蕎麥蜜中揮發性成分測定及其與成熟度的相關性分析

王桃紅，張少博，張會敏，趙光躍，李學民，魏玉海，崔宗巖,

（1.秦皇島海關技術中心，河北 秦皇島 066004；2.西寧海關技術中心，青海 西寧 810001）

蜂蜜是蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物混合后，經充分釀造而成的天然甜味物質[1]。蜂蜜具有較高的營養價值，是人們日常消費的主要食品之一。蕎麥蜜以蕎麥為蜜源植物，含有較多的礦質元素[2]和酚類物質[3]等成分，具有抗菌[4]和抗氧化活性[5]，對治療結腸炎和調節胃腸道功能有一定的效果[2]。蜂蜜風味是衡量蜂蜜品質的重要指標，主要與揮發性成分有關。揮發性物質除與蜂蜜種類[6]、釀造蜂種[7]有關外，還會受到加工工藝[8]、貯存條件和蜂蜜品質的影響，已有研究發現蜂蜜發酵會使揮發性成分發生變化[9-10]。目前國內外對蕎麥蜜揮發性成分的研究較少。孫雨安等[11]測定了洋槐、荊條、棗花、椴樹、蕎麥等蜂蜜中揮發性成分，指出蕎麥蜜中順式-9-二十三烯含量遠高于棗花蜜。Pasini等[12]利用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜（headspace solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GC-MS）技術在蕎麥蜜中共檢測出100 種揮發性成分，其中3-甲基丁酸為蕎麥蜜主要揮發性成分。Panseri等[13]研究了意大利阿爾卑斯地區的蕎麥蜜中揮發性成分和花粉來源的關系。Plutowska等[14]發現波蘭蕎麥蜜中特征揮發性成分為2-甲基丁醛和3-甲基丁醛。由于儀器條件和樣品量的限制，對蕎麥蜜揮發性成分缺乏全面的測定與分析，所以，建立有效的方法對蕎麥蜜揮發性成分進行系統的分析顯得很有必要。

目前，應用較廣泛的揮發性成分提取方法主要有SPME法[15-17]、超聲波輔助萃取法[18-19]、同時蒸餾萃取法[20]、固相萃取法[21]和溶劑萃取法[22]等。SPME作為一項新型的萃取方法，以其檢測時間短、不引入萃取溶劑污染樣品、高靈敏度等優勢被廣泛應用于蜂蜜揮發性成分的分析測定。

本實驗利用HS-SPME-GC-MS法對中國產區的14 批蕎麥蜜的揮發性成分進行測定，系統分析揮發性成分的組成種類和含量，比較分析不同成熟度蕎麥蜜揮發性成分的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 蜂蜜樣品

實驗所用蕎麥蜜樣品均于2017—2018年采自內蒙古地區。樣品采集后在檢測前置于－20 ℃條件下保存。詳細信息見表1。

表1 蕎麥蜜樣品采集信息Table 1 Information about the collected buckwheat honey samples

1.1.2 試劑

乙醇、2-甲基丁醇標準品 美國Sigma-Aldrich公司；實驗用水為超純水。

1.2 儀器與設備

50/30 μm二乙烯基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取纖維 美國Sigma-Aldrich公司；20 mL頂空瓶（配制硅膠/聚四氟乙烯隔墊和20 mm鐵蓋） 德國Gerstel公司；壓蓋器和啟蓋器 美國CNW公司；7890B-5977B型GC-MS聯用儀（配制分流/不分流進樣口和SPME專用襯管）、DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm） 美國Agilent公司；MPS多功能樣品前處理平臺（配制自動化HS-SPME手柄）德國Gerstel公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品處理

準確稱取（2.0±0.1）g蜂蜜樣品于20 mL頂空瓶中，密封后置于樣品前處理平臺上進行SPME。

1.3.2 SPME條件

萃取纖維選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS，實驗前在270 ℃條件下老化30 min，萃取溫度60 ℃，萃取時間45 min，平衡時間10 min，振蕩速率250 r/min，進樣口解吸時間5 min。

1.3.3 GC-MS條件

GC條件：進樣口溫度270 ℃，不分流進樣；載氣為高純氦，流量1.0 mL/min；升溫程序為初始溫度40 ℃保持3 min，以3 ℃/min升溫至160 ℃，然后以10 ℃/min升溫至270 ℃，保持6 min，總運行時間為60 min。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度270 ℃；數據采集方式：全掃描模式，質量掃描范圍m/z25～450。選擇離子模式，乙醇定量離子m/z31，定性離子m/z45、29、46，其豐度比為100∶51∶30∶22，2-甲基丁醇的定量離子為m/z57，定性離子為m/z41、56、70，其豐度比為100∶88∶88∶42。

