UPLC-MS/MS研究36 個(gè)梨品種成熟果實(shí)中的特征性多酚和三萜酸類物質(zhì)

孫莉瓊，郝雯菁，唐曉清，王康才，張紹鈴

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095）

梨為薔薇科梨屬植物（Pyrusspp.），果實(shí)大多可食用，而且還具有抗氧化、抗炎、潤(rùn)肺止咳、通便秘、利消化、降血糖、降血脂、醒酒、預(yù)防胃黏膜病變等功效[1-3]，是廣大人民最受歡迎的藥食兩用水果之一。李時(shí)珍《本草綱目》中有記載：“梨品甚多，俱為上品，可治百病。潤(rùn)肺涼心，消痰降火，解瘡毒酒毒”。自古以來(lái)，更有“冰糖雪梨”、“雪梨枇杷湯”、“鮮梨貝母湯”等經(jīng)典民間驗(yàn)方流傳至今。特別是隨著近年來(lái)人們對(duì)綠色健康食品的熱衷和科技現(xiàn)代化進(jìn)程加快，許多含梨中成藥及保健產(chǎn)品被陸續(xù)開發(fā)上市，如“止咳梨漿”、“秋梨潤(rùn)肺膏”、“梨汁潤(rùn)肺茶”、“雪梨膏”、“梨膏糖”等，有的甚至被作為地方經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)大力發(fā)展[4-5]。然而，目前已上市的梨相關(guān)功能性產(chǎn)品中除了極少數(shù)對(duì)配方用梨的品種有明確規(guī)定，大多數(shù)還存在品種混用現(xiàn)象，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的全面控制。我國(guó)為梨種植大國(guó)，種質(zhì)資源相當(dāng)豐富，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)有3 000多種，不同品種資源梨化學(xué)成分和生物功效的遺傳差異性尚缺乏系統(tǒng)研究，許多品種難以得到充分地利用。

植物多酚被稱作人類健康的“第七營(yíng)養(yǎng)素”，作為許多可食用植物生化和藥理作用的主要貢獻(xiàn)成分，具有抗癌、降糖、抗病毒、抗炎、治療心血管疾病和阿茨海默癥等多種有益于人體的生物活性[6-9]。人體自身不能合成多酚類化合物，因此需要通過(guò)外源性攝取，如蘋果、梨、葡萄等水果，西紅柿、茄子、黃瓜等蔬菜，玉米、大麥、豌豆等谷物，金銀花、芍藥、菊花等中草藥以及各種相關(guān)加工品中均含有豐富的多酚化合物[10]。三萜酸類化合物也是一種廣泛分布于植物中的重要次生代謝產(chǎn)物，具有很高的藥用與經(jīng)濟(jì)價(jià)值，在芒果、大棗、葡萄等水果，卷心菜、青椒、魔芋等蔬菜，以及桑白皮、西洋參、蘆薈等藥用植物中均含有大量三萜酸成分[11]，具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤、降血糖以及保護(hù)心腦血管等功效[12-14]。特別是以熊果酸和齊墩果酸等三萜酸為主要活性物質(zhì)的枇杷葉更是臨床上用于呼吸道炎癥疾病的代表中藥之一[15-16]。本實(shí)驗(yàn)室前期從多個(gè)梨品種的幼果中鑒定出102 個(gè)多酚（包括28 個(gè)酚酸類化合物，16 個(gè)酚苷類化合物，33 個(gè)黃酮類化合物，25 個(gè)黃烷-3-醇類化合物）和16 個(gè)三萜酸類物質(zhì)[17]，果實(shí)成熟后，這些物質(zhì)的含量變化、小分子活性物質(zhì)是否存在品種特異性以及梨屬果實(shí)中的特征性成分都還有待進(jìn)一步研究。

因此，本研究以梨果實(shí)中的兩大類化學(xué)活性成分——多酚和三萜酸為研究目標(biāo)，根據(jù)近年來(lái)國(guó)內(nèi)梨的種植和流通行情，從五大梨栽培品種（白梨、砂梨、秋子梨、西洋梨和新疆梨）和種間雜交選育品種中選擇36 個(gè)代表性品種為試材，對(duì)梨成熟果實(shí)中的特征性生物活性物質(zhì)展開系統(tǒng)研究，以期能夠?yàn)槔婀麑?shí)后期各種功能性產(chǎn)品的加工選種提供一定參考，對(duì)于進(jìn)一步挖掘利用梨種質(zhì)資源，指導(dǎo)品種的培育與優(yōu)選，規(guī)范相關(guān)功能產(chǎn)品的定向開發(fā)具有現(xiàn)實(shí)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

