵后期（22 d）急劇降低并保持在很低水平。Thermoascus相對豐度為0.27%～9.65%；從初始9.65%（0 d）下降至0.43%（11 d），后處于較低水平。Candida相對豐度為0.62%～4.57%，在發酵初始和發酵結束時相對豐度為3.5%～4.5%，發酵過程中較低。Pichia相對豐度為0.05%～6.18%，在發酵中后期波動增加。Pseudeurotium相對豐度為0.33%～6.75%，發酵中波動增加，增幅較小。

2.1.2 細菌

2.1.2.1 細菌菌群測序數據統計

表2 酒醅細菌菌群測序數據統計分析Table 2 Statistical analysis of bacterial community sequencing data of fermented grains

酒醅細菌菌群測序數據統計分析見表2，每個樣品所對應的分類序列條數（tag數）最終為25 415，發酵4 d的OTU數最高為314，所有樣品共有的OTU數為43。發酵過程中酒醅樣本的Chao1指數在88.37～345.58之間，Shannon指數在0.53～5.55之間，隨著發酵的進行，Shannon指數降低，說明發酵過程中低氧、低pH值以及高乙醇的不利條件，使得許多細菌受到抑制。所有樣本的Coverage在0.997 2～0.999 1之間，測序結果能完整反映西鳳酒酒醅細菌菌群組成信息。

2.1.2.2 酵過程中細菌群落的演替規律

如圖4所示，西鳳酒發酵酒醅中細菌分屬5 個門類，分別為厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）和Saccharibacteria。其中Firmicutes占絕對優勢。

圖5 屬水平下細菌群落結構分布Fig. 5 Distribution of bacterial community structure at genus level

西鳳酒發酵酒醅中共檢測出183 個屬的細菌微生物，如圖5所示，西鳳酒發酵酒醅中主要存在22 個細菌類群，分別為Lactobacillus、片球菌屬（Pediococcus）、Bacillus、Staphylococcus、Pseudomonas、Weissella、地桿菌屬（Pedobacter）、黃桿菌屬（Flavobacterium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）和醋酸桿菌屬（Acetobacter）等。入池酒醅的細菌群落以Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus、Staphylococcus、Weissella、Acetobacter等為主。

發酵過程中主要優勢菌為Lactobacillus、Weissella、Streptomyces、Pediococcus，其中Lactobacillus占絕對優勢，相對豐度為23.98%～98.9%，發酵前期逐漸增多占據絕對優勢，在發酵后期相對豐度保持在90%以上。Weissella相對豐度為0.13%～6.29%，從初始的6.29%下降至0.17%（11 d），后期保持在一個較低的水平。Streptomyces相對豐度為0.05%～5.53%，在發酵7 d升高隨后降低并在11 d后保持在0.9%以下。Pediococcus相對豐度為0.15%～13.82%，從初始的13.82%下降至0.75%（11 d），并在發酵后期保持在較低水平，這可能與發酵過程中環境因素的變化有關，隨著發酵進行窖池逐漸進入厭氧和高滲環境，不利于片球菌的生長繁殖。

綜合以上，西鳳酒酒醅真菌以Naumovozyma、Rhizopus、Thermoascus、Saccharomyces、Candida、Pichia、Pseudeurotium等為主；細菌以Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus、Weissella、Streptomyces等為主，其中Naumovozyma和Lactobacillus占絕對優勢。

Rhizopus產糖化酶和液化酶能力強，有產生脂肪酶和乙醇的能力，能快速催化有機酸和乙醇生成酯類物質[16]；Naumovozyma產生的乙醇可與乙酸、乳酸反應產生己酸和丁酸，在一定程度上抑制窖內發酵中乳酸及乙酸的合成[17]；Pichia產乙酸酯能力較強，多數產糖苷酶[18]。乳酸菌也是酸肉、香腸發酵中的優勢細菌[4,6]，具有生成乙酸、乳酸和其他風味物質的能力[19]；Weissella可促進乳桿菌生長；Streptomyces各個種都能利用葡萄糖，有較強的淀粉和蛋白質水解能力。