1.3.4 定性方法

本研究主要采用如下2 種方法對目標化合物進行定性：

NIST庫檢索：判定目標化合物時，將目標色譜峰對應的質譜圖扣除背景空白后，進行NIST 14譜庫檢索，正相和反相匹配度均在800以上，且相似度得分值最高的化合物，即認定為目標物，因色譜柱固定相流失帶來的硅氧烷類化合物，不計在內。

保留指數定性：保留指數主要表示待測的目標物質在固定相上的保留行為，它與固定相的性質有關[23]。雖然GC-MS聯用技術結合了色譜的分離能力強和質譜的鑒別能力高的特點，提高了化合物定性的高效性和準確性，但由于部分化合物具有同分異構體或結構極為相似，其質譜圖差異不大，僅通過NIST譜庫檢索經常會出現因化合物得分相似而導致定性結果出現偏差。在這種情況下，利用保留指數可提高判斷的準確性。

1.3.5 定量方法

采用面積歸一化法對蜂蜜中揮發性成分的相對含量進行測定，對GC-MS總離子流色譜圖中目標峰進行積分和計算峰面積，每個目標峰的面積與總峰面積之比，即為該目標物的相對含量。未準確定性的化合物標記為未知峰，柱流失帶來的色譜峰不計在目標峰內。采用基質標準曲線法對特征化合物乙醇和2-甲基丁醇進行絕對定量。

2 結果與分析

2.1 GC-MS條件優化

2.1.1 色譜柱的選擇

圖1 VF-624和DB-5MS色譜柱對總峰面積和總峰數量的影響Fig. 1 Effect of chromatographic columns VF-624 and DB-5MS on peak area and number

色譜柱的選擇直接影響檢測到目標物的種類和數量，也會對目標物的檢出限產生影響[24]。本研究對揮發性成分檢測常用的DB-5MS（30 m×0.25 mm，0.25 μm）和VF-624（60 m×0.25 mm，1.4 μm）色譜柱進行對比分析。如圖1所示，DB-5MS色譜柱相對于VF-624色譜柱，在檢測目標物的響應以及目標峰的數量上，均具有明顯優勢，因而實驗選擇DB-5MS色譜柱用于蕎麥蜜中揮發性成分分離測定。

2.1.2 升溫程序的選擇

在GC-MS檢測過程中，影響目標物分離效果和峰形的因素不僅包括進樣口溫度、檢測器溫度和柱溫[24]，升溫程序也直接影響著目標物色譜峰的保留時間和分離效果[25]?？疾焐郎爻绦?（初始溫度50 ℃，保持1 min，然后以5 ℃/min速率升至200 ℃，然后以10 ℃/min速率升至270 ℃，保持7 min）和升溫程序2（初始溫度40 ℃，保持3 min，然后以3 ℃/min速率升至160 ℃，然后以10 ℃/min速率升至270 ℃，保持6 min）對揮發性成分測定的影響，結果如圖2所示。不同升溫程序對揮發性成分的總峰面積影響不大。由于分析時間越長，化合物色譜峰分離度越好，所以升溫程序2的總峰數量較高。綜上考慮，在后續的實驗中，選擇升溫程序2。

圖2 升溫程序對總峰面積和總峰數量的影響Fig. 2 Effect of rising temperature programs on peak area and number

2.2 SPME參數的優化

2.2.1 萃取纖維的選擇

圖3 萃取纖維對總峰面積和總峰數量的影響Fig. 3 Effect of extraction fiber coatings on peak area and number

SPME的萃取頭涂有極性不同的固定相或吸附劑，用極性相匹配的涂層可減少萃取雜質的干擾、提高萃取選擇性等[26]。萃取纖維的選擇直接決定了萃取目標物的種類和數量?？疾斐Ｓ玫?0/30 μm DVB/CAR/PDMS、85 μm CAR/PDMS、100 μm PDMS和65 μm PDMS/DVB 4 種不同涂層的萃取頭對蕎麥蜜揮發性成分萃取效果的影響，如圖3所示。DVB/CAR/PDMS和PDMS/DVB纖維對蜂蜜揮發性成分萃取的種類和數量要明顯多于另外2 種纖維，與Ceballos[27]和Pérez[28]等報道一致。由于DVB/CAR/PDMS較PDMS/DVB纖維吸附揮發性成分的極性范圍更廣，在蜂蜜中揮發性成分的研究中應用更為廣泛，因而本研究選用50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取纖維。