36 個(gè)梨品種果實(shí)均為果園或種質(zhì)基地直接采摘，詳細(xì)信息見表1，每個(gè)品種選擇3～6 棵長(zhǎng)勢(shì)良好的果樹，待果實(shí)成熟期采摘，去除長(zhǎng)相不良者。果實(shí)及時(shí)去皮去核，取果肉于液氮中切片，研磨粉碎，－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 梨試材果實(shí)樣品信息Table 1 Information about ten pear varieties used in this study

續(xù)表1

對(duì)照品綠原酸、熊果苷、兒茶素、表兒茶素、新綠原酸、隱綠原酸、蘆丁、齊墩果酸、熊果酸、咖啡酸和奎尼酸（純度均大于98%） 中國(guó)食品藥品檢定研究所；木犀草苷、山柰酚-3-O-蕓香糖苷、異鼠李素3-O-蕓香糖苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C、金絲桃苷（純度均大于98%） 北京索萊寶科技有限公司；樺木酸、坡模酸、山楂酸、科羅索酸（純度均大于98%）武漢生物化學(xué)公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國(guó)Merck公司；甲酸、醋酸銨（均為色譜純） 美國(guó)Aladdin公司；超純水由美國(guó)Millipore公司儀器制備；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼、Trolox（均為分析純）美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-20AT超高效液相色譜系統(tǒng)（包括高壓二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、脫氣機(jī)、二極管陣列檢測(cè)器） 日本Shimadzu公司；AB Sciex Q TRAP 4000型三重四極桿線性離子阱雜交質(zhì)譜儀（配備電噴霧離子源）、Analyst 1.6.3數(shù)據(jù)工作站 美國(guó)AB Sciex公司；AE-240十萬(wàn)分之一天平 美國(guó)梅特勒-托利多儀器有限公司；KH-400KDB高頻率數(shù)控超聲儀 昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司；UPLC HSS T3 C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 美國(guó)Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品溶液制備

梨果實(shí)供試品溶液的制備主要參考Sun Liqiong等[17]方法，略有改變，即精密稱取－80 ℃保存的樣品粉末2.0 g，加入25 mL的提取溶劑甲醇-水（80∶20，V/V），稱質(zhì)量，渦旋混合30 s，100 Hz超聲提取30 min，每5 min攪拌1 次，每次30 s，取出，室溫放置10 min，提取溶劑補(bǔ)足失質(zhì)量，取上清液，12 000 r/min離心15 min，即得供試樣品溶液。

精密稱取各對(duì)照品適量置于5 mL容量瓶中，加甲醇溶液溶解制成對(duì)照品儲(chǔ)備液。取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加甲醇溶液定容至10 mL制成混合對(duì)照品溶液，并逐級(jí)稀釋，得到一系列不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，12 000 r/min離心15 min，取上清液，備用。

1.3.2 超高效液相色譜測(cè)定條件

多酚類化合物：流動(dòng)相A為乙腈，B為水（含0.1%甲酸），進(jìn)行梯度洗脫：0～3 min，1%～15% A，99%～85% B；3～11 min，15%～40% A，85%～60% B；11～13 min，40% A，60% B；13～13.1 min，40%～1% A，60%～99% B；13.1～15 min，1% A，99% B。流速0.4 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積1 μL。

三萜酸類化合物：流動(dòng)相為甲醇-水-醋酸銨（81∶19∶0.1，V/V）等度洗脫10 min，流速0.4 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積1 μL。

1.3.3 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定條件

采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式對(duì)梨果中的多酚與三萜酸類化學(xué)成分進(jìn)行定量分析。離子源為電噴霧離子源，檢測(cè)方式為負(fù)離子檢測(cè)，噴霧電壓－4 500 V，霧化氣溫度500 ℃，氣簾氣30 psi，霧化氣和輔助氣為50 psi，對(duì)照品的其他掃描參數(shù)參照Sun Liqiong等[17]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