表3 鳳香型白酒與其他香型白酒微生物菌群高通量測序結果比較Table 3 Comparison of microbial communities in fermented grains of different Chinese liquors by next-generation sequencing

如表3所示，鳳香型酒醅中優勢真菌的組成及比例與其他香型均不同；細菌均多以Lactobacillus為主，但低豐度細菌在種類上也有差異。不同香型白酒采用不同的曲種和釀造工藝，均會導致發酵過程中微生物組成及演替的差異，最終蒸餾得到的酒中微量組分不同，影響酒的品質與風格。鳳香型白酒微生物群落結構有別于以上4 種香型，具有獨特性，是其白酒風格形成的重要因素之一。

2.2 酒醅發酵過程中理化指標分析

如圖6所示，發酵前期溫度緩慢上升，發酵12 d達到30 ℃，維持30 ℃以上8 d，后期溫度略微下降。發酵前期酒醅中淀粉濃度高，微生物繁殖快，短時間內生成大量發酵熱量，導致酒醅溫度升高；隨后糖化作用生成的還原糖量與窖池內酵母菌維持生長代謝所需還原糖量達到動態平衡，發酵作用基本停止，酒醅溫度在32 ℃保持5 d左右；后期的酯化階段細菌等微生物代謝產生較多的酶和酸，對前期生成的醇和酸起到催化酯化反應的作用，酒醅溫度緩慢下降。

圖6 發酵過程中酒醅理化指標的變化情況Fig. 6 Changes in physiochemical indexes in fermented grains during fermentation

鳳型酒醅的酸度前期緩慢上升，中后期上升迅速，說明霉菌、酵母菌及好氧細菌不是產酸的主體，厭氧及兼性厭氧細菌的大量增殖生成了多種有機酸，導致酒醅酸度迅速增加，適量的酸能增加白酒的后味，使酒體更加豐滿。因此，釀造過程的酸度必須控制在合適的范圍內。

酒醅中淀粉和還原糖含量的變化反映了發酵進度和完全度，對工藝操作具有一定的指導作用。發酵后淀粉含量約下降30%，前期下降顯著，中后期由于霉菌逐漸消亡，淀粉分解利用的速率明顯降低；發酵前后還原糖降低約90%，呈先升高后波動平衡的趨勢。發酵初期霉菌快速生長繁殖，淀粉質原料快速分解，而此時酵母菌消耗還原糖比較少，所以還原糖不斷積累。發酵中期酵母菌數量增多，發酵作用加快，還原糖被代謝旺盛的酵母菌快速消耗，含量迅速下降，直至發酵期結束。

2.3 理化指標和微生物群落的相關性分析

表4 酒醅樣品中理化指標與微生物多樣性的相關性Table 4 Correlation coefficents between physicochemical indicators and microbial diversity in fermented grain samples

利用SPSS軟件對酒醅樣品的理化指標（溫度、酸度、還原糖和淀粉）和酒醅微生物多樣性進行Pearson相關性分析，結果見表4。發酵溫度與細菌多樣性呈極顯著負相關，相關系數為－0.895（P＜0.01），淀粉含量與細菌多樣性呈極顯著正相關，相關系數為0.857（P＜0.01），還原糖與細菌多樣性呈極顯著正相關，相關系數為0.938（P＜0.01），理化指標與真菌多樣性之間相關性不顯著。

3 結 論

本研究利用高通量測序法檢測分析鳳香型白酒不同發酵時期的酒醅樣品的微生物組成，達到深度測序的效果，共檢測出216 個屬和一些未被歸類的微生物，其中細菌檢測出183 個屬，真菌檢測出33 個屬。發酵過程中真菌以Naumovozyma、Rhizopus、Thermoascus、Saccharomyces、Candida、Pichia、Pseudeurotium等為主；細菌以Lactobacillus、Bacillus、Pediococcus、Weissella、Streptomyces等為主，其中Naumovozyma和乳酸菌屬占絕對優勢。鳳香型白酒微生物群落結構具有獨特性，是其白酒風格形成的主要因素。發酵溫度與細菌多樣性呈極顯著負相關，淀粉含量和還原糖與細菌多樣性呈極顯著正相關，理化指標與真菌多樣性之間相關性不顯著。