2.2.2 萃取溫度的選擇

HS-SPME體系為氣、液、固三相體系[27]，適當升高萃取溫度，可以加快分子運動，縮短分析物組分在三相間達到分配平衡的時間，提高萃取效率，從而提高分析效率和靈敏度[8]。然而當溫度升的過高，也會使一些揮發性成分從吸附涂層上脫附，影響SPME的萃取效果，此外，溫度過高會使蜂蜜中部分物質成分發生轉化，例如，超過70 ℃羥甲基糠醛含量會升高[29]，所以選擇合適的萃取溫度至關重要。考察萃取溫度30、40、50、60、70 ℃條件下樣品中揮發性成分的萃取效果。如圖4所示，在萃取溫度不超過60 ℃條件下，隨著萃取溫度的升高，揮發性成分色譜峰的總面積和總數量逐漸增多，萃取60 ℃和70 ℃條件下目標峰數量變化不大，但峰響應值降低。結合溫度過高會使蜂蜜中部分揮發性成分發生變化的情況，實驗選擇萃取溫度60 ℃。

圖4 萃取溫度對總峰面積和總峰數量的影響Fig. 4 Effect of extraction temperature on peak area and number

2.2.3 萃取時間的選擇

圖5 萃取時間對總峰面積和總峰數量的影響Fig. 5 Effect of extraction time on peak area and number

萃取時間一般指檢測分析物在樣品和涂層之間達到分配平衡所需要的時間[30]。在蜂蜜揮發性成分萃取過程中，萃取時間與蜂蜜樣品基質、樣品體積、不同萃取頭性質等因素協同作用而達到萃取平衡[8]?？疾燧腿r間分別為15、30、45、60、75 min條件下樣品中揮發性成分的萃取效果，見圖5。在萃取時間不超過45 min條件下，隨萃取時間的延長，大部分揮發性成分的色譜峰總面積和總數量逐漸增多，但當萃取時間再延長至60 min或75 min時，目標物響應值變化不大，但目標峰數量略有減少，主要是因為在達到吸附平衡后，萃取纖維頭上的某些揮發性成分發生解吸造成[8,31]。所以選取萃取時間45 min。

2.3 蕎麥蜜中揮發性成分分析

利用HS-SPME-GC-MS聯用技術測定蕎麥蜜中的揮發性成分，如圖6所示。由表2所示，所有蕎麥蜜樣品共檢測出168 種揮發性成分，其中所有樣品的共有物質120 種，主要包括醇類、芳香族類、醛類、酸類、萜烯類、酮類、烷烴類、酯類等，另外有20 個目標峰未鑒定出具體化合物種類（標記為未知峰）。這些物質共同構成了蕎麥蜜獨特的揮發性成分體系，同時賦予蕎麥蜜獨特的風味。

圖6 蕎麥蜜揮發性成分總離子流圖Fig. 6 Total ion current chromatograms of volatile components in buckwheat honey

在蜂蜜采收過程中，封蓋的成熟蜜僅需經過簡單的加熱過濾工序即可保存銷售，極大程度上防止了營養成分和風味物質的損失[32-33]，但水分含量較高的未成熟蜂蜜則需要脫水濃縮加工才能長期保存。一般蜂蜜的成熟度可按波美度的大小衡量。本研究采集在35～42 °Bé的蕎麥蜜共14 個樣品，對揮發性成分進行比較分析。由圖7可以看出，不同成熟度蕎麥蜜揮發性成分存在顯著差異，推測與波美度存在一定的關系，因而后續分析中將樣品分為2 組：即A組（40 °Bé以下，代表成熟度較差的蕎麥蜜樣品）和B組（40 °Bé以上，代表成熟度較好的蕎麥蜜樣品），分別包含7 個樣品。

圖7 蕎麥蜜蜂蜜樣品中揮發性成分種類Fig. 7 Relative contents of various classes of volatile components in buckwheat honey samples

A組共測定出149 種物質，主要包括酯類、醇類、醛類和酸類等。其中，相對含量較高的物質為醇類、酯類，二者占總含量的74.35%，其中酯類化合物種類最多，為41 種，相對含量占比為39.76%，醇類物質共16 種，相對含量僅次于酯類物質，占總含量的34.59%，酯類和醇類是構成A組蕎麥蜜風味的主要物質。在A組蕎麥蜜中，相對含量最高的酯類物質為醋酸苯乙酯和3-甲基丁酸乙酯，分別占總含量的16.88%和6.91%，相對含量最高的醇類物質為乙醇，占總含量的19.16%，這3 種物質是A組蕎麥蜜的主要揮發性成分。

表2 蕎麥蜜中揮發性成分的相對含量Table 2 Relative abundances of volatile compounds in buckwheat honeys