所有樣品含量測(cè)定數(shù)據(jù)均為3 次平行測(cè)定后的平均值，以果實(shí)鮮質(zhì)量（μg/g或μg/100 g）表示。以標(biāo)準(zhǔn)化的主要成分含量為變量，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件分別進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘-判別分析（partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA），研究不同品種樣品間的整體差異性。

2 結(jié)果與分析

盡管前期已有不少文獻(xiàn)對(duì)成熟梨中的化學(xué)成分及含量有一定研究[18-19]，但研究的成分較少，且大多采用的是高效液相色譜-紫外檢測(cè)方法，對(duì)待測(cè)成分色譜峰的分離要求較高，測(cè)定時(shí)間較長(zhǎng)，而且檢測(cè)靈敏度較差，特別是當(dāng)提取物成分特別復(fù)雜時(shí)，難以排除極性類似、保留時(shí)間相近的化學(xué)成分干擾。另外，高效液相色譜-紫外檢測(cè)對(duì)于紫外吸收很弱，且含量較低的三萜類物質(zhì)往往難以測(cè)定。而本研究采用UPLC-MS/MS結(jié)合多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，不僅克服了上述局限，保證了測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，還可以在短時(shí)間內(nèi)得到大量的化學(xué)成分含量數(shù)據(jù)，對(duì)于紫外吸收較差的成分，如三萜酸等也有明顯優(yōu)勢(shì)。通過(guò)對(duì)不同品種梨成熟果實(shí)中多酚和三萜酸類物質(zhì)的含量測(cè)定分析，發(fā)現(xiàn)隨著果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育，體積膨大，所檢出的化合物含量和數(shù)量均有較大變化，且來(lái)源不同品種，特別是來(lái)源于不同系統(tǒng)的樣品中物質(zhì)種類和含量差異顯著。

2.1 酚酸類化合物

酚酸是一類在梨和其他水果中普遍存在的代表性多酚類化合物。本實(shí)驗(yàn)在梨成熟果實(shí)中檢測(cè)出29 種酚酸類化合物（編號(hào)為PA1～29），與幼果一致，成熟果中的多酚類物質(zhì)主要來(lái)源于酚酸化合物[17]。如圖1所示，對(duì)于不同品種系統(tǒng)的梨，秋子梨系統(tǒng)果實(shí)中總酚酸含量相對(duì)較高，特別是香水梨、南果梨和紅南果總酚酸含量分別高達(dá)379.3、360.6、249.1 μg/g。此外，新疆梨系統(tǒng)的酸梨中酚酸物質(zhì)含量為384.9 μg/g，也顯著高于白梨、砂梨、西洋梨、雜交梨和其他新疆梨品種。在所檢測(cè)的29 個(gè)酚酸化合物中，以奎尼酸（PA1）和綠原酸（PA6）含量較高，平均含量分別約占總酚酸的46.5%和47.2%，但兩者在梨果中的含量均有較大的品種差異性。其中，奎尼酸在新疆梨系統(tǒng)的酸梨中含量最高，為176.0 μg/g，而在紅茄梨樣品中普遍含量較低，特別是在Tosca和紅茄梨中僅約7.0 μg/g。綠原酸在秋子梨系統(tǒng)的香水梨和南果梨中含量最高，分別為249.7 μg/g和243.4 μg/g，但在大冬果、黃金梨、翠玉和黃酸梨樣品中卻未有檢出。對(duì)所有樣品中的酚酸化合物種類進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，奎尼酸（PA1）、肉桂酸異構(gòu)體（PA2）、咖啡酰基色氨酸（PA3）、隱綠原酸（PA4）、綠原酸（PA6）、新綠原酸（PA7）、對(duì)香豆酰基奎尼酰基蘋果酸酯（PA8）、1-O-咖啡酰基奎尼酸（PA9）、4-對(duì)香豆酰基奎尼酸（PA11）、羥基肉桂酸（PA17）、5-O-咖啡酰基奎尼酸甲酯（PA22）、異綠原酸A（PA25）和異綠原酸C（PA27）在大部分梨樣品中普遍存在，可作為梨屬果實(shí)的特征性酚酸成分。