續表2 %

續表2 %

B組共檢測出139 種揮發性成分，主要包括醛類、酸類、酮類、醇類和芳香類等物質。其中，醛類和酸類物質含量較高，占總含量的62.36%。其中醛類物質含量占比最高，為42.50%，該結果與Vilma等[34]發現的醛類是蜂蜜風味的主要來源物質一致。酸類物質在B組蕎麥蜜中的含量和種類也較多，為19.86%，共15 種。其中含量最高的醛類物質為糠醛，占總含量的24.13%，酸類物質最高的為2-甲基丁酸，占總含量的7.90%。

對蕎麥蜜樣品揮發性成分進行整體分析，發現2-甲基丁酸在所有蕎麥蜜中存在且含量較高，與Panseri等[13]的報道一致，推測2-甲基丁酸是蕎麥蜜的特征揮發性成分。Zhou Qiaoxuan等[35]研究發現，英國和美國蕎麥蜜中主要揮發性成分為3-甲基丁醛、2,3-丁二酮、苯乙醛、香草醛、甲酚和香豆素等，本研究發現，苯乙醛在所有樣品中有檢出，3-甲基丁醛在大部分樣品中均有檢出，但2,3-丁二酮、香豆素和香草醛等在樣品中未被檢出，推測可能是由于地域不同所致。該結果表明，蕎麥蜜揮發性的測定可以作為其產地區分鑒別的一種技術手段。

2.4 不同成熟度蕎麥蜜的揮發性成分對比分析

圖8 不同成熟度的蕎麥蜜中差異揮發性成分Fig. 8 Differences in volatile compounds of buckwheat honeys with different maturity levels

通過對蕎麥蜜中揮發性成分進行對比分析，發現不同成熟度蕎麥蜜中存在顯著差異的物質，其中差異較大的代表性物質含量對比結果見圖8。結果表明，2-甲基-1-丙醇只在A組樣品中被檢測出，而乙醇、醋酸苯乙酯、壬醇、丙酸乙酯、2-甲基丁醇在A組蕎麥蜜中相對含量較高，分別為B組蕎麥蜜的4.8、31、5.8、8.8、5.1 倍，推測是由于成熟度低的蕎麥蜜中酵母菌的存在，蜂蜜中的碳水化合物發酵致使酯類和醇類物質含量升高[9]。

圖9 乙醇（A）和2-甲基丁醇（B）與波美度相關性Fig. 9 Correlations of Baume degree with ethanol (A) and 2-methyl-1-butanol (B)

進一步分析代表性差異成分含量與波美度的相關性，結果如圖9所示。發現乙醇和2-甲基丁醇的含量與波美度之間存在一定的負相關。隨著波美度的增加，乙醇和2-甲基丁醇的含量整體呈遞減的趨勢，其相關系數（R2）分別達到0.90和0.87。據此說明，乙醇和2-甲基丁醇可以作為指示蕎麥蜜成熟度的標志物，其含量越高，則說明蕎麥蜜成熟度越差。進一步對乙醇和2-甲基丁醇的含量進行絕對定量，如表3所示。測定結果和相對含量的趨勢一致，隨著波美度的下降，乙醇和2-甲基丁醇的含量呈現整體增加的趨勢，該結果表明，通過對蕎麥蜜揮發性成分的測定，了解其特征物質含量，可以為蜂蜜的品質評價提供一定的借鑒參考。

表3 蕎麥蜜中乙醇和2-甲基丁醇含量Table 3 Contents of ethanol and 1-butanol, -2-methyl in buckwheat honeys at different maturity levels

3 結 論

本研究建立HS-SPME-GC-MS法測定蜂蜜中的揮發性成分，并應用該技術對中國產區14 批不同成熟度的蕎麥蜜揮發性成分進行測定。所有樣品中共檢測出168 種物質，通過對比分析，發現不同成熟度的蕎麥蜜揮發性成分存在明顯差異。低成熟度蕎麥蜜的主要揮發性成分為酯類和醇類，而構成高成熟度蕎麥蜜揮發性體系的主要物質為醛類和酸類。研究發現2-甲基丙醇只在低成熟度蕎麥蜜中出現，乙醇、醋酸苯乙酯、壬醇、丙酸乙酯、2-甲基丁醇在低成熟度蕎麥蜜中含量明顯高于高成熟度蕎麥蜜，而且乙醇和2-甲基丁醇的含量與波美度之間存明顯的負相關性。結果表明，通過對蕎麥蜜揮發性成分的測定，可以為蜂蜜的品質評價提供一定的借鑒參考。