圖1 梨果實(shí)中的酚酸類化合物含量Fig. 1 Contents of 29 phenolic acids in pear fruits

圖2 梨果實(shí)中的酚苷類化合物含量Fig. 2 Contents of 16 phenolic glycosides in pear fruits

成熟期的果實(shí)與幼果相比，大部分化合物的含量均顯著降低數(shù)十倍，甚至上百倍，該變化規(guī)律與前期報(bào)道一致[20-21]，其中奎尼酸含量的下降指數(shù)顯著高于綠原酸[17]。比如，秋子梨品種南果梨中的奎尼酸含量從幼果時(shí)期的10 500.5 μg/g降低到成熟時(shí)期的102.9 μg/g，綠原酸含量則從4 139.0 μg/g降低到243.4 μg/g，分別約下降102 倍和17 倍；白梨品種碭山酥梨中的奎尼酸含量從幼果時(shí)期的8 798.1 μg/g降低到成熟期的119.5 μg/g，綠原酸含量則從3 988.5 μg/g降低到74.4 μg/g，分別約下降74 倍和54 倍；新疆梨品種庫(kù)爾勒香梨中的奎尼酸含量從幼果時(shí)期的6 725.8 μg/g降低到成熟期的43.3 μg/g，綠原酸含量則從1 207.7 μg/g降低到9.7 μg/g，分別約下降155 倍和124 倍；在西洋梨品種紅茄梨中的奎尼酸含量從幼果時(shí)期的4 991.7 μg/g降低到成熟期的7.1 μg/g，綠原酸含量則從2 564.1 μg/g降低到70.6 μg/g，分別約下降703 倍和36 倍；在砂梨品種豐水梨中的奎尼酸含量從幼果時(shí)期的8 892.3 μg/g降低到成熟期的53.2 μg/g，綠原酸含量則從1 162.7 μg/g降低到8.8 μg/g，分別約下降167 倍和132 倍。苯丙烷代謝途徑是植物中酚酸類次生代謝產(chǎn)物生物合成的主要途徑。He Jingang等[21]以綠原酸為研究對(duì)象，采用雪花梨為試材，研究綠原酸及苯丙烷代謝途徑中關(guān)鍵生物酶編碼基因在果實(shí)生長(zhǎng)發(fā)育全過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)隨著果實(shí)的不斷生長(zhǎng)，這些相關(guān)編碼基因的表達(dá)水平在果實(shí)細(xì)胞分裂期顯著降低，至果實(shí)成熟階段，均維持在極低表達(dá)水平。因此，成熟梨果中酚酸類化合物含量的降低與其生物代謝途徑相關(guān)合成酶的低表達(dá)有著密切的關(guān)系。

2.2 酚苷類化合物

與前人報(bào)道一致，梨果中酚苷類化合物種類較少，其中熊果苷是最主要的酚苷類化合物[1,18]。熊果苷作為一種黑色素的天然抑制劑，被廣泛用于高級(jí)增白化妝品的制作。研究發(fā)現(xiàn)梨是一種很好的熊果苷提取資源，其不僅在果皮、果肉中大量存在，在每年修剪丟棄的梨樹枝中也含量豐富[22]。本實(shí)驗(yàn)在梨成熟果實(shí)中檢測(cè)出16 種酚苷類化合物（編號(hào)PG1～16），如圖2所示。與酚酸類化合物規(guī)律相似，對(duì)于不同品種系統(tǒng)樣品，秋子梨系統(tǒng)果實(shí)中總酚苷含量整體相對(duì)較高，特別是香水梨、南果梨和紅南果總酚酸含量分別高達(dá)188.6、241.6 μg/g和179.4 μg/g。而西洋梨系統(tǒng)果實(shí)中總酚苷含量普遍較低，均低于20 μg/g，特別是在Tosca中總酚苷僅含7.2 μg/g。該結(jié)果再次表明酚酸與酚苷在梨果中的生物合成途徑存在著一定的相關(guān)性。熊果苷（PG1）占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，平均含量占總酚苷的94.4%，因此其品種特異規(guī)律與總酚苷基本一致，且亦與幼果期果實(shí)的品種特異規(guī)律一致。對(duì)所有樣品中的酚苷化合物種類進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，熊果苷（PG1）、二氫咖啡酰基六糖苷I（PG2）、羥基苯丙酸六糖苷（PG3）、丁香酰基六糖苷I（PG4）、二氫咖啡酰基六糖苷II（PG5）、咖啡酰基六糖苷I（PG6）、長(zhǎng)壽花糖苷（PG7）和香酰基六糖苷III（PG11）在大部分梨樣品中普遍存在，可作為梨屬果實(shí)的特征性酚苷成分。

圖3 梨果實(shí)中的黃酮苷類化合物含量Fig. 3 Contents of 33 flavonoid glycosides in pear fruits

與幼果時(shí)期相比，梨果實(shí)成熟后，大部分酚苷化合物的含量均顯著降低數(shù)十倍，甚至數(shù)百倍。比如，熊果苷在秋子梨品種南果梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的5 899.1 μg/g降低到241.6 μg/g，約24 倍；在白梨品種碭山酥梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的3 925.2 μg/g降低到15.5 μg/g，約253 倍；在新疆梨品種庫(kù)爾勒香梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的3 007.4 μg/g降低到8.0 μg/g，約375 倍；在西洋梨品種紅茄梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的3 511.6 μg/g降低到10.0 μg/g，約351 倍；在砂梨品種豐水梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的4 945.5 μg/g降低到9.5 μg/g，約520 倍。Cho等[20]以7 個(gè)砂梨栽培品種為試材，采用高效液相色譜-紫外檢測(cè)法考察了熊果苷在果實(shí)發(fā)育周期的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在盛花期20 d梨幼果中熊果苷含量約465.3～983.8 mg/100 g，而在成熟后果實(shí)中含量約36.2～6.3 mg/100 g，整體變化趨勢(shì)與本實(shí)驗(yàn)一致。但Cho等[20]所測(cè)定的熊果苷平均鮮果含量比本實(shí)驗(yàn)所測(cè)定數(shù)據(jù)略高，這不僅可能是由于具體的檢測(cè)品種樣品不同，還有可能是由于前者的實(shí)驗(yàn)對(duì)象是全果，而本實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的是可食用的果肉部位。

2.3 黃酮類化合物

黃酮類化合物常常在梨的果皮部位被檢出，而果肉中由于含量很低，往往難以檢出[23-25]，而本實(shí)驗(yàn)所建立的方法在梨果中檢測(cè)出33 種黃酮類化合物（編號(hào)FG1～33），表明本方法靈敏度較高。盡管其含量遠(yuǎn)低于酚酸和酚苷類化合物，但種類相當(dāng)豐富，且不同品種間差異較大，即使是來(lái)源于同一系統(tǒng)，樣品間的共性特征仍然較小。如圖3所示，黃酮類物質(zhì)生物合成途徑關(guān)鍵作用酶在不同品種梨中遺傳特性有很大差異。在白梨系統(tǒng)樣品中，特征性化合物較少，僅異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（FG19）和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24）2 種在所有樣品中共存，總黃酮含量以鄭州鵝梨最高，為119.7 μg/100 g，主要成分包括異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（FG19）、槲皮素乙酰化葡萄糖苷（FG21）、異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24）、異鼠李素乙酰化阿拉伯糖苷（F30），而其余白梨品種總黃酮含量普遍在30～40 μg/100 g之間，無(wú)顯著差異。在砂梨系統(tǒng)中，樣品間種類和含量差異很大，未檢出共性成分，大部分樣品中共性含有的化合物為蘆丁（FG7）、金絲桃苷（FG8）、槲皮素乙酰化阿拉伯糖苷（FG16）和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24），各樣品以黃金梨總黃酮含量顯著高于其他品種，為161.0 μg/100 g，山柰酚-3-O-蕓香糖苷（FG15）為其黃酮優(yōu)勢(shì)化合物，而幸水總含量?jī)H約3.2 μg/100 g，與黃金梨相差近50 倍。在西洋梨系統(tǒng)樣品中，特征性化合物主要包括金絲桃苷（FG8）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（FG10）、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（FG19）和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24），該研究結(jié)果與Brahem等[23]的報(bào)道基本一致。其中，總黃酮含量以紅蓓蕾砂樣品最高，為127.1 μg/100 g，異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24）為其優(yōu)勢(shì)化合物，Tosca最低為37.2 μg/100 g，其余樣品約在50～75 μg/100 g之間，無(wú)顯著差異。在新疆梨系統(tǒng)樣品中，異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（FG19）為特征性成分，同時(shí)蘆丁（FG7）和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24）在大部分樣品中也有著較高含量，總黃酮含量以新梨七號(hào)和新疆酸梨樣品較高，分別為151.0 μg/100 g和109.2 μg/100 g，庫(kù)爾勒香梨樣品最低為23.8 μg/100 g，其余樣品約在55～70 μg/100 g之間，無(wú)顯著差異。在秋子梨系統(tǒng)樣品中，槲皮素-3-O-葡萄糖苷（FG10）、異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（FG19）和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24）為特征性成分，其中以槲皮素-3-O-葡萄糖苷和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷的含量普遍較高，特別是在香水梨中，同時(shí)蘆丁（FG7）和異鼠李素乙酰化葡萄糖苷（FG31）在大部分樣品中也普遍存在，總黃酮含量在香水梨中最高，為128.9 μg/100 g，其余樣品約在63～77 μg/100 g之間，無(wú)顯著差異。在雜交梨品種中，盡管不同樣品來(lái)源父本和母本差異較大，但異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（FG19）和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24）在所有樣品中共性存在，且含量較高，同時(shí)蘆丁（FG10）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷（FG10）、槲皮素乙酰化阿拉伯糖苷（FG16）和山柰酚-3-O-蕓香糖苷（FG15）也在大部分樣品中有較高含量，總黃酮含量在桔蜜中最高，為150.3 μg/100 g，其中山柰酚-3-O-蕓香糖苷（FG15）為其優(yōu)勢(shì)黃酮化合物，其余樣品總含量較低，均在20～40之間，無(wú)顯著差異。綜合分析，異鼠李素-3-O-蕓香糖苷（FG19）和異鼠李素-3-O-葡萄糖苷（FG24）在梨樣品中普遍存在，且均有較高含量，同時(shí)蘆丁（FG7）、槲皮素乙酰化阿拉伯糖苷（FG16）和異鼠李素乙酰化葡萄糖苷（FG31）在大部分梨樣品中也均有檢出，這些化合物可以作為梨屬果實(shí)的代表性黃酮成分。

圖4 梨果實(shí)中的黃烷-3-醇和原花青素類化合物含量Fig. 4 Contents of 25 flavan-3-ols and procyanidins in pear fruits

圖5 梨果實(shí)中的三萜酸類化合物含量Fig. 5 Contents of16 triterpenoids in pear fruits

與幼果時(shí)期相比，梨果實(shí)在成熟過(guò)程中，黃酮化合物含量降低程度比酚酸和酚苷更為顯著。比如，總黃酮在秋子梨品種南果梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的259.0 μg/g降低到76.6 μg/100 g，約338 倍；在白梨品種碭山酥梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的380.9 μg/g降低到39.6 μg/100 g，約962 倍；在新疆梨品種庫(kù)爾勒香梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的266.9 μg/g降低到23.8 μg/100 g，約1 121 倍；在西洋梨品種紅茄梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的478.1 μg/g降低到49.5 μg/100 g，約966 倍；在砂梨品種豐水梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的147.3 μg/g降低到39.5 μg/100 g，約373 倍。Cho等[20]通過(guò)紫外分光光度法觀察總黃酮含量在砂梨果實(shí)發(fā)育周期的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)在盛花期前50 d內(nèi)，即果實(shí)細(xì)胞分裂期，總黃酮含量呈直線式顯著降低，至果實(shí)發(fā)育后期，下降趨勢(shì)逐漸平緩。

2.4 黃烷-3-醇和原花青素類化合物

黃烷-3-醇類化合物主要以表兒茶素、兒茶素以及二者聚合形成的原花青素為代表，在梨果中普遍存在，特別是在西洋梨中報(bào)道較多，而且主要存在于梨皮部位[25-26]。本實(shí)驗(yàn)在梨成熟果實(shí)中檢測(cè)出25 種黃烷-3-醇和原花青素類化合物（編號(hào)FA1～25），但其平均總含量顯著低于酚酸和酚苷類化合物，如圖4所示。其中，以西洋梨系統(tǒng)中紅茄梨、三季梨以及早金香梨樣品的總黃烷-3-醇含量較高，分別為26.3、17.5 μg/g和12.5 μg/g，其次白梨系統(tǒng)的六月酥、新疆梨系統(tǒng)的康樂(lè)酥木梨、秋子梨系統(tǒng)的南果梨和黃香水、雜交系統(tǒng)的華酥樣品中也含有較高含量的總黃烷-3-醇，分別為14.2、15.0、14.3、15.4 μg/g和13.9 μg/g。而在檢測(cè)的所有砂梨樣品中黃烷-3-醇類化合物含量均較低，總含量低于1.7 μg/g。在所檢測(cè)的25 個(gè)黃烷-3-醇類化合物中，以表兒茶素（FA8）和B型原花青素二聚體II（FA5）含量較高，平均含量分別約占總黃烷-3-醇類的44.7%和23.6%。對(duì)所有樣品中的黃烷-3-醇和原花青素類化合物進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，兒茶素（FA3）、B型原花青素二聚體II（FA5）、表兒茶素（FA8）、B型原花青素三聚體III（FA12）和B型原花青素四聚體（FA15）在大部分梨樣品中普遍存在，可作為梨屬果實(shí)的特征性黃烷-3-醇和原花青素類成分。

與幼果時(shí)期相比，梨果實(shí)在成熟過(guò)程中，黃烷-3-醇化合物含量隨著果肉的增長(zhǎng)膨大亦顯著降低，但下降指數(shù)明顯低于黃酮類化合物，約十倍至百倍。總黃烷-3-醇在秋子梨品種南果梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的186.3 μg/g降低到14.3 μg/g，約13 倍；在白梨品種碭山酥梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的63.5 μg/g降低到0.5 μg/g，約127 倍；在新疆梨品種庫(kù)爾勒香梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的52.3 μg/g降低到0.2 μg/g，約261 倍；在西洋梨品種紅茄梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的711.7 μg/g降低到26.3 μg/g，約27 倍；在砂梨品種豐水梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的163.8 μg/g降低到1.0 μg/g，約164 倍。

2.5 三萜酸類化合物

梨成熟果中含有豐富的三萜酸類物質(zhì)（TA），盡管其含量不及酚酸和酚苷類化合物，但由于具有優(yōu)越的抗腫瘤、抗炎等藥效活性，在許多功能性果蔬中也廣泛受到關(guān)注。如圖5所示，梨果中檢測(cè)出16 種三萜酸類化合物（編號(hào)TA1～16），除經(jīng)常報(bào)道的白樺酸脂（TA14）、齊墩果酸（TA15）和熊果酸（TA16）外[1,27]，主要成分還包括委陵菜酸（TA2）、anmurcoic acid（TA3）、山楂酸（TA10）和科羅索酸（TA11）。不同品種樣品進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)三萜酸類物質(zhì)在不同品種梨果實(shí)中含量區(qū)間跨度很大，在所檢測(cè)的36 份樣品中，黃香水梨的總?cè)扑岷孔罡撸s680.6 μg/100 g，而在西洋梨品種早金香和Tosca中含量最低，分別為5.1 μg/100 g和5.6 μg/100 g，相差120多倍。來(lái)源于西洋梨、砂梨、新疆梨和雜交品種的樣品中，各三萜酸化合物含量普遍較低。對(duì)所有樣品中的三萜酸類化合物進(jìn)行綜合分析發(fā)現(xiàn)，薔薇酸（TA1）、委陵菜酸（TA2）、anmurcoic acid（TA3）、坡模酸異構(gòu)體（TA4）、麥珠子酸（TA9）、山楂酸（TA10）、科羅索酸（TA11）、白樺酸脂（TA14）、齊墩果酸（TA15）和熊果酸（TA16）在大部分梨樣品中普遍存在，可作為梨屬果實(shí)的特征性三萜類成分。

與幼果時(shí)期相比，成熟后梨果實(shí)中的三萜酸化合物含量降低約百倍至數(shù)千倍。總?cè)扑嵩谇镒永嫫贩N南果梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的274.6 μg/g降低到178.1 μg/100 g，約154 倍；在白梨品種碭山酥梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的305.7 μg/g降低到22.8 μg/100 g，約1 300 倍；在新疆梨品種庫(kù)爾勒香梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的227.5 μg/g降低到15.7 μg/100 g，約1 449 倍；在西洋梨品種紅茄梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的193.0 μg/g降低到8.7 μg/100 g，約2 218 倍；在砂梨品種豐水梨成熟果中的含量從幼果時(shí)期的297.4 μg/g降低到6.5 μg/100 g，約4 575 倍。

2.6 PCA和PLS-DA

將梨果實(shí)中的酚酸、酚苷、黃酮、黃烷3-醇和三萜酸化合物的含量標(biāo)準(zhǔn)化后，導(dǎo)入SIMCA-P軟件中，分別進(jìn)行無(wú)監(jiān)督模式識(shí)別的PCA和有監(jiān)督督模式識(shí)別的PLSDA[28]。如圖6所示，大部分來(lái)源于相同品種系統(tǒng)的梨樣品，如砂梨和西洋梨，在PCA和PLS-DA得分圖上整體分布較近，沒(méi)有明顯分界，表明差異相對(duì)較小。但是在PLSDA得分圖上，白梨系統(tǒng)的碩豐和六月酥（編號(hào)4和6）以及新疆梨系統(tǒng)的新疆酸梨（編號(hào)23）與其他樣品差異較大，表明品種特異性較強(qiáng)。其中，碩豐和六月酥的三萜酸，如科羅索酸、熊果酸、山楂酸和委陵菜酸等，含量較高，而且六月酥中還含有較高的表兒茶素和原花青素二聚體。新疆酸梨中綠原酸和奎尼酸含量也遠(yuǎn)高于其他新疆梨樣品。另外，大部分秋子梨品種樣品與其他品種差異較大，可以明顯分開，如南果梨、香水梨、伏香和黃香水（編號(hào)27、28、29和31）。這可能是由于秋子梨中的酚酸、酚苷和三萜酸等含量普遍較高。而且秋子梨系統(tǒng)內(nèi)部不同品種樣品的PCA和PLS-DA得分圖分布也相對(duì)分散，特別是南果梨的芽變品種紅南果（編號(hào)30）與南果梨（編號(hào)27）樣品在得分圖上分布較遠(yuǎn)，兩者差異明顯，表明該系統(tǒng)樣品具有較強(qiáng)的品種特異性。

圖636 個(gè)梨品種果實(shí)的PCA（a）和PLS-DA（b）結(jié)果Fig. 6 Score plots of PCA (a) and PLS-DA (b) for pear fruits of 36 cultivars

3 結(jié) 論

我國(guó)梨品種資源豐富，多年來(lái)在抗氧化、抗炎、抗?jié)兊确矫娑加兄鴱V泛的臨床應(yīng)用，使其在保健品及藥品方面的開發(fā)前景廣闊。本研究采用UPLC-MS/MS的多離子反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式，從五大傳統(tǒng)梨系統(tǒng)和雜交梨品種中，選擇36 種常見品種為試材，對(duì)成熟梨果實(shí)展開靶向性代謝組學(xué)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成熟梨果實(shí)中含有豐富的多酚和三萜酸類物質(zhì)。PCA和PLS-DA表明，雖然不同樣品所含的化合物種類和含量都存在一定的差異，但是許多品種間的整體差異分界并不明顯。除此之外，秋子梨系統(tǒng)的樣品品種特異性較強(qiáng)，與其他品種樣品普遍差異較大。將幼果期和成熟期的樣品進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，在成熟過(guò)程中，梨果中的許多多酚和三萜小分子活性化合物含量顯著降低數(shù)十倍甚至上千倍，其中以南果梨為代表的秋子梨品種果實(shí)含量降低指數(shù)顯著小于其他品種。再進(jìn)一步通過(guò)對(duì)所有樣品中化合物種類展開系統(tǒng)分析，有40 個(gè)化合物，包括12 個(gè)酚酸、8 個(gè)酚苷、5 個(gè)黃酮苷、5 個(gè)黃烷-3-醇以及10 個(gè)三萜酸，在大部分測(cè)定梨品種中普遍存在，這些物質(zhì)可以初步確定為評(píng)價(jià)梨屬果實(shí)的特征性多酚和三萜酸類物質(zhì)。該研究結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步完善梨果實(shí)的質(zhì)量評(píng)價(jià)體系具有重要意義，同時(shí)也可為規(guī)范化梨后期產(chǎn)業(yè)鏈功能性產(chǎn)品的選種加工提供一定的參考。